一种制备胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种制备胰岛素样生长因子结合蛋白3单克 隆抗体的方法。
【背景技术】
[0002] 身材矮小（short stat ure)是指在相似环境下，儿童身高低于同种族个体正常身 高2个标准差以上，或者低于正常儿童生长曲线第三百分位。在众多因素中，内分泌的生长 激素(GH)对身高的影响起着十分重要的作用。患儿因 GH缺乏所导致的矮小，称为生长激素 缺之症，又称为垂体性株儒症。
[0003] IGF-I是一种具有广泛作用的生长激素依赖性细胞因子，对成骨细胞有促进有丝 分裂的作用，还可刺激成骨细胞的AKP活性促进骨钙素的合成，对成骨细胞其它分化功能亦 有影响。IGF-I在一些患侏儒症、生长激素缺乏症、矮小症等的儿童中，比正常对照组儿童会 明显减少。胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)是血液中IGF-I的主要载体，它结合了血 清中大部分游离的IGF-I，当IGFBP-3与IGF-I结合后，可以减少游离IGF-I的浓度，有利于增 强和发挥IGF-I受体的活性，可以延长IGF-I的半衰期，提高血清中的水平。
[0004] 科学研究发现GH缺乏或不足会影响循环中的IGF-I和IGFBP-3含量；反之，血液 IGF-I和IGFBP-3水平也反映了内源性的生长激素的分泌情况，而且数值稳定，几乎没有昼 夜变化，所以，检测GH、IGF-I和IGFBP-3能较好反映机体GH的分泌情况，对临床早期诊断矮 小症和GH分泌减低患儿有较重要意义。
[0005] 开发IGFBP-3检测试剂，特别是以ELISA法检测IGFBP-3含量，最重要的环节是 IGFBP-3抗体的制备，因此，制备具有更加优秀性能的IGFBP-3抗体是十分必要的。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种制备胰岛素样生长因子结合蛋 白3单克隆抗体的方法，本发明提供方法制备的IGFBP-3的效价较高，与抗原结合的EC50值 更尚。
[0007] 本发明提供的制备胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体的方法，包括：
[0008] 步骤1:以IGFBP-3蛋白对小鼠进行基础免疫和加强免疫，获得免疫小鼠；
[0009] 步骤2:使骨髓瘤细胞与所述免疫小鼠的脾细胞融合后，培养获得杂交瘤细胞；
[0010] 步骤3:杂交瘤细胞经体外培养获得胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体。 [0011] 作为优选，小鼠为6~8周龄的Balb/c雌性小鼠。
[0012]作为优选，基础免疫的方式为皮下多点注射，剂量为50yg/只~IOOyg/只。
[0013]作为优选，基础免疫的免疫的次数为每隔3天免疫一次，共免疫3次。
[0014] 优选的，基础免疫中第一次免疫为对每只小鼠注射50yg~IOOyg IGFBP-3蛋白和 等量弗式完全佐剂的混合物。
[0015] 基础免疫中第二次免疫为对每只小鼠注射50yg~IOOyg IGFBP-3蛋白和等量弗氏 不完全佐剂的混合物。
[0016] 基础免疫中第三次免疫为对每只小鼠注射50yg~IOOyg IGFBP-3蛋白和等量弗氏 不完全佐剂的混合物。
[0017] 作为优选，基础免疫第三次免疫后5~7天，进行加强免疫。
[0018]作为优选，加强免疫的方式为脾内注射，剂量为50yg/只~IOOyg/只。
[0019] 本发明中，加强免疫为对每只小鼠注射50yg~IOOyg的IGFBP-3蛋白。优选的，注射 剂量为IOOyg/只。
[0020] 本发明采用的免疫方式能够更有效的引起小鼠的免疫反应，实验表明，以本发明 的免疫方式，第二次免疫10~15天后，小鼠鼠尾血清效价可达ΚΓ 4。并且，加强免疫能够促进 脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，提高获得杂交瘤的几率。
[0021] 作为优选，加强免疫后8~10天，处死小鼠获得免疫小鼠的脾细胞。
[0022]作为优选，骨髓瘤细胞采用SP2/0细胞。
[0023] 作为优选，步骤2中所述融合的骨髓瘤细胞与所述免疫小鼠的脾细胞的数量比为 (3~5):1〇
[0024] 优选的，骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾细胞的数量比为4:1。
[0025]作为优选，步骤2中所述融合的融合剂为PEG。
[0026]优选的，融合剂中PEG的质量分数为50%。
[0027] 作为优选，步骤2中融合的温度为37°C时间为15~30min。
[0028] 经过15~30min的融合，免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合度达99%。
[0029]作为优选，步骤2中培养采用的培养基为含有10 % (体积分数)胎牛血清的HAT选择 性培养基。
[0030]优选的，步骤2中培养的次数为2~3次。
