专利名称：低免疫原性链霉抗生物素蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫原性降低的链霉抗生物素蛋白突变体及其应用。更具体地说，本发明涉及通过向氨基酸导入突变来降低免疫原性的链霉抗生物素蛋白突变体及其应用。
背景技术：
抗生物素蛋白与生物素、或链霉抗生物素蛋白与生物素之间的亲和性非常高 (Kd=10 —15 10 —14M),作为生物体二分子之间的相互作用，其为最强的相互作用之一。现在，抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用广泛应用于生物化学、分子生物学、或医学领域中(Green, (1975), Adv. Protein Chem. , 29: 85-133; Green, (1990), Methods Enzymo 1. , 184: 51-67)。抗生物素蛋白为来源于卵白的碱性糖蛋白，等电点超过10。另一方面，链霉抗生物素蛋白来源于放线菌(阿维丁氏链霉菌(Sti^ptomyces avidinii))，等电点在中性附近，不含有糖链。这两种蛋白质都形成4聚物，每1个亚基与 1分子的生物素结合。分子量为60kDa左右。近年，提出了该抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白与生物素的高结合能力和抗体分子组合而成的药物输送方法预定位(Pretargeting)法(Hnatowich，(1987)，J. Nuc 1. Med., 28，1294-1302)。但是，由于来源于鸡的抗生物素蛋白、来源于微生物的链霉抗生物素蛋白对于人体表现出高的免疫原性，在给予人体后，早期产生抗抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白抗体成为问题，成为阻碍预定位法的实用化的原因之一(Paganelli，(1991)， Cancer Res.，51，5960-5966)。为了解决上述问题，过去发表了对于链霉抗生物素蛋白的低免疫原性化进行叙述的论文(Subramanian, (1998)，Bioch. and Mol. biol. Int. , 43，；357_82)，但链霉抗生物素蛋白对于人体的免疫原性的问题仍然未解决。现有技术文献专利文献
专利文献1 美国专利第5，672，691号。专利文献2 美国专利第6，022，951号。非专利文献
非专利文献 1 :Green, (1975)，Adv. Protein Chem. , 29: 85-133; 非专利文献 2 :Green, (1990)，Methods Enzymol. , 184: 51-67; 非专利文献 3 :Hnatowich, (1987)，J. Nuc 1. Med.，28，1294-1302 ； 非专利文献 4 :Paganelli, (1991)， Cancer Res. , 51，5960-5966)。__ 专禾1J 文献 5 :Mapping the common antigenic determinants in avidin and streptavidin. Subramanian, N 等人，Biochemistry and Molecular biology International. 1997， 43， 357—82。__ 专禾Il 文献 6 :Reduced antibody response to streptavidin through site-directed mutagenesis Meyer, DL 等人，Protein Science. 2001, 10,491-503。7 :Biotin Reagents for Antibody Pretargeting. 4. Wilbur DS 等人，Bioconjugate Chemistry. 2000，11(4), 569—583。
发明内容
本发明要解决的课题在于，提供作为来源于属于微生物的阿维丁氏链霉菌的蛋白质的链霉抗生物素蛋白所具有的对于哺乳动物的免疫原性(抗原性)得到降低，动物体内的抗链霉抗生物素蛋白抗体产生得到抑制，且维持对于生物素的结合能力的可以用于药物及其它的工业中的各种目的的链霉抗生物素蛋白突变体(低免疫原性链霉抗生物素蛋白)。进一步地，本发明要解决的课题在于，提供使用上述链霉抗生物素蛋白突变体的诊断药物、治疗药物，使用上述链霉抗生物素蛋白突变体的诊断试剂盒、治疗试剂盒。本发明人为了解决上述问题而精心研究，由链霉抗生物素蛋白的立体结构和五肽出现频率分析，选择在人体内形成抗原位点的氨基酸，选出形成低免疫原性化的低免疫原性化候选氨基酸。接着，在以野生型链霉抗生物素蛋白作为模板的基因序列中形成点突变， 向低免疫原性化候选氨基酸转换，实施蛋白质表达并实施蛋白纯化。进一步地，对于这些突变体链霉抗生物素蛋白，使用野生型链霉抗生物素蛋白对食蟹猴进行免疫，使用实施了制备的抗链霉抗生物素蛋白抗血清对反应性进行分析后，鉴定出发现与野生型链霉抗生物素蛋白相比抗血清的反应性降低约40%以上的突变体链霉抗生物素蛋白，从而完成本发明。即，根据本发明，提供以下的发明。[1]链霉抗生物素蛋白突变体，其含有如下形成的氨基酸序列，在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中(a)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸残基的酪氨酸、第71位氨基酸残基的酪氨酸、第89位氨基酸残基的谷氨酸、第91位氨基酸残基的精氨酸、和第104位氨基酸残基的谷氨酸中的任一个以上置换为其它的氨基酸，与野生型链霉抗生物素蛋白相比，该突变体的免疫原性降低。