专利名称：采用益生菌治疗内毒素血症及相关疾病的制作方法
技术领域：
本发明涉及预防和治疗内毒素血症及相关疾病的方法，具体地，本发明涉及用益生菌预防和治疗内毒素血症及相关疾病的方法；本发明也涉及用于评价益生菌对内毒素血症及相关疾病的预防和治疗效果的方法。
背景本说明书通篇有关现有技术的讨论决不应看作是承认该现有技术是普遍已知的或是本领域常识的一个部分。
内毒素是脂多糖，是位于革兰氏阴性细菌细胞壁上具有热稳定性的大分子(分子量200,000至1,000,000)。
革兰氏阴性菌——尤其是大肠杆菌及其他物种在肠道中的寄居可以造成少量内毒素进入循环系统。改变寄居特征或者粘膜完整性的多种病理情况，会显著地提高细菌的转移，造成高水平的循环内毒素，即内毒素血症。
由于内毒素会造成组织损伤，因此，内毒素血症又与多种疾病状态相关联。实例包括从急性病症，如“内毒素休克”到更加微妙的慢性组织损伤，例如肝细胞坏死/(炎症)(肝炎)，特别是在同时存在已知与肝脏疾病有关的因素(如酒精和肝脏毒性病毒)的情况下。
近来，造成肝细胞损伤的共同途径被聚焦在循环T淋巴细胞上。传统上接受的引起肝细胞损伤的媒介是甲、乙、丙型肝炎以及自身免疫性肝炎(和推测的另外一些病毒感染，如EB病毒(EBV)，巨细胞病毒(CMV))。现在看来T淋巴细胞也与酒精性慢性肝脏疾病有关。已经发现，酒精可促进T淋巴细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF)。在存在T细胞刺激物(特别是内毒素)时，这种“连击”模式确保了肝细胞中高的TNF浓度，从而导致细胞死亡、肝炎以及，如果肝脏系统被打乱，则将导致肝硬化。
已经证明大肠杆菌可以提高酒精性肝炎患者的内毒素水平，当患者服用抗生素时，患者的内毒素水平会下降。
尽管(口服)抗生素能够减少内毒素的水平，但尤其是从长期的角度出发，这不是一种理想的达到此目的的方法。另外一些被考虑用于治疗的策略包括3-脱氧-D-甘露-2-辛酮糖酸合成抑制剂，多粘菌素B(一种多聚阳离子分子，可以结合内毒素)、血浆除去法、单克隆和多克隆免疫治疗以及用内毒素拮抗剂治疗(J Hurley(1995)在Clin.Microbiol.Rev.8268-292中的综述)。这些策略每一个都有有利和不利之处，但至今仍没有简单且有效的内毒素血症治疗方法。
本发明的一个目的是克服或者改进现有技术中的至少一个缺点，或者提供有用的可选择方案。
第一方面，本发明提供预防和/或治疗内毒素血症的方法，包括给需要治疗的哺乳动物施用有效量的益生菌。
所述哺乳动物可以有出现内毒素血症的危险，或者可以已经患有内毒素血症，此哺乳动物可以患有急性病症，例如危急病症或者急性肝炎，或者可以患有慢性病症，例如慢性肝疾病。
对本领域技术人员来说，显而易见，本发明的方法和/或应用可以用于循环系统中出现内毒素的任何疾病。
第二方面，本发明提供治疗酒精诱导的肝病的方法，此方法是给需要治疗的哺乳动物施用治疗上有效量的益生菌。
第三方面，本发明提供治疗炎症性肠病的方法，包括给需要治疗的哺乳动物施用治疗上有效量的益生菌。
第四方面，本发明提供益生菌在制备用于预防和/或治疗哺乳动物内毒素血症的药物中的用途。
第五方面，本发明提供益生菌在制备用于治疗酒精诱导的肝病的药物中的用途。
第六方面，本发明提供益生菌在制备用于治疗炎症性肠病的药物中的用途。
所述哺乳动物优选是人，但是，本领域技术人员将明了，其他哺乳动物也在考虑之中。
本领域技术人员可以确定适宜的益生菌，其包括如乳酸细菌，如乳杆菌属(Lactobacillus)。优选地，所述益生菌是嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)或者发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。最优选所述益生菌是嗜酸乳杆菌菌株(VRI-001)或者发酵乳杆菌菌株(VRI-002)，两种菌种都可以从澳大利亚悉尼西南威尔士大学微生物和免疫学培养物保藏学院(University of New South Wales，School of Microbiology andImmunology Culture Collection，Sydney，Australia)获得。