[0031]作为优选，步骤3中体外培养的培养基为10 % (体积分数)胎牛血清的DMEM/F12培 养基;培养温度为37°C培养时间为24h。
[0032]经过体外培养，单克隆抗体存在于培养的上清液中。
[0033] 作为优选，IGFBP-3蛋白的制备方法为:将包含IGFBP-3基因和TEV基因的表达载体 转染宿主细胞后培养，培养所得融合蛋白经TEV蛋白酶处理，制得IGFBP-3蛋白。
[0034]本发明采用的IGFBP-3基因来自Genbank，登录号为3486，其制备采用人工合成的 方式。TEV基因来自武汉淼灵生物科技有限公司的载体pUC57simple-KF001AG2aFC，采用PCR 的方式扩增获得。
[0035]所述IGFBP-3蛋白的制备方法，包括：
[0036] 步骤1:以重叠 PCR的方式连接IGFBP-3基因和TEV基因，获得IGFBP3-TEV片段；
[0037] 步骤2:分别以Xba I和BamH I酶切IGFBP3-TEV片段和pUC57-simple载体后，将酶 切后的IGFBP3-TEV片段和pUC57-Simple载体连接获得表达载体；
[0038]步骤3:将表达载体转染宿主细胞后培养，培养所得融合蛋白经TEV蛋白酶处理，获 得胰岛素样生长因子结合蛋白3。
[0039]作为优选，培养的培养基为含有体积分数为10 %的FBS的DMEM培养基。
[0040] 作为优选，培养的条件为37°C，C〇2体积分数为5%。
[0041] 作为优选，培养过程中静置培养。
[0042]作为优选，培养的时间为24小时。
[0043]经过转染的293f细胞经培养后，融合蛋白存在于上清液中。融合蛋白经TEV蛋白酶 处理具体为：利用GE公司的protein A预装柱(HiTrap protein A HP)纯化，样品经protein A预装柱后，加入含有5 % (质量分数)TEV蛋白酶的0 . IM，pH3.0的甘氨酸-盐酸洗脱，得到目 的蛋白IGFBP3。
[0044]上述IGFBP3蛋白的制备方法所得蛋白的量较大，纯度较高。作为免疫抗原制备抗 体，能够引起更高的抗体效价。实验表明，采用本发明提供的方法制备IGFBP3的单克隆抗 体，所得单克隆抗体的效价较高，与抗原结合的EC50值较小，说明本发明提供方法制备的单 克隆抗体与抗原的亲和性更强。实验重复3次，结果显示皆相似，说明本发明提供的方法具 有较好的重现性。
[0045]本发明还要求保护本发明提供方法方法制备的单克隆抗体。
[0046]本发明提供了一种制备IGFBP3单克隆抗体的方法，该方法采用基础免疫和加强免 疫的方式获得免疫小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞融合后，以体外培养的方式制备单克隆抗 体。本发明通过调整免疫方式、融合条件、体外培养条件，制得的单克隆抗体能够更好的与 抗原亲和。实验表明，本发明提供方法制备的单克隆抗体与抗原结合的EC50值不大于0.1， 与现有技术中制备的抗体相比具有极显著(P〈〇.01)的差异。
【附图说明】
[0047] 图1示琼脂糖凝胶电泳鉴定pUC57-IGFBP3重组子克隆；其中，Ml示5kb DNA marker，条带由上至下依次为5kb，3kb，2kb，Ikb，750bp，500bp，250bp，IOObp ;M2;^;2kb DNA 111已461'条带由上至下依次为21<:13，11<:13,75(^。，50(^。，25(^。，10(^。；泳道1~47]^1]057-IGFBP3表达载体；
[0048]图2示细胞培养上清液的SDS-PAGE凝胶电泳；泳道M为蛋白标准品，泳道I为悬浮 293f细胞转染前的培养上清，泳道2为悬浮293f细胞转染后的培养上清；
[0049] 图3示经纯化的IGFBP3蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳;M为蛋白标准品。
【具体实施方式】
[0050] 本发明提供了一种制备胰岛素样生长因子结合蛋白3单克隆抗体的方法，本领域 技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换 和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法 及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范 围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0051] 本发明采用的实验动物、细胞、试剂、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0052]下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0053] 实施例1IGFBP3蛋白的制备 [0054] UIGFBP3基因的获取及扩增
[0055] 通过NCBI查找IGFBP3基因序列，登录号为3486。并交由上海生工生物合成IGFBP3 基因，克隆到大肠杆菌质粒载体pUC57-simple中，以pUC57simple-IGFBP3载体为模板