[2] [1]记载的链霉抗生物素蛋白突变体，其含有如下形成的氨基酸序列，在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中(a)第71位氨基酸残基的酪氨酸和第72位氨基酸残基的精氨酸置换为其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸残基的酪氨酸、 第89位氨基酸残基的谷氨酸、第91位氨基酸残基的精氨酸、第104位氨基酸残基的谷氨酸中的任一个置换为其它的氨基酸。[3] [1]或[2]记载的链霉抗生物素蛋白突变体，其在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下任意一个以上的突变
(1)第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸或苏氨酸的突变，
(2)第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸的突变，
(3)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，
(4)第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为天冬氨酸的突变，
(5)第91位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，
(6)第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为谷氨酰胺或天冬酰胺的突变。[4]链霉抗生物素蛋白突变体，其含有在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下任意一个以上的突变的氨基酸序列，与野生型链霉抗生物素蛋白相比，该突变体的免疫原性降低
(1)第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸或苏氨酸的突变，
(2)第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸的突变，
(3)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，
(4)第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为天冬氨酸的突变，
(5)第91位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，
(6)第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为谷氨酰胺或天冬酰胺的突变。[5]链霉抗生物素蛋白突变体，其含有在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下突变的氨基酸序列，与野生型链霉抗生物素蛋白相比，该突变体的免疫原性降低
(2)第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸的突变，
(3)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，
(4)第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为天冬氨酸的突变，
(6)第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为谷氨酰胺或天冬酰胺的突变。[6] [5]中记载的链霉抗生物素蛋白突变体，其进一步具有以下的突变 (1)第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸或苏氨酸的突变，
(5)第91位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变。[7]链霉抗生物素蛋白突变体，其在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下的全部突变
(1)第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸的突变，
(2)第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸的突变，
(3)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，
(4)第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为天冬氨酸的突变，
(5)第91位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，以及
