专利名称：一种从甘薯中获得的纯化物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从甘薯中获得的纯化物及其用途。该物质存在于获得的具有神 经损伤保护作用的甘薯纯化物中。
背景技术：
随着老龄化社会的到来，神经退行性疾病(Neurodegenerativedisease)的发病比
率越来越高。神经退行性疾病是一大脑和脊髓的细胞神经元丧失的疾病状态。大脑和脊 髓由神经元组成，神经元有不同的功能，如控制运动，处理感觉信息，并作出决策。大 脑和脊髓的细胞一般是不会再生的，所以过度的损害可能是毁灭性的，不可逆转的。常 见的神经退行性疾病有阿尔茨海默病(AD)、帕金森氏病(PD)等。神经退行性疾病是人 类神经系统的严重疾病之一，虽然目前对神经退行性疾病的机理及治疗已进行了大量的 研究，但至今尚无有效成熟的方法和药物来治疗这种疾病。因此神经退行性疾病的早期 预防就显得尤为重要。阿尔茨海默病(AD)，也叫老年性痴呆或早老性痴呆，是老年期痴呆的主要类 型，是一种可引起脑功能逐渐衰退的神经退行性疾病。患者以记忆障碍为最初表现，此 后渐渐出现语言和定向障碍，最终不能独立生活。阿尔茨海默病已成为仅次于心血管 病、癌症和脑卒中的第四大死亡杀手。随着社会的发展，人口老龄化现象日益明显，阿 尔茨海默病或称早老性痴呆症将越来越威胁着世人的健康，给个人、家庭乃至整个社会 都将带来巨大的影响和负担。血管性痴呆(VaD)是引起老年期痴呆的第二病因，在痴呆中占10% 50%由多 种机制造成。但这些机制中哪个起主要作用，目前尚不明了，但很可能是多个机制协同 作用导致VaD。目前科学家最担忧的是对早老性痴呆的前期干预与治疗，如果人类无法找到防 治或治疗早老性痴呆症的有效方法，到了 2050年患此疾病的人数将达4500万。目前全球 约有2000-3000万人患上该病。统计表明，到2004年，中国60岁以上人口达到了 3个 亿。由全国6个城市109名医师参加，通过对北京、西安、上海、成都、广州、沈阳的 39个区县、210个居、村委会的42890名55岁以上老人调查，首次明确我国不是痴呆的 低危地区。而最新统计结果显示65岁以上老人中有约10%，85岁以上老人中有约50% 饱受着该病的折磨。由于很多人还未能认识这种疾病，把它看作是“年龄老化的一种正 常表现”而忽视了早期的预防和治疗。随着人们生活水平的提高以及保健意识的不断增 强，神经退行性疾病治疗的药物以及辅助改善记忆类保健食品的需求将不断扩大，具有 非常广阔的市场发展空间。目前研制生产的辅助改善记忆的药物主要从以下几方面考虑改善脑血液循环和脑细胞代谢的药物此类药物如脑复康、都可喜、喜得镇、 己酮可可碱、脑通等。改善胆碱能神经传递药物目前着力研究的这方面药物主要是乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂。钙离子拮抗剂常用的有尼莫地平、氟桂利嗪、脑益嗪等。激素类药物美国研究人员发现，使用雌激素治疗老年痴呆症可以缓解患有老 年痴呆症妇女的症状，并可能延缓或防止患者病情的发展。非留体抗炎药物医药学家正在研究的非留体抗炎药布洛芬、双氯芬酸、萘普 生等都有可能成为治疗老年痴呆症的有效药物。自由基消除剂和抗氧化剂维生素E、维生素C、褪黑素、去铁敏、艾地苯醌、 甲磺酸替拉扎特等。毒蕈碱受体激动剂以及中药人参、刺五加、银杏、石杉等均具有一定的益智和 提高记忆效果。甘薯是旋花科甘薯属的一个重要栽培品种，又名红薯、白薯、地瓜、番薯、山 芋、红苕等。世界上有111个国家栽培甘薯，主要集中于发展中国家。而我国则是世界 上最大的甘薯生产国，几乎遍布全国，其年产量约占全世界总产量的85%以上。目前， 人们在甘薯的深加工方面做了诸多的研究工作，但是大多集中于传统饲料以及工业原料 等如甘薯淀粉的生产、甘薯颗粒、甘薯灌肠、甘薯膨化食品、甘薯发酵制品等方面的研 究。