优选通过口服途径施用益生菌或者药物，但也可以考虑其他给药途径，例如通过栓剂或者利用插管通过胃部途径给药。
优选益生菌或者药物采取片剂或胶囊形式，但益生菌或者药物也可以采取食物组合物的形式，如奶制品或豆制品。
优选片剂或者胶囊中包含108至1012CFU益生菌。
第七方面，本发明提供评价益生菌在预防和/或治疗哺乳动物内毒素血症方面的效果的方法，包括(a)给哺乳动物施用内毒素和/或内毒素诱导剂，和/或在哺乳动物上造成内毒素引起的损伤；(b)给哺乳动物施用益生菌；和(c)确定益生菌对内毒素血症的效果。
第八方面，本发明提供评价益生菌在预防和/或治疗哺乳动物酒精诱导的肝病方面的效果的方法，包括(a)给哺乳动物施用酒精；(b)给哺乳动物施用益生菌；和(c)确定益生菌对动物肝脏疾病的效果。
第九方面，本发明提供了评价益生菌在预防和/或治疗哺乳动物炎症性肠病方面的效果的方法，包括(a)施用导致肠道炎症的药剂；(b)给哺乳动物施用益生菌；和(c)确定益生菌对肠道疾病的效果。
本领域技术人员明了，方法中步骤(a)和(b)可以同时或相继进行，当相继进行时，待评价的效果的性质将决定步骤(a)应该在步骤(b)之前还是之后进行。
所述哺乳动物可以是包括人在内的任何哺乳动物。哺乳动物也可以是例如实验动物，例如大鼠。
递送的酒精的浓度、数量以及方式取决于各种因素，如所监测的效果、哺乳动物的类型、益生菌的种类和配制等等。本领域技术人员将能够容易地确定这些参数。例如，可以在一个适宜的时间段内，以递增浓度给哺乳动物施用酒精。例如，酒精的量可以从如5％到40％，并可以通过饮用水施用。例如，可以给哺乳动物施用酒精数月，例如2个月。
作为选择方案，为了诱发炎症性肠疾病，可以将酒精递送至哺乳动物结肠，本领域技术人员可以容易地确定酒精的适宜浓度和数量，例如可以是45％的乙醇。
优选地，所评价的益生菌是乳酸细菌，如乳杆菌。
更加优选地，益生菌是嗜酸乳杆菌或者发酵乳杆菌，最优选是嗜酸乳杆菌VRI-001菌株或者发酵乳杆菌VR1-002菌株。
两种菌株都可以从澳大利亚悉尼西南威尔士大学微生物及免疫学院培养物保藏学院获得。
优选地，益生菌通过口服途径给药，但是预计也可以采用其他的给药途径，例如栓剂或者插管法胃部给药。优选地，益生菌是片剂、胶囊或者袋装药形式，但也可以是食物组合物的形式，如奶制品或豆制品。
优选地，片剂或者胶囊中包含有108至1012CFU的益生菌。
当所述哺乳动物是大鼠时，可以每隔两天施用约5×1010CFU益生菌。优选地，益生菌存在于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。益生菌可以通过如胃内喂食方式给药。
益生菌的效果可以用任何适宜的方法来确定。一个方法是测量直接和/或间接指示循环内毒素水平的参数。例如，可以采用鲎变形细胞溶解物试验(LAL)测定内毒素水平，从而确定益生菌的效果。
例如，可以通过测量指示损伤水平的参数来确定益生菌的效果，例如测量与肝脏损伤正相关的血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)。
优选内毒素诱导剂是酒精。优选酒精诱导肝脏疾病。
本发明的说明书中，术语“预防和/或治疗内毒素血症”包括，但不限于，预防和/或治疗内毒素水平增加和/或内毒素血症造成的病症/并发症。
图2显示给大鼠喂食乙醇28天后，用鲎变形细胞溶解物试验(LAL)测定的血液内毒素水平。
图3显示在患有酒精诱导的结肠炎症的小鼠中益生菌对血液内毒素水平的控制。
图4显示，酒精攻击后，在喂食益生菌的小鼠中，结肠内肠道细菌的寄居减少与缺少血液内毒素有关。
发明详述下面仅通过举例方式，参考附图来描述本发明的优选实施方案。