(6)第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为谷氨酰胺或天冬酰胺的突变。[8] DNA，其编码[1] [7]中的任意一项记载的链霉抗生物素蛋白突变体。[9]用抗体标记的链霉抗生物素蛋白突变体，其通过使抗体与[1] [7]中的任意一项记载的链霉抗生物素蛋白突变体结合而得到。[10]治疗剂或诊断剂，其含有[9]中记载的用抗体标记的链霉抗生物素蛋白突变体。[11]治疗或诊断试剂盒，其含有(a) [9]中记载的用抗体标记的链霉抗生物素蛋白突变体和(b)用对于链霉抗生物素蛋白具有亲和性的生物素或其衍生物标记的诊断用或治疗用物质。本发明的突变体链霉抗生物素蛋白的特征在于，在维持对于生物素的结合能力的同时，对于哺乳动物的免疫原性(抗原性)降低，因此动物体内的抗链霉抗生物素蛋白抗体产生得到抑制。本发明的突变体链霉抗生物素蛋白可以用于药物及其它工业中的各种目的中。
图1表示Biacore分析中的传感图。图2表示对于突变体链霉抗生物素蛋白的抗血清的反应性。图3表示天然型链霉抗生物素蛋白、mcSA040、mcSA072、mcSA314、mcSA414的热变化(thermal shift)测定的结果。图4表示B5209B小鼠scFv_mcSA414 (SA)的表达载体的结构。图5表示B5209B scFv_mcSA414通过Ni2 +亲和柱纯化的结果。图6表示通过尺寸排阻色谱将B5209B scFv-mcSA414最终纯化的结果。图7表示B5209B scFv_mcSA414和R0B01的等温滴定量热测定(ITC)的结果。图8表示B5209B scFV-mcSA414和生物素的等温滴定量热测定(ITC)的结果。图9表示B5209B scFv_mcSA414的差示扫描量热测定(DSC)的结果。
具体实施例方式以下对本发明进行更具体的说明。本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的特征在于，在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中，具有规定的氨基酸的突变，与野生型链霉抗生物素蛋白相比免疫原性降低。野生型(天然)的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列在序列表的序列编号2中示出，编码它的碱基序列在序列表的序列编号1中示出。根据第一方式，本发明的链霉抗生物素蛋白突变体含有如下形成的氨基酸序列， 在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中(a)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸残基的酪氨酸、第71位氨基酸残基的酪氨酸、第89位氨基酸残基的谷氨酸、第91位氨基酸残基的精氨酸、和第104位氨基酸残基的谷氨酸中的任意一个以上置换为其它的氨基酸。根据第二方式，本发明的链霉抗生物素蛋白突变体含有在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下任意一个以上的突变的氨基酸序列
(1)第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸或苏氨酸的突变，
(2)第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸的突变，
(3)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，
(4)第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为天冬氨酸的突变，
(5)第91位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，
(6)第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为谷氨酰胺或天冬酰胺的突变。在第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为其它的氨基酸的情况下，作为其它的氨基酸的具体例，可以举出甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸，特别优选地，可以举出丝氨酸或苏氨酸。在第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为其它的氨基酸的情况下，作为其它的氨基酸的具体例，可以举出甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸，特别优选地，可以举出丙氨酸或丝氨酸。在第72位氨基酸残基的精氨酸置换为其它的氨基酸的情况下，作为其它的氨基酸的具体例，可以举出甘氨酸或赖氨酸，特别优选地，可以举出赖氨酸。在第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为其它的氨基酸的情况下，作为其它的氨基酸的具体例，可以举出甘氨酸、丙氨酸或天冬氨酸，特别优选地，可以举出天冬氨酸。在第91位氨基酸残基的精氨酸置换为其它的氨基酸的情况下，作为其它的氨基酸的具体例，可以举出甘氨酸或赖氨酸，特别优选地，可以举出赖氨酸。在第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为其它的氨基酸的情况下，作为其它的氨基酸的具体例，可以举出丝氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺，特别优选地，可以举出谷氨酰胺或天冬酰胺。本发明中所称的与野生型链霉抗生物素蛋白相比免疫原性降低指的是，在将链霉抗生物素蛋白突变体给予人等哺乳动物的情况下免疫原性降低。