专利名称：用于s-腺苷l-甲硫氨酸:茉莉酮酸羧基甲基转移酶的基因以及应用该基因开发抗病原体 ...的制作方法
技术领域：
本次发明涉及用于茉莉酮酸羧基甲基转移酶(S-腺苷-L-甲硫氨酸茉莉酮酸羧基甲基转移酶)的一种新基因，以及合成茉莉酮酸羧基甲基转移酶的一种新蛋白有关，特别是，本发明与用携带该基因的表达载体转化的抗植物病原体、抗有害昆虫和抗外界不利因素的植物有关。
背景技术：
众所周知，植物对由于物理损伤或有害昆虫或植物病原体的入侵，可引起伤口的防御反应，这是由茉莉酮酸(JA)及其茉莉酮酸甲基酯(JAMe)家族复合物所调节的，这种生长调节物质广泛地存在于多种植物中(Creelman和Mullet，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48355-381，1992)。另外，也已经指出，这种抵抗反应是由相当复杂的信号传递网所组成的(Glazebrook，Curr.Opin.Plant Biol.2280-286，1999)。
当植物感染了植物病原体微生物，如病毒、细菌和真菌时，植物识别感染和对这些感染产生反应的途径，一般能够分为如下的两条一条是水杨酸(SA)调节的通路，另外一条就是JA调节的。已经知道，这些途径涉及很多种基因和蛋白质的一系列反应。尽管已经知道，抵抗有害昆虫引起的伤口的反应途径，一般是由JA所调节的，但抵抗细菌和真菌的反应途径一般是由SA或JA共同调节的，这具体取决于植物病原体的种类；然而，这种分类也并不是绝对的(Reymond和Farmer，Curr.Opin.Plant Biol.1404-411，1998)。这些反应不但在损伤和感染区域能够快速地发生局部应答，而且也能够允许植物，通过散布在整个植物体内的全身应答，来抵挡植物病原体和有害昆虫引起的刺激(Durner等，Trends Plant Sci.2266-274，1997)。
在这样的一个反应中，SA激发一系列的基因，如PR-1(发病机理有关蛋白-1)，PR-2和PR-5，诱导相应蛋白质的表达，从而这些蛋白允许整个植物体内发生全身地获得性抵抗反应(Uknes等.，PlantCell 4645-646，1992)，并且JA也刺激一系列基因，如PDF1.2(植物防御素)，PR-3和VSP(植物存储蛋白)，诱导相应蛋白的表达(Penninckx等.，Plant Cell 82309-2323，1996)。最近已有报道，有些共生的真菌可以通过合成JA建立一个诱导的全身抵抗反应(Pieterse等.，Plant Cell 101571-1580，1998)。JA从有害昆虫或生理原因引起的损伤区域传递信号，结果允许植物不仅在感染区，而且在全身建立一个对损伤的抵抗反应。然而，在上述反应中诱导的基因当中，有些基因如Pin2(蛋白酶抑制剂II)，SA和JA都可以加以诱导，因此，抵抗反应的这种分类不是绝对的。这样以来，在普遍接受调节的、这两种反应的、信号传递途径之间的、任何相关性都可能存在(Reymond和Farmer，Curr.Opin.Plant Biol.1404-411，1998)。
在以前的技术中，因为尽力在分子繁殖领域通过导入和表达重组基因来获得抵抗植物病原体和有害昆虫的植物，所以现在试图应用一个或两个SA和JA诱导决定的、且随后涉及在抵抗反应中的基因，如Pin2，PR3或PR5。结果，尽管植物可以获得对植物病原体和有害昆虫的一些抵抗反应，但是这种获得的抵抗反应仅适用于有限数目的病原体和昆虫(Zhu等.，Bio/Technology 12807-812，1994)。与此同时，已经有报道，当用SA信号传递途径中发现的重要调节者之一NPR1(PR1的非表达者)基因转化阿布属物种时，这些物种在某种程度上可以对粉末样霉菌属寄生虫和假单胞菌紫丁香属植物产生抵抗(Cao等.Proc.Natl.Acad.Sci.956531-6536，1998)。
为了清楚地识别SA和JA调节这种抵抗反应的作用，在植物病原体和有害昆虫损伤的植物中，已经有研究对这些物质的浓度变化进行了定量分析，或在外表撒布SA或JA后，判定植物在抵抗基因表达水平中的反应。然而，因为JA的溶解性和挥发性都很低，所以本研究应用了JAMe，普遍认为JAMe穿入植物后能够转换成JA(Farmer和Ryan，Proc.Natl.Acad.Sci.877713-7716，1990)。而且，JA和JAMe在植物组织中的分布模式相互间并没有多大不同，以致于这两种物质并不能相互区别开(Creelman和Mullet，Annu，Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48355-381，1992)。此外，在以前的技术中，因为没有发现JMT酶能够从JA中合成JAMe，所以从来就没有进行过与这种物质的新陈代谢和功能有关的任何研究。然而，已经有报道更具挥发性的JAMe能够通过空气移动来引起其他植物的抗疾病反应(Farmer和Ryan，Proc.Natl.Acad.Sci.877713-7716，1990)。因此，不能排除JAMe有可能就是一个更强的抗疾病的诱导物质，在低浓度的情况下就能发挥作用。