实施例1已经有文献描述了酒精诱导的肝损伤的大鼠模型(Cao Qi，Batey R，Pang G，Clancg R，1998，酒精中毒临床和实验研究(AlcoholismClinical and Experimental Reserch)22723-729)。采用这个模型，令人惊讶地发现施用益生菌可以减少肝脏损伤。
8-10周龄、体重约250克的雌性Wistar大鼠(n＝10-14)被单独饲养在铁丝网笼中，控制环境温度并给予12小时光照黑暗周期，大鼠在整个研究过程中可以随意进食鼠粮和饮水。根据澳大利亚纽卡斯尔大学(University of Newcastle)动物研究伦理委员会所制定的规定开展本研究工作。
从5％(体积/体积，V/V)的乙醇开始，4周内不断增加喂食大鼠的蒸馏水中乙醇的浓度，当蒸馏水中的乙醇浓度达到40％(V/V)时，再保持这个浓度4周时间。后4周中，还以胃内饲喂途径给每只大鼠口服嗜酸乳杆菌(每只大鼠5×1010CFU，每两天一次)，所用细菌在磷酸缓冲盐溶液(PBS0.01M磷酸缓冲液，0.020M氯化钾和0.120M氯化钠、pH7.4)。所用的嗜酸乳杆菌菌种是可从澳大利亚西南威尔士大学微生物及免疫学培养物保藏学院获得的VRI-001。
对照大鼠(n＝8)除了仅仅给予PBS(没有乳杆菌)外，采用上述相同的方式处理。
8周结束时采用标准光量法在双色分析仪(澳大利亚纽卡斯尔约翰亨特医院生化部(Department of Biochemistry，John Hunter Hospital，Newcastle，Australia))上测定血浆中丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平(n＝8)。血浆ALT水平与肝损伤正相关，其中血浆中ALT水平的测量是一个公认的可用于评估肝脏损伤的标准方法学。
结果显示在附
图1中，其表明，喂食嗜酸乳杆菌的大鼠比不接受益生菌的大鼠有显著少的ALT(P＜0.03)。因此，给予嗜酸乳杆菌能够减少肝损伤。酒精诱导的肝损伤模型可以用作一般性的肝损伤模型，特别是，此模型与诸如病毒性肝炎等疾病不仅在肝损伤方面且在细胞反应方面都具有共同性。因此，所获结果可以用于指示给患有这些疾病的患者施用益生菌的效果。
实施例2酒精诱导的肝损伤大鼠模型也可以用作内毒素血症的一般模型，因为在这些大鼠的循环系统中有高水平的内毒素。
乳酸细菌是革兰氏阳性菌，其短暂地寄居在胃肠道内。令人惊讶地发现，在上述动物模型中，补充乳酸细菌——嗜酸乳杆菌可减少循环的内毒素水平。
在(给予40％酒精的第一天之后)第0、14、28天对实施例1所描述的大鼠进行尾部取血，采用鲎变形细胞溶解物试验(LAL)测定血浆中的内毒素水平(见J.C.Hurley(1995)内毒素血症检测方法和临床相关性，Clin.Microbiol.Rev.8268-292中的讨论)，LAL由美国马萨诸塞州伍兹赫尔的卡普克德公司(Cape Code Inc.，Woods Hole，MA，USA)提供。如图2所示，与喂食盐水的大鼠相比，第14和28天在喂食嗜酸乳杆菌的大鼠中检测到的内毒素水平较低。
不拘泥于理论，由此可以推测，嗜酸乳杆菌能够调节内毒素的转移。
实施例3为了证明降低内毒素水平的能力并不仅仅局限在上述酒精诱导的肝损伤大鼠模型中，用益生发酵乳杆菌预先处理酒精诱导的炎症性肠病小鼠模型，以确定益生菌对此条件下诱导的内毒素的影响。
益生菌对循环内毒素的影响给雌性BALB/c小鼠(5只8周龄小鼠为1组)连续喂食1×109个发酵乳杆菌(VRI-002菌株，从澳大利亚悉尼西南威尔士大学微生物和免疫学培养物保藏学院获得)三天，然后采用细管通过直肠向小鼠结肠部位施用45％乙醇溶液进行攻击。对照小鼠喂食PBS。
攻击后两天，杀死小鼠并且用上面描述过的LAL试验分析血浆中内毒素的水平。
如图3所示，在未接受处理的小鼠(正常)或者施用酒精前喂食发酵乳杆菌的小鼠的血液中都没有检测到内毒素，而用酒精处理且喂食PBS的小鼠有显著高的内毒素水平。结果指出，在这个乙醇诱导的炎症性肠病小鼠模型中，在诱导炎症性肠病之前施用益生菌可以阻止通常会伴随该疾病出现的内毒素水平升高。