然而，随着人民生活水平的提高、保健意识的增强以及对甘薯研究的不断深入， 人们发现，甘薯不仅具有很高的营养价值，它富含淀粉、可溶性糖、蛋白质、多种维生 素、氨基酸以及钙、磷、铁等多种营养成分之外，同时具有很高的医药保健价值，这方 面的研究正在逐步被人们所关注。我国古代就有关于甘薯保健功能的记载甘薯性平， 味甘，无毒，主治补虚乏、益气力、健脾胃、强肾阴。可见甘薯保健功能早在古代就已 经被人们所认知。近年来，甘薯中的一些功能性成分也在逐渐被人们所揭示，如甘薯 中去氧表雄酮，色素提取物，糖蛋白结合物以及有机酸类等物质的研究。但是到目前为 止，有关甘薯中含有辅助改善记忆功能物质的研究尚未见报道。从甘薯中提取分离神经 营养及损伤保护作用物质，不仅可以大幅度提高甘薯的附加值，而且由于其丰富的原料 来源，更适合我国的国情，对我国国民经济的发展也将起到一个重要的作用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种从甘薯中获得的纯化物及其用途。从甘薯中获得的纯化物由下述制备方法得到，它的步骤如下1)将甘薯洗净，切成小块打碎机打碎，然后在-20 -80°C，真空度为15 IOOPa的条件下低温冷冻干燥6 24小时，充分除去水分，得到甘薯冻干粉；2)甘薯冻干粉中加2 10倍体积的无水乙醇于40 65°C恒温水浴震荡器中震荡 提取2 5小时后，或者加2 10倍体积的无水乙醇于室温浸渍提取24 48小时后， 经真空泵抽滤或离心取上清夜，用旋转蒸发仪真空浓缩完全除去乙醇，得到甘薯的乙醇 提取物；3)用0.4mol/L氢氧化钠的甲醇溶液于30 50°C振荡水浴中水解甘薯的乙醇提 取物2 3小时后，得到水解液，再以水解液氯仿水为3 5 5 10 2 4的 体积比例充分混合振荡提取，取下层提取液真空浓缩，得到浓缩液；
4)先用正己烷平衡超纯FLASH 120-200 μ m硅胶，然后加入上述浓缩液， 依次用正己烷丙酮=2 1体积比的溶液、正己烷丙酮=1 2体积比的溶液和 丙酮冲洗柱子，弃去洗脱液，再用无水乙醇洗脱柱子，收集洗脱液，真空浓缩，然后 在-20 -80°C，15 IOOPa的条件下低温冷冻干燥6 24小时得纯化物。从甘薯中获得的纯化物用于制备提高对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的细胞存活 率，改善谷氨酸诱导的PC12细胞损伤细胞形态变化，改善神经退行性疾病的药物或辅助 改善记忆功能性食品的原料。从甘薯中获得的纯化物用于制备提高对Αβ 25_35淀粉样肽诱导的SK-N-SH细胞 损伤的细胞存活率，改善Αβ 25_35淀粉样肽诱导的SK-N-SH细胞损伤的细胞形态变化， 改善神经退行性疾病的药物或辅助改善记忆功能性食品的原料。本发明公开了一类从甘薯中获得的具有神经细胞损伤保护作用的物质，该物质 经甘薯冻干、提取、分离、纯化获得，适用于对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤和Αβ25_35 淀粉样肽诱导的SK-N-SH细胞损伤的保护作用。能够提高对谷氨酸诱导的PC12细胞 损伤和Αβ 25_35淀粉样肽诱导的SK-N-SH细胞损伤的细胞存活率，改善对谷氨酸诱导的 PC12细胞损伤和Αβ 25_35淀粉样肽诱导的SK-N-SH细胞损伤的细胞形态变化，达到辅助 改善记忆的功能。可作为改善神经退行性疾病的药物或辅助改善记忆功能性食品的原料 来源。