因而，通过重视植物体中SA及JA浓度和抗疾病反应之间的关系，已经进行了使植物体中SA浓度增加的突变剂的研究，如lsd6(损害刺激疾病6)，lsd7，acd2(加速细胞死亡2)。然而，尽管具有持续增加植物体中SA浓度的这种突变剂能够增加抗疾病基因的表达水平，并且显示对多种疾病均有抵抗力，但是也已经发现这种突变剂不适合用于经济农作物，因为突变剂的高度变的矮小并且已经出现早期老化现象(Greenberg等.，细胞77551-563，1994；Weymann等.，植物细胞72013-2022，1995)。
然而，还没有发现具有持续增加植物体中JAMe浓度的突变剂，因此，已经进行通过导入和表达诸如与植物体中JA生物合成的前几步有关的LOXII(脂肪氧合酶II)或AOS(allen氧化合酶)的基因，来增加对植物病原体和有害昆虫引起的损伤的抵抗力的研究。已经指出当AOS基因在叶绿体中过度表达时，植物体中JA的浓度增加6-12倍，然而抵抗疾病的基因如Pin2的表达并不增加；而且，并没证实有疾病抵抗(Harms等.，Plant Cell 71645-1654，1995)。此外，当AOS基因在细胞质中过度表达时，植物体中JA的浓度并不改变，而且这种植物对损伤的反应模式与其相应的野生型植物没有不同(Wang等.，Plant Mol.Biol.40783-793，1999)。已经知道与SA相反，JA以各种各样的方式极大地影响植物的发育、分化和新陈代谢。因此，认为JA的过度表达不仅与植物的疾病抵抗性有关，而且也涉及在各种各样的反应中，所以，与SA一样，JA有极大的可能性对植物的发育、分化和新陈代谢发挥着不合需要的作用。
因而，本发明人已经大范围地研究JAMe对植物的作用，关于它的结果之一，已经识别出和鉴定了一个新的茉莉酮酸羧基甲基转移酶蛋白和编码上述甲基转移酶的一个新基因。另外，本发明人还发现，用上述基因转化的转基因植物通过产生JAMe，增强了与植物对植物病原体和有害昆虫引起的损伤的抵抗力有关的许多基因的表达，并且从而对多种植物病原体、有害昆虫和进一步的外界的不利因素所引起的植物损伤产生了抵抗力，没有明显的副反应—因此，完成了本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的茉莉酮酸羧基甲基转移酶的基因，进而合成涉及到能抵抗由植物病原体和有害昆虫所造成植物损害的抵抗力的JAMe，并且还提供了一种由上述基因编码的酶蛋白。
更进一步来说，本发明的另一个目的是提供了一种转基因植物，这种转基因植物有着增强的抵抗损害的抵抗力，其中的损害可由各种各样的植物病原体和有害昆虫所造成，并且通过对上面所提及的酶蛋白特征的识别，其对植物的生长却有着最小化的副作用，然后重组上述的基因便产生出了上述的转基因植物，而这种转基因植物又过量表达上述这种基因，即提供了一种产生这种转基因植物的方法。
为了实现上述目标，本发明提供了一种新的茉莉酮酸羧基甲基转移酶，特别是，JMT酶带有一个氨基酸序列，即分离自阿布属的第3号ID序列。
另外，本项发现还提供了一种cDNA基因，参见第1号ID序列，可编码上述茉莉酮酸羧基甲基转移酶蛋白。
此外，本项发明还提供了一种重组载体，通过将上面所提及的基因，导入一种可以用作植物转化的表达性载体构建得来；还提供了一种方法，该方法可形成一种转基因植物，通过应用上面所提及的重组载体，在整个植物的体内可出现茉莉酮酸羧基甲基转移酶的基因的过度表达；进而在上述的转基因植物中，存在一种能够增强植物抵抗外界不利因素的抵抗力，和抵抗由植物病原体和有害昆虫所造成植物损害的抵抗力。
附图的简要描述本发明的上述的目的和其它的优点，通过对其中参考附图这最佳体现的详细描述，将变得更加显而易见，如下
图1中显示了克隆自thaliana阿布属的茉莉酮酸羧基甲基转移酶(JMT)的cDNA克隆pJMT的结构，其中的本发明中的JMT酶基因，是插入到pBlueScript中的。
图2显示了来自于克隆于thaliana阿布属的JMT酶的cDNA基因蛋白质的氨基酸序列，并与来自于一种众所周知的、水杨酸甲基转移酶基因的SAMT的、蛋白质的氨基酸序列相比较(入藏号AF133053；Ross等，1999)。在图2中，AtJMT表示的是thaliana阿布属的JMT酶，而SAMT则表示的是山字草breweri的水杨酸甲基转移酶。
图3显示的是重组基因pGST-JMT的结构，为JMT基因的表达的结果，以一种带有gluthatione S-转移酶的融合蛋白的形式，通过将JMT基因插入到pGEX-2T，而pGEX-2T为埃菲氏属大肠杆菌的表达载体。在图3中，Ptac表示的是tac启动子，并且下划线部分显示的是包含在融合蛋白中的、JMT氨基末端的核苷酸和氨基酸序列。
图4中显示的是融合蛋白的纯度，通过对埃菲氏属大肠杆菌BL21中的重组基因pGST-JMT的大量表达的测量，在已提纯的情况下，对融合酶蛋白进行分离，然后应用SDS凝胶电泳的方法，分析融合蛋白的纯度。在图4中，第1电泳泳道代表的是蛋白质的分子量标准参照物；第2电泳泳道代表的是埃菲氏属大肠杆菌BL21/pGEX-2T的蛋白质总量15μg；第3电泳泳道代表的是埃菲氏属大肠杆菌BL21，在应用包含有与本项发明中相应的JMT基因的pGST-JMT载体转化后的蛋白质总量15μg；第4电泳泳道代表的是利用gluthatione琼脂糖层析柱洗脱后的蛋白质总量为5μg；以及第5电泳泳道代表的是利用Superdex 200层析柱洗脱后的蛋白质总量为5μg。