实施例4肠道菌群平衡和内毒素血症的关系为调查血液内毒素的增加或减少与存在的肠道菌群的量是否有关，测定粪便中大肠菌(coliform bacteria)和肠细菌(enteric bacteria)的寄居水平。将实施例3所用小鼠的粪便悬浮在PBS中，将10倍逐级稀释物分别接种在含McConkey CM7琼脂培养基的培养板上，2-3天后，统计菌落数，结果表示为log10菌落形成单位(CFU)/克粪便。如图4所示，尽管在喂食发酵乳杆菌的组中大肠菌增加(1log)，但观察到结肠中肠细菌有6-7log减少，这与血液中检测不到内毒素是相关的。
不拘泥于理论，这些数据显示通过抑制胁迫后肠道中革兰氏阴性肠细菌的生长，益生菌能够控制血液中的内毒素水平。
尽管本发明已经通过具体的实施例加以描述，但本领域技术人员将明了，本发明可以以许多其他形式具体体现。
权利要求
1.预防和/或治疗内毒素血症的方法，包括给需要此治疗的哺乳动物施用有效量的益生菌。
2.根据权利要求1的方法，其中哺乳动物患有肝脏疾病。
3.根据权利要求2的方法，其中肝脏疾病是肝炎。
4.根据权利要求2的方法，其中肝脏疾病是酒精诱导的肝脏疾病。
5.根据权利要求1的方法，其中哺乳动物患有炎症性肠病。
6.治疗酒精诱导的肝脏疾病的方法，包括给需要此治疗的哺乳动物施用治疗上有效量的益生菌。
7.治疗炎症性肠病的方法，包括给需要此治疗的哺乳动物施用治疗上有效量的益生菌。
8.根据权利要求1-7之任一项的方法，其中哺乳动物是人。
9.根据权利要求1-8之任一项的方法，其中益生菌是乳杆菌。
10.根据权利要求9的方法，其中乳杆菌是嗜酸乳杆菌。
11.根据权利要求10的方法，其中嗜酸乳杆菌是VRI-001菌株。
12.根据权利要求9的方法，其中乳杆菌是发酵乳杆菌。
13.根据权利要求12的方法，其中发酵乳杆菌是VRI-002菌株。
14.根据权利要求1-13之任一项的方法，其中益生菌通过口服、通过栓剂或利用插管法通过胃部途径给药。
15.根据权利要求14的方法，其中益生菌是片剂或者胶囊形式。
16.根据权利要求15的方法，其中片剂或者胶囊包含108至1012CFU的益生菌。
17.根据权利要求14的方法，其中益生菌采取食物组合物的形式。
18.根据权利要求17的方法，其中食物是奶制品或者豆制品。
19.益生菌在制备用于预防和/或治疗哺乳动物内毒素血症的药物中的用途。
20.益生菌在制备用于预防和/或治疗酒精诱导的肝脏疾病的药物中的用途。
21.益生菌在制备用于预防和/或治疗炎症性肠病的药物中的用途。
22.根据权利要求19至21中任一项的用途，其中哺乳动物是人。
23.根据权利要求19至22中任一项的用途，其中益生菌是乳杆菌。
24.根据权利要求23的用途，其中乳杆菌是嗜酸乳杆菌。
25.根据权利要求24的用途，其中嗜酸乳杆菌是VRI-001菌株。
26.根据权利要求23的方法，其中乳杆菌是发酵乳杆菌。
27.根据权利要求26的方法，其中发酵乳杆菌是VRI-002菌株。
28.根据权利要求19至27中任一项的用途，其中益生菌通过口服或直肠给药，或者利用插管法通过胃内途径给药。
29.根据权利要求28的用途，其中益生菌是片剂或者胶囊形式。
30.根据权利要求29的用途，其中片剂或者胶囊含有108至1012CFU益生菌。
31.根据权利要求28的用途，其中益生菌采取食物组合物的形式。
32.根据权利要求31的用途，其中食物是奶制品或者豆制品。
33.评价益生菌在预防和/或治疗哺乳动物内毒素血症方面的效果的方法，包括(a)给哺乳动物施用内毒素和/或内毒素诱导剂，和/或在哺乳动物上造成内毒素引起的损伤；(b)给哺乳动物施用益生菌；和(c)确定益生菌对内毒素血症的效果。
34.评价益生菌在预防和/或治疗哺乳动物酒精诱导的肝脏疾病方面的效果的方法，包括(a)给哺乳动物施用酒精；(b)给哺乳动物施用益生菌；和(c)确定益生菌对动物肝脏疾病的效果。
35.评价益生菌在预防和/或治疗哺乳动物炎症性肠病方面的效果的方法，包括(a)施用造成肠道炎症的药剂；(b)给哺乳动物施用益生菌；和(c)确定益生菌对肠道疾病的效果。