图1 (A)是空白对照组PC12细胞形态图；图1 (B)是 2.0mmol/L Glu 组 PC12 细胞形态图；图1 (C)是 1.0 μ mol/L 尼莫地平 +2.0mmol/L Glu 组 PC12 细胞形态图；图1 (J)是 0.1 μ g/mL 受试物 +2.0mmol/L Glu 组 PC12 细胞形态图；图1 (K)是 1.0 μ g/mL 受试物 +2.0mmol/L Glu 组 PC12 细胞形态图；图1 (L)是 10.0 μ g/mL 受试物 +2.0mmol/L Glu 组 PC12 细胞形态图.；图2 (A)是空白对照组SK-N-SH细胞形态图；图2 (B)是 20 μ mol/L Αβ 25_35 组 SK-N-SH 细胞形态图；图2 (C)是 12.5 μ mol/L 多奈哌齐+20 μ mol/L A β 25_35组 SK-N-SH 细胞形态2 (D)是 0.1 μ g/mL 受试物 +20 μ mol/LA β 25_35 组 SK-N-SH 细胞形态图；图2 (E)是 1.0 μ g/mL 受试物 +20 μ mol/LA β 25_35 组 SK-N-SH 细胞形态图；图2 (F)是 10.0 μ g/mL 受试物 +20 μ mol/LA β 25_35 组 SK-N-SH 细胞形态图。
具体实施例方式
实施例1:将甘薯洗净，切成小块打碎机打碎，然后在_20°C真空度为15Pa的条 件下低温冷冻干燥6小时，充分除去水分，加10倍体积的无水乙醇于40°C恒温水浴震荡 器中震荡提取2个小时后，或加10倍体积的无水乙醇于室温浸渍提取24小时后，经真空 泵抽滤，用旋转蒸发仪真空浓缩完全除去乙醇，用0.4mol/L氢氧化钠的甲醇溶液于50°C 振荡水浴水解2小时，以水解液氯仿水为5 10 4的比例充分混合振荡提取，然 后取下层提取液旋转真空浓缩，再用超纯FLASH硅胶(120-200 μ m)纯化，硅胶首先用
5正己烷平衡，然后上样，用正己烷丙酮=2 1溶液洗脱，弃去洗脱液，再用正己烷 丙酮=1 2溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用丙酮冲洗柱子，弃去洗脱液，最后用无水乙 醇洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发仪真空浓缩，在-20°C真空度为50Pa的条件下低温冷冻 干燥24小时得甘薯纯化物。实施例2:将甘薯洗净，切成小块打碎机打碎，然后在-80°C真空度为IOOPa的 条件下低温冷冻干燥24小时，充分除去水分，加5倍体积的无水乙醇于50°C恒温水浴 震荡器中震荡提取3个小时后，或加5倍体积的无水乙醇于室温浸渍提取30小时后，经 真空泵抽滤，用旋转蒸发仪真空浓缩完全除去乙醇，用0.4mol/L氢氧化钠的甲醇溶液于 30°C振荡水浴水解3小时，以水解液氯仿水为3 5 2的比例充分混合振荡提取， 然后取下层提取液旋转真空浓缩，再用超纯FLASH硅胶(120-200 μ m)纯化，硅胶首先 用正己烷平衡，然后上样，用正己烷丙酮=2 1溶液洗脱，弃去洗脱液，再用正己 烷丙酮=1 2溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用丙酮冲洗柱子，弃去洗脱液，最后用无 水乙醇洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发仪真空浓缩，在-20°C真空度为50Pa的条件下低温 冷冻干燥24小时得甘薯纯化物。实施例3:将甘薯洗净，切成小块打碎机打碎，然后在_50°C真空度为50Pa的条 件下低温冷冻干燥12小时，充分除去水分，加8倍体积的无水乙醇于50°C恒温水浴震荡 器中震荡提取2.5个小时后，或加8倍体积的无水乙醇于室温浸渍提取30小时后，经真空 泵抽滤，用旋转蒸发仪真空浓缩完全除去乙醇，用0.4mol/L氢氧化钠的甲醇溶液于40°C 振荡水浴水解2.5小时，以水解液氯仿水为4 8 3的比例充分混合振荡提取，然 后取下层提取液旋转真空浓缩，再用超纯FLASH硅胶(120-200 μ m)纯化，硅胶首先用 正己烷平衡，然后上样，用正己烷丙酮=2 1溶液洗脱，弃去洗脱液，再用正己烷 丙酮=1 2溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用丙酮冲洗柱子，弃去洗脱液，最后用无水乙 醇洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发仪真空浓缩，在-50°C真空度为70Pa的条件下低温冷冻 干燥12小时得甘薯纯化物。