图5显示的是通过重组酶蛋白GST-JMT的作用，采用茉莉酮酸(JA)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为底物，分离出一个纯化状态，然后利用气体层析分离法和mass光谱测定法，确定茉莉酮酸甲基酯(JAMe)的合成所获得的结果。在图5中，A是JAMe的分析结果，以及B是酶反应产物的分析结果。
图6是一个曲线图，显示的是融合酶蛋白GST-JMT，应用JA和[14C]SAM作为底物来特异性激发甲基化反应，在分离了上述各种各样的化合物后，通过检测融合酶蛋白GST-JMT反应的特异性加以鉴别。在图6中，Con表示的是仅仅应用[14C]SAM作为底物，而不应用JA作为底物的酶作用结果；SA表示的是应用水杨酸和[14C]SAM作为底物的酶作用结果；JA表示的是应用JA和[14C]SAM作为底物的酶作用结果；以及BA表示的是应用安息香酸和[14C]SAM作为底物的酶作用结果。
图7是一个曲线图，显示的是通过应用来自转基因型和野生型的阿布属thaliana获得的、天然蛋白质的提取物，来检测[14C]JAMe的产物的活性的结果。在图7中，●表示的是来自于转基因型植物中的天然蛋白质的提取物的量，以及○表示的是来自于野生型植物中的天然蛋白质的提取物的量图8显示的是重组体pCaJMT基因的结构，该重组基因是通过将JMT基因插入到应用于植物转化的表达性载体pBI121中，加以构建的，其中的CaMV表示的是花椰菜镶嵌病毒(CaMV)35S的启动子。
图9显示的是来自基因组Southern印记杂交分析法获得的结果，用来确定是否JMT基因正确地插入了转基因阿布属thaliana中。在图9中，W电泳泳道代表的是野生型阿布属thaliana，T电泳泳道代表的是转基因型阿布属thaliana，CaMV是代表应用CaMV35S启动子序列作为探针所得到的结果，以及AtJMT是代表应用JMT基因序列作为探针所得到的结果。
图10表示的是来自基因组Northern印记杂交分析法获得的结果，用来确定是否转基因阿布属thaliana中存在JMT基因(1，2，3)的过量表达，以及采用茉莉酮酸的诱导植物与抵抗力相关的基因的表达结果。在图10中，W电泳泳道代表的是野生型阿布属thaliana，T电泳泳道代表的是转基因型阿布属thaliana，AOS表示的是丙二烯氧化物合成酶的探针基因，DAHP表示的是3-脱氧-D-arabino-heptulosonate 7-磷酸合成酶的探针基因，JR2表示的是茉莉酮酸酯反应蛋白的探针基因，JR3表示的是假定的氨基水解酶的探针基因，LOXII表示的是脂肪氧化酶II的探针基因，以及VSP表示的是植物储存蛋白的探针基因等等。
图11是一张照片的图象，显示的是通过移植葡萄孢属灰质至转基因型和野生型阿布属thaliana中，作为灰色铸斑腐烂症的有机体病因，然后检测植株抵抗真菌性疾病的抵抗力，所获得的结果。其中左侧图显示的是在野生型阿布属thaliana中的结果，以及右侧图显示的是在转基因型阿布属thaliana中的结果。
完成本发明的最佳方式下面，对本发明作出更加明确的解释。
在本发明中，术语“茉莉酮酸羧基甲基转移酶”，是作为一般的专业名词应用的，它涉及了一种具有催化合成JAMe活性的酶，而JAMe则是将甲基基团转移到JA上生成的。此外，术语“JMT酶”指的是一种新的、来源于阿布属的酶蛋白，该酶作为上面所提到的“茉莉酮酸羧基甲基转移酶”之一，在本发明中首次被认知。在本文中所命名一种基因，即“JMT基因”编码了上述的酶蛋白。
在本发明中，一种新的JMT酶基因从Arabidposis中分离出来，并且从对这种基因的碱基序列的测定中得以证实，即它含有1170个碱基对核苷序列，编码389个氨基酸。首先，利用一种杂交的方法，从由中国卷心菜的花朵中制备的cDNA文库中，筛查出来了在植物的蜜腺中c38克隆的特异性表达。这种基因仅仅拥有416个碱基对的长度。因此，它被发现是在植物的蜜腺中特异性表达的基因的一部分克隆，而其中该基因的功能却不能确定。因而，应用上述c38克隆作为探针，一种与c38相近似的克隆，从阿布属植物的cDNA文库中被筛查出来。这种克隆拥有全长的1476个碱基对，包含有在3’-末端的连续的13个腺苷，以及距离5’-末端的第15个碱基对的一个翻译起始密码子AUG，而且该基因从头到尾的1167个碱基对，可连续性的编码389个氨基酸。这种可选择性的cDNA克隆是一个全长的cDNA克隆，由于这样的结构特征，它能够被识别。根据在下文中所描述的方法，作为功能性分析的结果，这种克隆如同茉莉酮酸羧基甲基转移酶基因一样被揭示出来，并且被命名为pJMT。这种pJMT克隆在2000年5月29日被收录储存在韩国培养类型收集库中，其入藏登记号为KCTC 0794BP。
由以上提及的基因编码的JMT酶拥有389个氨基酸，显现为第3号ID序列，并且分子量为43,369Da。
