一种抗CD6单抗T1h的检测性抗体及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药技术领域，具体地说是涉及抗CD6单抗Tlh的检测性抗体的获得、制备及其检测方法。
【背景技术】
[0002]CD6是I型整合膜糖蛋白，是清道夫受体富含半胱氨酸超家族SRCRSFbcavengerreceptor cysteine-rich superfamily)的成员，胞外区有3个富含半胱氨酸的功能区SRCR(scavenger receptor cysteine-rich)，其近膜结构域(SRCR3)含有结合ALCAM的位点 XD6主要通过T细胞表达，与人白细胞活化粘附因子ALCAM(activated leukocyte celladhes1n molecule，CD166)相互作用;CD6参与T细胞活化，调节T细胞功能和介导细胞一细胞间的粘附<XD6分子可与TCR/CD3形成复合体，参与免疫突触(immunological synapse，IS)的形成；成熟型免疫突触分为中央超级分子活化簇(central supramolecularactivat1n clusters ,03]\^(])和周边超级分子活化族(口61^口116^1 supramolecularactivat1n clusters，P_SMAC)两部分，⑶6分子是中央超级分子活化簇的重要组成成分之一;免疫突触(IS)的形成是T细胞识别抗原、增殖和活化的关键步骤，是机体细胞免疫反应和体液免疫反应的重要组成部分。自身性免疫性疾病的发病机制中，T细胞增殖活化和迀移过程起着重要作用。基于CD6分子在淋巴细胞成熟、活化和增殖中的重要作用，阻断CD6分子的功能可为类风湿性关节炎、银肩病等自身免疫的治疗提供新的治疗手段或方法。
[0003]抗⑶6的人源化单抗Itolizumab(Tlh)于2013年8月印度获批上市用于慢性斑块型银肩病，该单抗结合于CD6的SRCRl功能域，而不阻碍CD6分子与其配体ALCAM(activatedleukocyte cell adhes1n molecule，CD166)的结合;但Tlh与细胞表面CD6分子形成的免疫复合物通过内在化机制进入细胞内，被胞内溶酶体系统消化降解，降低淋巴细胞表面CD6水平，阻碍⑶6分子与TCR/⑶3形成免疫突触(IS)，表现为STAT3，MAPK，AKT信号传导途径磷酸化水平减低，淋巴细胞活化和增殖受抑，显著降低IFN-γ和TNF-α等炎性细胞因子的表达和分泌，从而达到治疗自身免疫性疾病的目的。
[0004]抗体库技术为全人源抗体的筛选提供了良好的技术平台，抗体库技术绕过了以往单抗研制过程中必须的杂交瘤过程，甚至不需要经过免疫过程即可获得各种抗体基因及抗体分子片段。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最广泛的抗体库，噬菌体抗体库通过噬菌体展示技术将不同特异性的抗体或其功能片段(Fab、Fv、ScFv)表达在噬菌体表面，再用抗原进行筛选;噬菌体抗体库根据抗体基因的来源分为免疫库和非免疫库，非免疫库又包括天然库、半合成库和全合成库;噬菌体抗体库的筛选模拟了抗体亲和力成熟的过程，通常将抗原包被在固相介质上，加入待筛选的噬菌体抗体库，通过数轮“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的过程(即淘选)直至筛选到高亲和力、特异性强的抗体。
[0005]经研究发现，欧洲专利EP2119452 Al--Pharmaceutical composit1n ,comprising an anti_CD6 monoclonal antibody used in the diagnosis andtreatment of rheumatoid arthritis ;加拿大专利CA 2716919 C--An anti_CD6monoclonal antibody and use thereof;美国专利US 8993524 B2—Composit1ns andmethods for targeted immunomodulatory antibodies and fus1n proteins、美国专利US 8435521 B2—Pharmaceutical composit1ns capable of inducing apoptosis intumour cells,useful for diagnosis and treatment of B—chronic lymphocyticleukaemia;中国专利CN 102559636 B—用于白血病和自身免疫疾病的抗体融合蛋白及其制备方法、中国专利CN 104673754 A—重组骨髓瘤细胞克隆的筛选方法及由此获得的抗体分子;上述专利只公开了抗CD6抗体Tlh的获得和可能应用，而没有抗Tlh的特异性抗体，也没有Tlh抗体的检测方案。这对Tlh临床试验的药理、药代分析带来了不便；同时也没有Tlh的中和抗体，一旦Tlh被误用，缺乏其中和抗体。综上，现有技术中没有解决该技术问题的技术方案。
【发明内容】
[0006]本发明通过全合成噬菌体抗体库的筛选技术，获得了一种新的抗Tlh的特异性单克隆抗体，该抗体可以特异性结合Tlh而用于Tlh的检测或中和，解决了 Tlh抗体浓度检测的技术问题;本发明能够很灵敏快速地检测Tlh的血药浓度，为Tlh临床试验药理、药代分析提供了可靠的研究方法，可用于临床试验中血清及其他体液中Tlh的检测；同时也可以用于中和T Ih抗体。
[0007]本发明为了解决上述技术问题，所包含的技术方案如下:
[0008]一种抗⑶6单抗Tlh的检测性抗体，包括:所述抗体重链可变区包含如SEQ.1所示的氨基酸序列，所述抗体轻链可变区包含如SEQ.2所示的氨基酸序列。
[0009]其中，本发明还提供了一种包含上述轻链可变区或上述重链可变区的抗体、多肽或蛋白。
[0010]其中，本发明还提供了一种包含上述轻链或上述重链的多核苷酸序列。
[0011]其中，本发明还提供了一种包含上述多核苷酸序列或组合的重组DNA表达载体;所述载体的DNA序列中包含编码抗Tlh抗体的所述重链可变区或所述轻链可变区的氨基酸序列，以及如SEQ.3所示的重链恒定区或如SEQ.4所示的轻链恒定区的氨基酸序列。
[0012]其中，所述重链恒定区选自人的化61、1862、1863、1864或鼠的1861、1862&、186213;所述轻链恒定区选自人或鼠的α;优选地，所述重链恒定区为人的IgG4，所述轻链恒定区为人的CA。
[0013]其中，本发明还提供了一种转染上述重组DNA表达载体的宿主细胞，所述细胞包含哺乳动物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌及酵母，优选哺乳动物细胞;优选地，所述哺乳动物细胞包含HEK293E细胞、CHO细胞或NSO细胞。
[0014]其中，所述抗Tlh的单克隆抗体包含全长抗体或抗Tlh单克隆抗体的片段，所述片段包含但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或ScFv。
[0015]其中，本发明中所述抗体用于临床试验中血液及其他体液中Tlh的浓度检测，以及中和Tlh等其他用途。
[0016]其中，所述ScFv为单链抗体(single-chainfragment variable);所述HEK293E细胞为人胚肾293E细胞(human embryonic kidney 293E cell) ;CH0细胞为中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell) ;NS0细胞为小鼠胸腺瘤细胞。
[0017]一种抗⑶6单抗Tlh的检测性抗体的获得方法，包括:
[0018]步骤一、抗Tlh的单链抗体的生物淘选
[0019]采用基因克隆的方法对载体pCOm3载体进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达，改造后的载体命名为PScFvDisb-s，并以此载体为基础，构建全合成噬菌体抗体库；
[0020]以Tlh为抗原包被免疫管，分别封闭免疫管和全合成噬菌体抗体库，封闭后的噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，洗去未结合的噬菌体，中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至PH7.0附近；
[0021]将上述中和后的噬菌体感染生长至对数期的TGl菌液，培养箱中静置，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量;剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备；
[0022]将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YT