例如，可以用以下的方法确认免疫原性降低。即，对于本发明的突变体链霉抗生物素蛋白，使用野生型链霉抗生物素蛋白免疫食蟹猴，分析对于得到的抗链霉抗生物素蛋白抗血清的反应性，若对于上述抗链霉抗生物素蛋白抗血清的反应性与野生型链霉抗生物素蛋白相比降低，则可以判断与野生型链霉抗生物素蛋白相比免疫原性降低。在用上述方法判断免疫原性降低的情况下，与野生型链霉抗生物素蛋白相比，本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的免疫原性优选降低为 80%以下，进一步优选降低为60%以下，进一步优选降低为20%以下，进一步优选降低为15% 以下，进一步优选降低为10%以下，特别优选降低为5%以下。根据本发明，进一步提供编码上述本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的DNA。本发明的DNA可以通过对编码野生型(天然)链霉抗生物素蛋白的DNA进行位点定向诱变来制备。编码上述本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的DNA可以整合到载体中来使用。特别地，为了制备本发明的链霉抗生物素蛋白突变体，将编码本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的DNA整合到表达载体中，将该表达载体转化到宿主中，由此可以表达本发明的链霉抗生物素蛋白突变体。在以大肠杆菌作为宿主的情况下，作为本发明中使用的载体，优选具有复制起点 (ori)，进一步具有用于选择所转化的宿主的基因(例如对于氨苄青霉素、四环素、卡那霉素或氯霉素等药物的耐药性基因等)。此外，在表达载体的情况下，优选具有可以在宿主中有效地表达本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的启动子，例如IacZ启动子或T7启动子等。 作为这种载体，作为载体的例子，可以举出M13系载体、pUC系载体、pBR322、pBluescript、 pCR-Script, pGEX-5X-l ( 7 τ -y r )、“QIAexpress 系统”(今了欠 > )、pEGFP、或 PET(此时，宿主优选使用表达T7 RNA聚合酶的BL21)等。此外，在载体中也可以附加用于提高本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的产量的信号序列等。载体向宿主细胞的导入例如可以使用氯化钙法、电穿孔法来进行。此外，可以附加编码用于提高可溶性的标签，例如谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白质的序列。此外，也可以附加编码以容易纯化作为目的而设计的标签，例如多组氨酸标签、Myc表位、血凝素(HA)表位、T7表位、Xpress标签、FLAG肽标签、其它公知的标签序列的序列。除了大肠杆菌之外，可以举出来源于哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3( 4 > ^ 卜口 Y > 社制)、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17)，p5322)、pEF、pCDM8)、来源于昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(￥ 二 BRL社制)、 pBacPAK8)、来源于植物的表达载体(例如ρΜΗ1、ρΜΗ2)、来源于动物病毒的表达载体(例如 pHSV、pMV、pAdexLcw)、来源于逆转录病毒的表达载体(例如pZIPneo)、来源于酵母的表达载体(例如“毕赤酵母表达试剂盒(Pichia Expression Kit)”( 4 > '卜口 y >社制)、 pNVll、SP-QO1)、来源于枯草菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)。在以CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中的表达为目的的情况下，具有用于细胞内表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等人，Nature (1979) 277， 108)、MMLV-LTR启动子、EFl α 启动子(Mizushima等人，Nucleic Acids Res. (1990) 18， 5322)、CMV启动子等是不可欠缺的，若具有用于选择向细胞的转化的基因(例如通过药物 (新霉素、G418等)可以判别的耐药性基因)则进一步优选。作为具有这种特性的载体，可以举出例如 pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK_CMV、pOPRSV、p0P13 等。对导入了载体的宿主细胞不作特别限定，其可以为原核生物和真核生物中的任意一种。例如可以使用大肠杆菌、各种动物细胞等。在使用真核细胞的情况下，宿主例如可以使用动物细胞、植物细胞、真菌细胞。作为动物细胞，可以使用诸如CHO细胞、COS细胞、3T3细胞、HeLa细胞、Vero细胞的哺乳类细胞，或诸如Sf9、Sf21、Tn5等昆虫细胞。在动物细胞中，在以大量表达为目的的情况下，特别优选CHO细胞。载体向宿主细胞的导入例如可以通过磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、使用阳离子脂质体DOTAP(《一 U〉为一 >〃< A社制)的方法、电穿孔法、脂转染法等方法来进行。