为测定上述的酶的活性，检索了NCBI基因数据库。结果，在碱基水平上，JMT基因没有找到相似的SAMT(水杨酸甲基转移酶)基因，而在氨基酸水平上，JMT酶蛋白与SAMT相比则表现出43％的同源性。但是，在SA JA或者相似的安息香酸(BA)和应用于重组体酶蛋白的SAM反应以后，根据气体层析分离法和mass光谱测定法的实验结果，能够鉴定出JMT酶实质上没有与SA或者BA进行反应，而是表现出一种同JA的高反应性，因此，这是一种来自SAMT的、具有不同活性的酶。此外，在上面所提及的重组体酶蛋白与作为底物的JA和SAM反应以后，根据气体层析分离法的实验结果，在相同的滞留时间(11.7分钟)以后，作为标准的JAMe以及还有与那种与标准的JAMe相同的分子量224，来检测所合成的材料。所以，能够确定的是，这种JMT酶是合成JAMe的茉莉酮酸羧基甲基转移酶，而JAMe为花朵中主要的发香味的成分之一，通过应用配方1中的SAM和配方2中的JA作为底物，来转移甲基基团到JA
迄今为至，从来没有这种茉莉酮酸羧基甲基转移酶的活性及其基因被公开。
在本发明中，为了确定其特有的、上面所描述的、新的JMT酶的特性，我们研究了酶的动力学参数。结果显示，确定了Km值为6.3μM，Vm值为8nmole/min.，Kcat值为70s-1，以及Kcat与Km值之比为11.1μM/s-1。
在本发明中，为了获得JMT酶，应用了多聚酶链式反应扩增出大数量的JMT酶，在多聚酶链式反应中应用了呈现在第4号和第5号ID序列的寡核苷酸作为探针，并且以cDNA克隆作为一条模板链。应用限制性内切酶EcoRI切开需要被扩增的基因，然后插入pGEX-2T，即经过了相同的限制性内切酶处理的埃菲氏属大肠杆菌的表达性载体。所合成的重组性质粒pGST-JMT被转化入埃菲氏属大肠杆菌BL21，接着是转化后的结果，即孵育产生出大数量的重组体蛋白，该蛋白应用于以下的实验中。
更进一步的是，本发明提供了一种转基因植物，该转基因植物是由一种包含有茉莉酮酸羧基甲基转移酶基因的表达性载体转化而来的。这种由一种包含有与本发明中相应的、茉莉酮酸羧基甲基转移酶基因的表达性载体转化而来的转基因植物，该植物能够始终稳定地过量表达一种茉莉酮酸羧基甲基转移酶的基因，在整个的植物体内可以表现出一种很强的抵抗由各种各样的植物病原体所造成的损害和进一步抵抗各种细菌菌株的抵抗力，而这些植物病原体包括多种的病毒、细菌和霉菌，或者是昆虫。
就一般而言，JA和JAMe是植物介导抵抗外伤和植物病原体侵害的防御性反应的复合物，已被我们所熟知。这种由一种包含有与本发明中相应的、茉莉酮酸羧基甲基转移酶的基因转化而来的植物，能够稳定地表达一种与抵抗力相关的基因，该基因通过JA或者JAMe处理诱导而成，例如，众多的包含有AOS，JR2(茉莉酮酸酯反应蛋白-2)，JR3(假定的氨基水解酶)，DAHP(3-脱氧-D-arabinoheptulosonate 7-磷酸合成酶)，LOXII，VSP，等等的基因。因此，应该能够注意到的是，以茉莉酮酸羧基甲基转移酶基因转化的植物的效果，与通过JA或JAMe的外源性处理所获得的效果相似。
通过应用一种包含有茉莉酮酸羧基甲基转移酶基因的表达性载体转化植物，该植物体内能够产生一种抵抗力，它可抵抗由植物病原体和有害的昆虫所造成的损害，这包括普通的真菌性疾病、细菌性疾病、病毒性疾病，或者是由于有害的昆虫造成的损伤、其他的事物、水稻的枯萎症、细菌性的叶片枯萎病、人为的黑穗病和叶蝉所致的损伤；大麦的结痂；玉米的棕褐色斑；豆科植株的花斑病；马铃薯的花斑病；红胡椒的晚期枯萎病和炭疽病；中国卷心菜和中国萝卜的轻度腐烂、根部结节性疾病和花斑病和卷心菜蝴蝶所造成的损害；芝麻的细菌性的枯萎病；草莓的灰色铸斑样腐烂和枯萎病病；西瓜的镰刀菌属性的枯萎病；西红柿的细菌性的枯萎病；黄瓜的粉末样霉菌病和绒毛样霉菌病；烟草的烟草花斑病；西红柿的镰刀菌属的枯萎病；人参的根部腐烂；棉花的多角状的叶斑病；果树包括苹果、梨、桃、猕猴桃、葡萄和柑橘类的炭疽病和灰色铸斑样腐烂病；苹果的癌肿病；枣树的“witches”金雀花病；草料农作物植株，其中包括黑麦草、红色三叶草、果园草、紫花苜蓿等等的粉末样霉菌病和锈斑病；在开花性植株，其中包括蔷薇属、大丁草、康乃馨等等的灰色铸斑样腐烂病和枯萎病；蔷薇属的黑斑病；剑兰和兰花的花斑病；或者是百合花的茎干部腐烂，等等。
因为这种由茉莉酮酸羧基甲基转移酶的基因转化的转基因植物，并没有发生影响植物生长的副作用，而这种副作用可能会发生在一些突变体中，在这些植物的突变体内会出现SA浓度的稳定增加，诸如，一些植株生长矮小的问题和过早衰老的现象，与应用那些出现了植株体内SA的浓度增加的突变体或者由在前面所描述的、与JA的合成有关的酶基因转化的转基因植物相比较，在应用于经济型的农作物则是更加有效益的。
另外，鉴于JAMe可以广泛存在在各种各样的植物中的这种事实，首先克隆与本发明有关的JMT基因是值得考虑的，而JMT基因也将广泛地存在于各种各样的植物中。因此，JMT基因和与本发明中相应的酶蛋白，应用在探索相似的茉莉酮酸羧基甲基转移酶蛋白，以及根据已经知道的方法，从各种各样的植物中，应用本发明中的JMT基因，编码相同的酶蛋白的基因，这可能是很有效的。
此外，这是值得考虑的，转基因植物抵抗由植物病原体和有害昆虫造成的损伤的抵抗力，可以来自于通过应用JAMe刺激大量的与产生抵抗力有关的基因的表达来获得，而JAMe就如同植物的抵抗疾病应答的一种媒介物，由具有酶活性的茉莉酮酸羧基甲基转移酶催化生成，而不是来自于茉莉酮酸羧基甲基转移酶本身的基因。鉴于这种情况，可以确定的是，只要这些基因能够编码具有如此酶活性的蛋白，以及与本方面相关的基因，它们均能应用于那些转基因植物的产生，而这些转基因植物则具有增强了的抵抗力，而且更进一步，通过预先给予带有这些基因的重组体，然后应用这种重组体转化植株，它们可能会产生出一种能够抵抗由病原体和有害的昆虫所造成的各种各样损害的相类似抵抗力，并且这对于各种类型的植物没有任何的限制。