实施例4:将甘薯洗净，切成小块打碎机打碎，然后在_50°C真空度为30Pa的条 件下低温冷冻干燥12小时，充分除去水分，加3倍体积的无水乙醇于50°C恒温水浴震荡 器中震荡提取3个小时后，或加3倍体积的无水乙醇于室温浸渍提取36小时后，经真空 泵抽滤，用旋转蒸发仪真空浓缩完全除去乙醇，用0.4mol/L氢氧化钠的甲醇溶液于37°C 振荡水浴水解3小时，以水解液氯仿水为4 8 3的比例充分混合振荡提取，然后 取下层提取液旋转真空浓缩，再用超纯FLASH硅胶(120-200 μ m)纯化，硅胶首先用正 己烷平衡，然后上样，用正己烷丙酮=2 1溶液洗脱，弃去洗脱液，再用正己烷丙 酮=1 2溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用丙酮冲洗柱子，弃去洗脱液，最后用无水乙醇 洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发仪真空浓缩，在-30°C真空度为IOOPa的条件下低温冷冻干 燥24小时得甘薯纯化物。实施例5:将甘薯洗净，切成小块打碎机打碎，然后在_30°C真空度为IOOPa的 条件下低温冷冻干燥24小时，充分除去水分，加2倍体积的无水乙醇于65°C恒温水浴震 荡器中震荡提取5小时后，或加2倍体积的无水乙醇于室温浸渍提取48小时后，经真空 泵抽滤，用旋转蒸发仪真空浓缩完全除去乙醇，用0.4mol/L氢氧化钠的甲醇溶液于37°C 振荡水浴水解3小时，以水解液氯仿水为5 10 4的比例充分混合振荡提取，然后取下层提取液旋转真空浓缩，再用超纯FLASH硅胶(120-200 μ m)纯化，硅胶首先用 正己烷平衡，然后上样，用正己烷丙酮=2 1溶液洗脱，弃去洗脱液，再用正己烷 丙酮=1 2溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用丙酮冲洗柱子，弃去洗脱液，最后用无水乙 醇洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发仪真空浓缩，在-80°C真空度为15Pa的条件下低温冷冻 干燥6小时得甘薯纯化物。对西蒙甘薯得到的纯化物，进行了神经细胞损伤保护能力的测试和评价一、甘薯提取物对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的保护作用1.方法1.1细胞株高分化大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(Pheochromocytoma cells，PC12)细胞，购自中科
院上海细胞库。1.2实验分组、细胞损伤模型的建立及给药方法实验分为空白对照组、尼莫地平阳性对照药物组、模型组和受试物(甘薯纯化 物)组。收集PC12细胞，调整细胞悬液浓度为1 X IO6个/mL，100 μ L/孔接种于96孔 细胞培养板内，次日给予不同浓度(0.1，1.0，lO.Oyg/mL)受试物或l.Oymol/L阳性对 照药物尼莫地平，37°C预孵育24h后，用无Mg-Earle，s液(mmol/L NaCl 142.6，KCl 5.4，CaC121.8，NaH2P041.0, HEPES 2.38，葡萄糖 5.6，pH 7.4)洗 1 遍，加入谷氨酸 (浓度为2.0mmol/L)同时给予各浓度(0.1，1.0，10.0 μ g/mL)受试物，37°C孵育15min， 然后换无Mg-Earie’ s液及受试物、阳性对照药物尼莫地平37°C继续培养Ih后检测细胞 存活率。