作为植物细胞，例如来源于烟草(Nicotiana tabacum)的细胞作为蛋白质生产系统是已知的，可以将其进行愈伤组织培养。作为真菌细胞，酵母、例如酵母属 (Saccharomyces)、例如酸酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),丝状菌、例如曲霄属 (Aspergillus)、例如黑曲霉(Aspergillus Niger)是已知的。在使用原核细胞的情况下，可以举出大肠杆菌(E. coli)，例如JM109、DH5a、 HBlOl等，此外枯草杆菌是已知的。通过本发明的DNA转化这些细胞，将所转化的细胞在体外培养，由此得到本发明的链霉抗生物素蛋白突变体。培养可以根据公知的方法进行。例如作为动物细胞的培养液，例如可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此时，也可以并用胎牛血清(FCS)等血清补充液，也可以进行无血清培养。培养时的PH优选约为6 8。培养通常在约30 40°C下进行约15 200小时，根据需要附加培养基的更换、通气、搅拌。此外，可以添加用于促进细胞的增殖的生长因子。进一步地，根据本发明，提供通过将抗体结合于本发明的链霉抗生物素蛋白突变体而得到的链霉抗生物素蛋白突变体-抗体结合物、以及含有链霉抗生物素蛋白突变体-抗体结合物的治疗剂或诊断剂。进一步地，可以将上述链霉抗生物素蛋白突变体-抗体结合物与用对于链霉抗生物素蛋白具有亲和性的生物素或其衍生物标记的诊断用或治疗用物质组合，提供为治疗或诊断试剂盒。S卩，本发明中，制备癌抗原特异性抗体分子与本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的融合体，给予患者，由此可以对于癌细胞特异性地聚集本发明的链霉抗生物素蛋白突变体。接着，将与对于链霉抗生物素蛋白具有亲和性的生物素或其衍生物结合的诊断用或治疗用物质(放射性同位素、低分子化合物、蛋白质等)给予患者，由此可以准确地使物质向癌细胞聚集。本发明中，通过低免疫原性化，抗体产生得到抑制，可以防止由于抗体所导致的早期从体内清除、过敏反应等休克。
与链霉抗生物素蛋白突变体结合的抗体可以使用各种分子。可以使用多克隆抗体、单克隆抗体中的任意一种。对抗体的亚型不特别限定，优选使用IgG，特别适合使用 IgG10此外，“抗体”含有全部的改变抗体和抗体片段。可以举出人化抗体、人型抗体、人抗体，来源于小鼠、兔、大鼠、豚鼠、猴等各种动物的抗体，人抗体与来源于各种动物的抗体的嵌合抗体，双抗体、scFv、Fd、Fab、Fab，、F (ab)，2，但是不限于此。链霉抗生物素蛋白突变体与抗体的结合物可以使用本领域技术人员公知的方法得到。例如，可以通过化学结合方法(US5，608，060)得到，也可以通过将编码链霉抗生物素蛋白突变体的DNA与编码抗体的DNA连接、使用表达载体等在宿主细胞表达而作为融合蛋白得到。编码链霉抗生物素蛋白突变体的DNA与编码抗体的DNA的连接可以通过编码称为接头的适当的肽的DNA进行。期望的是，保留抗体与靶分子的特异结合力来制备链霉抗生物素蛋白突变体-抗体结合物。通过以下的实施例对本发明进行具体的说明，但是本发明不被实施例所限定。 实施例棚列1 低车·十
基于序列编号1和2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的基因序列和氨基酸序列，对具有满足以下条件的突变的突变体链霉抗生物素蛋白的序列进行研究，设计了具有表1中记载的突变的突变体链霉抗生物素蛋白。(1)预测与抗体的融合蛋白在人体内免疫原性尽可能减小的序列， (2)尽可能维持对于生物素分子的高亲和力的序列。[表 1]
表1 突变一览表
权利要求
1.链霉抗生物素蛋白突变体，其含有如下形成的氨基酸序列，在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中(a)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸残基的酪氨酸、第71位氨基酸残基的酪氨酸、第89位氨基酸残基的谷氨酸、第91位氨基酸残基的精氨酸、和第104位氨基酸残基的谷氨酸中的任一个以上置换为其它的氨基酸，与野生型链霉抗生物素蛋白相比，该突变体的免疫原性降低。
2.权利要求1所述的链霉抗生物素蛋白突变体，其含有如下形成的氨基酸序列，在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中(a)第71位氨基酸残基的酪氨酸和第72位氨基酸残基的精氨酸置换为其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸残基的酪氨酸、第89位氨基酸残基的谷氨酸、第91位氨基酸残基的精氨酸、第104位氨基酸残基的谷氨酸中的任一个以上置换为其它的氨基酸。
3.权利要求1或2所述的链霉抗生物素蛋白突变体，其在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下任意一个以上的突变(1)第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸或苏氨酸的突变，(2)第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸的突变，(3)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，(4)第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为天冬氨酸的突变，(5)第91位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，(6)第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为谷氨酰胺或天冬酰胺的突变。