采用上面所提及的茉莉酮酸羧基甲基转移酶的基因，来转化得到转基因植物的方法，可以依照已知方法完成的。需要特别指出的是，这种表达有茉莉酮酸羧基甲基转移酶基因的重组体质粒，可以应用作为基本载体应用于植物表达的众知的载体构建完成。出于这种意图，传统的二元载体、复合整合载体或者是一种普通的、只要能够在植物中表达的、但不能含有T-DNA部分的载体，均可以被应用。
在这些载体之中，正如二元载体是一种包含有左边界和右边界的、长度大约250个碱基对的载体，该载体可以应用于外源性基因的转染、供植物转化的T-DNA、以及应用于一种启动子部分和多聚腺嘌呤信号部分，该信号可在植物体内表达。更适宜的是，上面提及的二元载体还另外包含有一种可供选择的标记基因，例如卡那霉素抗性基因。作为用于转基因植物选择的标记基因，除草剂抗性基因、新陈代谢相关的基因、荧光素基因(荧光素酶)、与其自然特性相关的基因、GUS(β-葡萄糖苷酸酶)或者GLA(β-半乳糖苷酶)基因等等，可能也能够应用于除了如同前面所提及的抗生素抗性基因以外的领域。
根据本发明的最佳实施例，需要构建一种应用于植物转化的载体pCaJMT，并且用于将JMT基因插入pBI121载体的SmaI位点，该载体带有卡那霉素抗性选择性基因以及花椰菜镶嵌病毒35S启动子。
在应用二元载体或者复合整合载体的情况下，土壤细菌菌株(由土壤细菌介导的转化反应)可以作为微生物菌株被应用于植物的转化，即将其转化入此前介绍的重组体载体中，这些土壤细菌菌株包括诸如土壤肿胀菌或者土壤生根菌。
换句话说，当所应用的载体并不包含有T-DNA部分时，电穿孔法、微颗粒轰击法、聚乙烯乙二醇介导的上抬法等等，均可能应用于将重组体质粒导入植物内。
在本发明中的另一个实施例是，在重组体质粒pCaJMT中的JMT基因是被插入到pBI121载体的SmaI位点，该载体带有卡那霉素抗性可选择性基因和CaMV35S启动子，按照植物花浸渍转化的方法，将它们转化入土壤细菌C58C1中。在此之后，将花茎浸泡入供转化用的上述的培养液中，在阴暗处放置过夜，然后进行孵育。从此，开始进行种子的挑选，并且筛查选择出有抵抗力的转化株，然后将这些转化株移植入土壤中，进而获得了第二代的种子。这些获得的种子再次筛查选择出第二代的种子，这些种子却没有出现卡那霉素敏感性的个体，将它们应用于下面的实验中。
首先，为了识别出是否存在外源性的重组基因正确的插入，应用JMT基因作为探针，进行了基因组的Southern印记杂交分析。其中的结果是，在野生型的植株中，一个在阿布属最先起源的、带有大约是6.5千碱基对长度基因被识别出来，而在转化株中，则进一步观察到了两个分别带有大约2.0和0.7个千碱基对长度的DNA片段。这可以被看作是，起源于JMT基因、应用于转化的DNA片段(出现在启动子上游HindIII位点以及在下游的蛋白编码位点)。仅仅作为探针出现在重组基因中，再一次以CaMV35S启动子位点进行了杂交。结果，这是可以被识别的，即只有在转化株中包含有这种预料之中的、带有长度大约2.0个千碱基对的基因序列，因而，一个重组基因已稳定地插入到了转化株中。
更进一步的是，是否转基因阿布属可以过量表达JMT基因，或者不能够采用Northern印记杂交分析法加以确定。其结果是，可以确定仅仅在转化株中表达JMT基因，而且显著地、始终如一地表达大量的基因，这包括与抵抗力相关的AOS，JR2，LOXII，VSP等等的基因，当植物在应用JA或者JAMe进行外部处理时，这些基因便被诱导。这就表明通过转化入植物体内的JMT基因的表达所诱导的效应，与通过应用JA或者JAMe进行外部处理加以诱导的效应是相似的。
依照本发明中的另一个实施例，将由病原体引起的灰色铸斑样腐烂病嫁接到上述的转基因植株上。已经证实的结果是，在嫁接后的大约48小时，野生型的植株全部死亡，而转化株实质上没有发生任何的变化。但是，假如病原体是属于Phytium类的，也已经有报道指出，即使应用JA处理到了130μM浓度的水平上，对于病原体的生长也是没有作用的(Vijayan等.，Proc.Natl.Acad.Sci.957209-7214，1998)。因此，可以得出一种理论，即JMT基因的转化株所表现出的那种抗病原体的抵抗力，也就是由JMT酶诱导各种各样的抵抗力相关基因的表达，进而产生JAMe，而不是提高在植物体内直接合成JAMe，来抑制病原体的生长。因而，通过JMT基因的转化而来的转基因植物，所出现的各种各样的、由JAMe而来的、与防护相关基因的稳定表达的事实显示JMT基因能够被应用于提供一种广谱的、抗植物病原体的、有害昆虫的以及植物体内抗多种外界不利因素的抵抗力。
本发明的另外一个实施例中，应用JMT转化的、上述转基因阿布属，当接触到细菌性的植物病原体、病毒以及有害昆虫时，会表现出一种恒定的抵抗力。