36.根据权利要求33-36之任一项的方法，其中步骤(a)和(b)同时进行。
37.根据权利要求33-36之任一项的方法，其中步骤(a)和(b)相继进行，其中步骤(a)可以在步骤(b)之前或之后进行。
38.根据权利要求33-37之任一项的方法，其中哺乳动物是人。
39.根据权利要求33-37之任一项的方法，其中哺乳动物是啮齿类动物。
40.根据权利要求33-39之任一项的方法，其中将酒精在一段适宜的时间内以递增的浓度施用给哺乳动物。
41.根据权利要求40的方法，其中酒精在饮用水中的量为5％到40％。
42.根据权利要求41的方法，其中在约2个月的时间段内给哺乳动物施用酒精。
43.根据权利要求33-39之任一项的方法，其中将酒精递送到哺乳动物的结肠。
44.根据权利要求43的方法，其中酒精的浓度是45％。
45.根据权利要求33-43之任一项的方法，其中益生菌是乳杆菌。
46.根据权利要求45的方法，其中乳杆菌是嗜酸乳杆菌。
47.根据权利要求46的方法，其中嗜酸乳杆菌是VRI-001菌株。
48.根据权利要求45的方法，其中益生菌是发酵乳杆菌。
49.根据权利要求48的方法，其中发酵乳杆菌是VRI-002菌株。
50.根据权利要求33-49之任一项的方法，其中益生菌通过口服、通过栓剂或者利用插管法通过胃内途径给药。
51.根据权利要求50的方法，其中益生菌是片剂或者胶囊形式。
52.根据权利要求51的方法，其中片剂或者胶囊含有108至1012CFU益生菌。
53.根据权利要求50的方法，其中益生菌采取食物组合物的形式。
54.根据权利要求53的方法，其中食物是奶制品或者豆制品。
55.根据权利要求39的方法，其中每两天一次施用5×1010CFU益生菌。
56.根据权利要求55的方法，其中益生菌存在于磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。
57.根据权利要求56的方法，其中益生菌通过胃内喂食方式给药。
58.根据权利要求33-57之任一项的方法，其中通过测量直接和/或间接指示循环内毒素水平的参数，确定益生菌对内毒素血症的效果。
59.根据权利要求58的方法，其中通过测量内毒素水平确定益生菌对内毒素血症的效果。
60.根据权利要求34的方法，其中通过测量直接和/或间接指示肝脏损伤的参数，确定益生菌对肝脏疾病的效果。
61.根据权利要求61的方法，其中指示损伤水平的参数的测量是血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平的测量，其中ALT的减少指示益生菌对内毒素血症有积极的效果。
62.根据权利要求34的方法，其中通过测量直接和/或间接指示循环内毒素水平的参数，确定益生菌对肝脏疾病的效果。
63.根据权利要求62的方法，其中通过直接测量内毒素水平确定益生菌对肝脏疾病的效果。
64.根据权利要求63的方法，其中内毒素水平是通过鲎变性细胞溶解物试验(LAL)测定的。
65.根据权利要求35的方法，其中将酒精施用到哺乳动物的直肠中。
66.控制哺乳动物的循环内毒素水平的方法，包括通过施用益生菌抑制革兰氏阴性肠细菌的生长。
67.根据权利要求66的方法，其中益生菌是嗜酸乳杆菌。
68.根据权利要求67的方法，其中嗜酸乳杆菌是VRI-001菌株。
69.根据权利要求66的方法，其中益生菌是发酵乳杆菌。
70.根据权利要求69的方法，其中发酵乳杆菌是VRI-002菌株。
全文摘要
本发明涉及预防和治疗内毒素血症及相关疾病的方法，具体地，本发明涉及用益生菌预防和治疗内毒素血症及相关疾病的方法；本发明也涉及用于评价益生菌对内毒素血症及相关疾病的预防和治疗效果的方法。
文档编号C12Q1/02GK1446103SQ01813695
公开日2003年10月1日 申请日期2001年7月3日 优先权日2000年7月3日
发明者G·庞, J·凯德, R·L·克兰西, R·贝蒂, M·L·邓克利, P·康威 申请人:普罗本多有限公司