4.链霉抗生物素蛋白突变体，其含有在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下任意一个以上的突变的氨基酸序列，与野生型链霉抗生物素蛋白相比，该突变体的免疫原性降低(1)第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸或苏氨酸的突变，(2)第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸的突变，(3)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，(4)第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为天冬氨酸的突变，(5)第91位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，(6)第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为谷氨酰胺或天冬酰胺的突变。
5.链霉抗生物素蛋白突变体，其含有在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下突变的氨基酸序列，与野生型链霉抗生物素蛋白相比，该突变体的免疫原性降低(2)第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸的突变，(3)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，(4)第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为天冬氨酸的突变，(6)第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为谷氨酰胺或天冬酰胺的突变。
6.权利要求5所述的链霉抗生物素蛋白突变体，其进一步具有以下的突变(1)第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸或苏氨酸的突变，(5)第91位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变。
7.链霉抗生物素蛋白突变体，其在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下的全部突变(1)第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸的突变，(2)第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸的突变，(3)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，(4)第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为天冬氨酸的突变，(5)第91位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，以及(6)第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为谷氨酰胺或天冬酰胺的突变。
8.DNA，其编码权利要求1至7中的任意一项所述的链霉抗生物素蛋白突变体。
9.链霉抗生物素蛋白突变体-抗体结合物，其通过使抗体与权利要求1至7中的任意一项所述的链霉抗生物素蛋白突变体结合而得到。
10.治疗剂或诊断剂，其含有权利要求9所述的链霉抗生物素蛋白突变体-抗体结合物。
11.治疗或诊断试剂盒，其含有(a)权利要求9所述的链霉抗生物素蛋白突变体-抗体结合物；和(b)用对于链霉抗生物素蛋白具有亲和性的生物素或其衍生物标记的诊断用或治疗用物质。
全文摘要
本发明的课题在于，提供降低链霉抗生物素蛋白所具有的对于哺乳动物的免疫原性(抗原性)的链霉抗生物素蛋白突变体。根据本发明，提供了链霉抗生物素蛋白突变体，其含有如下形成的氨基酸序列，在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中(a)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸残基的酪氨酸、第71位氨基酸残基的酪氨酸、第89位氨基酸残基的谷氨酸、第91位氨基酸残基的精氨酸和第104位氨基酸残基的谷氨酸中的任意一个以上置换为其它的氨基酸，与野生型链霉抗生物素蛋白相比，该突变体的免疫原性降低。
文档编号A61K38/00GK102325884SQ20108000828
公开日2012年1月18日 申请日期2010年2月19日 优先权日2009年2月20日
发明者儿玉龙彦, 土居洋文, 杉山晓, 津本浩平, 浜洼隆雄 申请人:国立大学法人东京大学, 株式会社英仙蛋白质科学