依照本发明更进一步的实施例，包括水稻、烟草、马铃薯、柑橘类、西瓜、黄瓜等等的各种各样的植物，均可以应用JMT基因的重组体进行转化，然后应用各种各样的植物病原体进行处理，这些植物病原体包括引起枯萎的生物体、烟草镶嵌病毒(TMV)、马铃薯晚期枯萎症的病原体、柑橘类灰色铸斑性腐烂症的病原体、西瓜类镰刀菌属枯萎症的病原体、黄瓜的绒毛样霉菌等等，以及各种的有害昆虫。然而，所有的应用重组JMT基因转化来的转基因植物，均能够表现出恒定的抵抗力。
本项发明中的另外一个实施例是，应用JMT转化的、上面所提及的转基因阿布属，还检测出了它对干旱的抗性、对盐的抗性和对寒冷的抗性。其结果是，与未经过转化的野生型植物相比，我们发现了在转基因植物能够恒定表现出一种明显的抵抗力。因此，可以看出由茉莉酮酸羧基甲基转移酶的基因转化的转基因植物，能够呈现出抵抗各种外界不利因素的抵抗力，这些外界的不利因素包括低温、水的缺乏、高盐浓度等等，此外还包括能够抵抗各种各样的由植物病原体和有害昆虫所造成损害的抵抗力。
更进一步讲，就一般的生长特征上来看，应用JMT基因转化的植物，与未经过转化的野生型植物相比，并没有出现明显的差异。
在下面的文字中，将通过所涉及到的例证，对本发明进行详细地描述。使一个在相关科技领域中的有经验的人员，很轻松地理解以下例证中所阐明的本项发明的中心思想，当然更没有限制本项发明应用范围的意图。
例证1.阿布属中茉莉酮酸羧基甲基转移酶基因的克隆试验中应用阿布属thaliana生态型Col-O的种子在温室中进行栽植，然后收集多种组织，快速冷冻于液氮中，在使用之前在-70℃储存。
为分离植物的花卉中所特异性表达的基因，根据已知的方法应用质粒pUC18(Pharmacia，瑞典)从中国卷心菜的花卉中制备cDNA文库(Choi等.，J.Korean Agri.Chem.Soc.36315-319，1993)。然后，根据Chomczynski等(1987)描述的方法从各自的花和叶子中提取总RNA，应用寡脱氧胸苷酸柱层析分离多聚腺苷酸，从中应用逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)合成第一链cDNA探针。分别使用从花和叶子中制备的[32P]-标记的cDNA探针，应用不同的杂交从中国卷心菜花的cDNA文库中筛选仅仅在花卉中特异性表达的c38克隆。然而，因为这个基因仅长416个碱基对，仅发现在中国卷心菜花中特异性表达的部分基因克隆，但是还没有识别出它的功能。
为研究上述基因的特有特点，应用c38克隆作探针在阿布属中筛选类似的基因。筛选阿布属植物的cDNA文库得到的pJMT克隆具有序列ID No.2全长1,476碱基对所表现的氨基酸序列，并且在3’-末端含有连续的13个腺苷和在距5’-末端第15个碱基对处含有一个翻译启动密码子AUG。此外，它从上述翻译启动密码子连续编码序列ID No.3全长1,167个碱基对所表现的389个氨基酸(分子量为43,369)。鉴于这种结构特征，能够指出这种挑选的cDNA克隆就是一个全长cDNA克隆。根据下文中描述的方法显示，作为功能分析的结果，这种克隆是茉莉酮酸羧基甲基转移酶基因，并且命名为pJMT，它的结构被描述在图1中。2000年5月29日在韩国收集培养类型中，在编号KCTC 0794bp下描述了这个克隆pJMT。
为检查上述酶的活性，搜寻了NCBI(国立生物信息中心)基因资料库。结果，JMT基因在碱基水平没有类似适合于在编号AF133052(Ross等.，1999)下SAMT基因产物的基因，但是在氨基酸水平显示与SAMT酶有43％的同源性(见图2)。
例证2.埃菲氏大肠杆菌中重组JMT基因的构建及其大规模的表达。
为了阐明例证1中产生的pJMT克隆的功能，用埃菲氏大肠杆菌表达载体重组这个克隆的编码位置，促使它在埃菲氏大肠杆菌中的大规模表达。作为扩增JMT基因的引物，分别使用第4号ID序列和第5号ID序列所表现的核苷序列作为正义和反义方向进行PCR反应的引物。
进行PCR反应的条件如下把这个基因放在含有10毫摩尔浓度Tris(pH8.3)、50毫摩尔浓度氯化钾和0.8毫摩尔浓度氯化镁的缓冲液中94℃2分钟，然后重复30次循环，每一个反应循环包括94℃变性1分钟、56℃退火1.5分钟和72℃延伸2.5分钟，并且最后进一步在72℃反应10分钟(DNA Thermal Cycler 480，Perkin Elmer)。在2％琼脂糖凝胶中电泳PCR产物的结果，应用Geneclean工具包(BioRad，美国)分离，然后用限制性内切酶EcoRI切开，并且插入先前用同样的限制性内切酶切开的埃菲氏大肠杆菌表达载体pGEX-2T(Pharmacia，瑞典)中(见图3)。这样以来，产生的重组表达载体pGST-JMT就产生了一种在tac启动子控制下JMT基因的氨基末端与GST(谷胱甘肽S-转移酶)羧基末端相结合所形成的融合蛋白。用上面制备的重组质粒转化埃菲氏大肠杆菌BL21，然后再用0.5毫摩尔浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷孵化和治疗来促使其表达。用谷胱甘肽琼脂糖层析和休珀代克斯200柱层析在纯化状态中分离重组蛋白，然后应用SDS-电泳进行纯度分析(见图4)。结果，能够鉴别出在纯化状态中分离出的具有预期大小(分子重量67,000)的重组蛋白GST-JMT。
例证3.重组JMT蛋白酶活性的测定例证2纯化状态中分离的重组酶蛋白作为底物与JA和SAM起反应，然后接受气相色谱分析和质量色谱法以识别合成的JAMe。