1.3体外细胞活率检测实验每孔加入100ylMTT(lmg/ml，以DMEM培养液溶解)，37°C孵育4h，弃去各 孔内液体后加入150μ1酸化异丙醇(含0.04mol/LHCl)，避光放置30min，BioRad Model 680型酶标仪测定570nm处吸光度，计算细胞活率。1.4细胞形态学观察实验细胞培养结束后，倒置显微镜于200X视野下，观察各组PC12细胞的生长状况 及形态学变化。1.5统计方法实验结果以^ 士 s表示。用SPSS13.0软件进行统计分析，各组之间比较采用单 因素方差分析(ANOVA)和T检验法评价。2.结果2.1细胞活率实验表1.甘薯纯化物对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤细胞活率的影响
权利要求
1.一种从甘薯中获得的纯化物，其特征在于由下述制备方法得到，它的步骤如下1)将甘薯洗净，切成小块打碎机打碎，然后在-20 -80°c，真空度为15 IOOPa 的条件下低温冷冻干燥6 24小时，充分除去水分，得到甘薯冻干粉；2)甘薯冻干粉中加2 10倍体积的无水乙醇于40 65°C恒温水浴震荡器中震荡提 取2 5小时后，或者加2 10倍体积的无水乙醇于室温浸渍提取24 48小时后，经 真空泵抽滤或离心取上清夜，用旋转蒸发仪真空浓缩完全除去乙醇，得到甘薯的乙醇提 取物；3)用0.4mol/L氢氧化钠的甲醇溶液于30 50°C振荡水浴中水解甘薯的乙醇提取物 2 3小时后，得到水解液，再以水解液氯仿水为3 5 5 10 2 4的体积比 例充分混合振荡提取，取下层提取液真空浓缩，得到浓缩液；4)先用正己烷平衡超纯FLASH120-200 μ m硅胶，然后加入上述浓缩液，依次 用正己烷丙酮=2 1体积比的溶液、正己烷丙酮=1 2体积比的溶液和丙 酮冲洗柱子，弃去洗脱液，再用无水乙醇洗脱柱子，收集洗脱液，真空浓缩，然后 在-20 -80°C，15 IOOPa的条件下低温冷冻干燥6 24小时得纯化物。
2.—种根据权利要求1所述的从甘薯中获得的纯化物的用途，其特征在于用于制备提 高对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的细胞存活率，改善谷氨酸诱导的PC12细胞损伤细胞 形态变化，改善神经退行性疾病的药物或辅助改善记忆功能性食品的原料。
3.一种根据权利要求1所述的从甘薯中获得的纯化物的用途，其特征在于用于制备提高对八日25_35淀粉样肽诱导的SK-N-SH细胞损伤的细胞存活率，改善 Αβ 25_35淀粉样肽诱导的SK-N-SH细胞损伤的细胞形态变化，改善神经退行性疾病的药 物或辅助改善记忆功能性食品的原料。
全文摘要
本发明公开了一种从甘薯中获得的纯化物及其用途。纯化物由下述制备方法得到，它的步骤如下1)将甘薯洗净，切成小块打碎机打碎，低温冷冻干燥，除去水分，得到甘薯冻干粉；2)甘薯冻干粉中加无水乙醇提取，经真空浓缩等方法得到甘薯的乙醇提取物；3)用氢氧化钠甲醇溶液水解甘薯的乙醇提取物，得到水解液，再经提取真空浓缩，得到浓缩液；4)上述浓缩液经硅胶柱层析，得到纯化物。本发明适用于对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤和Aβ25-35淀粉样肽诱导的SK-N-SH细胞损伤的保护作用。该物质存在于获得的具有对神经细胞损伤具有保护作用的甘薯纯化物中。本发明提取方法简便，提取得到的物质高效无毒，可作为改善神经退行性疾病的药物或辅助改善记忆功能性食品的原料。
文档编号A23L1/29GK102008626SQ20101057314
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者孙丽华, 王茵, 郑晓亮, 鲁健章 申请人:浙江省医学科学院