把1毫摩尔浓度JA和1毫摩尔浓度SAM放入含有100毫摩尔浓度氯化钾的试管中，与纯化状态中分离的10pmole重组酶蛋白混合，使总反应溶液体积为100微升，然后在20℃下一起反应30分钟。用乙烷基醋酸纤维素提取反应产物，然后用气相色谱分析法分析3微升的乙烷基醋酸纤维素浓缩物。结果，在同样保留时间(11.7分钟)后发现反应产物是标准的JAMe，分子量为224与标准JAMe一模一样(见图5)。上述结果，能够证实cDNA克隆pJMT就是JMT酶的一个基因。
另一种方法，当以应用JA和[14C]SAM作为底物进行酶反应的活性定义为100％如图6所示时，还没有充分地进行应用SA或类似的安息香酸(BA)代替JA作为底物的反应。因此，可以确定纯化状态中分离的JMT酶蛋白能够特异地与JA起反应。
更进一步，在100毫摩尔浓度氯化钾存在的情况下，在20℃把粗的蛋白提取物与作为底物的6.4毫摩尔浓度[14C]SAM和1毫摩尔浓度JA起反应30分钟，然后进行[14C]JAMe产物活性分析。这样以来所获得的结果描述在图7中。正如从图7中所能看到的，在转基因阿布属的粗提取物中[14C]JAMe产物的活性是野生型植物中活性的2倍。
例证4.重组JMT蛋白的酶特征应用SAM和JA作底物，检查底物浓度和反应动力学之间的关系。从这当中，Lineweaver-Burk图获得Km、Vm、Kcat和Kcat/Km，结果列于下面的表1中。
表1.茉莉酮酸羧基甲基转移酶的动力学参数
例证5.应用JMT基因的转基因植物的产物为把JMT基因移植入植物，先把JMT基因重组到适合于植物转化的一个载体中。pBI121载体(ClonTech，美国)具有抗卡那霉素的筛选基因和作为基本启动子的CaMV35S启动子，通过删除pBI121载体中的GUS基因，然后将JMT基因用AflIII酶切后插入pBI121载体的SmaI位点(见图8)，构建重组质粒pCaJMT。应用冻结解冻方法(Holster M.等.，Mol.Gen.Genet.163181-187，1978)把获得的重组质粒导入到土壤细菌C58C1(Koncz和Schell，Mol.Gen.Genet.204383-396，1986)中。
首先，在5ml的YEP(酵母提取物蛋白胨)培养基中，4℃孵化土壤细菌菌株24小时，然后4℃、5,000rpm离心5分钟。在1ml 20毫摩尔浓度氯化钾的溶液中重新悬浮细菌沉淀，并且在其中加入大约1微克的上面制备的载体DNA。这个混合物先用液氮处理5分钟，再37℃另外5分钟，然后再添加1毫升的YEP培养基。细菌菌株在28℃进行孵化2-4小时后收集，然后再在含有庆大霉素(25μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的YEP培养基中28℃孵化2-3天，仅仅挑选用pCaJMT转化的菌株。
把挑选的菌株转化到阿布属植物。应用公认的土壤细菌介导的植物蘸湿方法(Clough和Bent，Plant J.16735-743，1998)进行转基因植物的生产。在含抗生素的YEP培养基中过夜孵化土壤细菌，离心、然后悬浮在添加0.05％Silwet L-77(Lehle Seeds，美国)使OD600＝0.8的MS培养基中。颠倒开始长出花的阿布属的花柄浸入到这种悬浮液15分钟，然后排除水分后在凉爽的隐蔽处立起过夜。第二天，把植物转移到孵化室，然后孵化获得种子。再一次在卡那霉素的培养基中使种子发育，并且筛选获得表现耐卡那霉素的转化株，然后将此转化株移植到土壤得到第二代种子。再一次在卡那霉素的培养基中筛选获得的种子，挑选出第二代种子，与纯化的二倍体一样，这个第二代种子不生产卡那霉素敏感个体，用于随后的试验。
为了鉴别是否正确地插入了这个重组基因，进行基因组的Southern印迹杂交分析。首先，从转基因的和野生型的植物中分离出基因组的DNAs，用限制性内切酶HindIII酶切后，在0.8％的琼脂糖凝胶中电泳。把凝胶压在滤膜上，然后用JMT基因作探针杂交滤膜，并且在X-线胶片上感光。结果，在野生型植物中发现了一个长度大约为6.5千碱基对的基因，它最初存在于阿布属中，然而在转化株中除观察到了原始基因外，还进一步观察到了一个由大约2.0千碱基对和0.7千碱基对片段所组成的基因(HindIII位点存在于启动子的上游和蛋白编码位点的下游)。冲洗同一张胶片，仅在用作探针的重组基因中存在的CaMV启动子进行杂交后，在X-线胶片上感光。结果发现，重组基因能够稳定地插入到转化株，因为仅有转化株显示有一个大约长2.0千碱基对的基因位点。
例证6.鉴定JMT基因在转基因植物中的表达为了鉴定转基因阿布属是否过度表达JMT基因，进行了Northern印迹斑点分析。
首先，应用一步RNA分离法(Chomczynski，AnalyticalBiochemistry 62156-159，1987)处理发现有JMT基因的转基因阿布属的叶子组织，提取总RNA。具体地做法是，在液氮中把2-5g的阿布属叶子组织磨成细细的粉末，然后用10ml的TRI-试剂(Sigma，美国)剧烈震荡10秒钟，置于冰上15分钟。然后，加入2ml的氯仿，充分混合在一起。将混合物在室温下放置15分钟，然后在4℃，以每分钟3000转离心20分钟。收集上清液，并在上清中加入10毫升的异丙醇。室温下沉淀混合物10分钟，然后再以10,000Xg离心20分钟。离心后，废弃上清液，用75％的乙醇洗涤分离沉淀RNA后，将RNA溶解在DEPC-水处理过的蒸馏水中，通过测定OD260和OD280的光密度值进行定量分析，然后储存在-70℃备用。
上述分离的30微克的总RNA浓缩成终体积4.5微升，然后通过按1∶1.8∶5的比例加入10xMOPS
、甲酰胺和甲醛，调整总体积为20微升。最后所得的混合物在65℃热处理15分钟以便松开二级结构，用2微升的甲酰胺凝胶装载缓冲液(50％甘油，1毫摩尔浓度EDTA(pH8.)，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF)充分混合后，在含有甲醛(2.2M)的1.5％琼脂糖凝胶中以4V/cm的速率慢慢电泳。
开发的RNA浸入用DEPC处理的水中大约1小时去除甲醛，然后用一种毛细转移方法将它转移到尼龙膜(Hybond-N，Amersham)上16小时以上，并且用紫外线(254nm，0.18J/Sq·cm2)固定，以备杂交时使用。使用一个随机引物标记工具包(Boehringer Manheim)用[α-32P]dCTP标记JMT基因，然后把它作为探针进行杂交。把预杂交溶液(5xSCC，5xDenhardt’s试剂，0.1％SDS，100微克/毫升变性鲑鱼精DNA)加到RNA完全结合的尼龙膜上，在烤箱中65℃杂交2小时。然后，在沸水中变性标记探针5分钟，加入预杂交溶液，反应18小时。第二天，在2xSCC、0.1％SDS中室温漂洗尼龙膜10分钟，再在0.2xSCC、0.1％SDS中漂洗20分钟，然后当用盖氏计量器测定信号时，升高温度至65℃冲洗。冲洗完成后，用包覆盖尼龙膜，用X-线胶片包好，然后在-70℃感光。
结果如图10所见，发现转基因阿布属过度表达JMT基因。正如例证5中基因组斑点中所见，尽管阿布属天然含有JMT基因，但是这个基因仅仅特异地表达在花卉中而在叶子中不表达，与Northern印迹斑点分析指示的一样。然而，移植的外源性重组JMT基因则通过用CaMV35S启动子重组这个基因而在整个植物体中均一表达。
进一步，也检查了JA或JAMe在外表处理植物时所诱导的基因的表达，这些基因包括AOS，JR2，JR3，DAHP，LOXII，VSP等。结果发现，这些基因在用JMT基因转化的转基因植物中一直表达(见图10)。这提示，当把JMT基因移植入植物所诱导的表达效果与外表应用JA或JAMe处理所诱导的表达效果相似。
例证7.转基因植物对真菌疾病抵抗力的鉴定用灰色铸斑腐烂病的病原体注射JMT基因转化的转基因阿布属，研究在植物体中JMT基因对真菌病原体抵抗力的影响。先培养每个转基因的和野生型的阿布属7周，然后把107/ml浓度的病原菌的孢子喷洒在它们的叶子上。结果发现，约48小时后野生型植物全部死亡，而转基因植物实质上没有发生任何改变(见图11)。在病原体属于Phytium属的情况下，已经报道即使用130微摩尔浓度的茉莉酮酸处理也不会对病原体的生长有影响(Vijayan等.，Proc.Natl.Acad.Sci.957209-7214，1998)。这个结果表明，JMT基因转化的转基因植物对病原体产生抵抗力的原因是，转基因植物持续表达JA和JAMe诱导的多种多样的与抵抗力有关的基因，而不是植物体中合成的JAMe直接抑制病原体的生长。然而，鉴于它们的整体生长特性，转基因植物和非转化的野生型植物之间没有发生明显的不同。
例证8.转基因植物对细菌性疾病抵抗力的研究用细菌性黑斑病的病原体(Pseudomonas syringae pv tomatoCD3000)注射JMT基因转化的转基因阿布属，在植物体中研究JMT基因对细菌病原体抵抗力的影响。先培养每个转基因的和野生型的阿布属7周，然后把107/ml浓度的Pseudomonas syringae pv tomatoCD3000的细胞喷洒在它们的叶子上。结果发现，3天后野生型植物开始从叶子边缘发生透明的黄色损伤，而持续表达JMT基因的转基因植物则仅在叶子边缘发生了轻微的损伤(见表2)。这个结果表明，JMT基因转化的转基因植物对细菌病原体具有抵抗力。
表2.JMT转化的转基因阿布属对细菌性疾病的抵抗力
例证9.转基因植物抵抗病毒性疾病的抵抗力的研究以BCTV(甜菜顶端卷曲病毒)接种用JMT基因转化的转基因阿布属植株，在这些植株体中，研究JMT基因针对病毒性疾病的抵抗力的影响。每一个转基因型的阿布属植株和野生型的阿布属植株培育4周后，在它们的叶片上，利用照射器接种以BCTV克隆转化的土壤细菌。其结果已经证实，4周以后，在野生型植株的叶片上，开始出现卷曲的现象，而在稳定表达JMT基因的转基因植株的叶片上，则没有出现明显的变化(见表3所示)。这个实验结果表明，用JMT基因转化的转基因植物，存在有抵抗病毒性疾病的抵抗力。
表3.用JMT基因转化的转基因阿布属植物的抵抗病毒性疾病的抵抗力。
例证10.转基因植物抵抗有害昆虫的抵抗力的研究以位于网状小房中的20只黑色有翼霉菌样小昆虫接种用JMT基因转化的转基因阿布属植株，在这些植株体中，研究JMT基因针对有害昆虫产生的抵抗力的影响。每一个转基因型的阿布属植株和野生型的阿布属植株培育6周后，以位于网状小房中的20只黑色有翼霉菌样小昆虫进行接种。其结果已经证实，4周以后，这些小昆虫吃食了野生型植株的大多数叶片，而在稳定表达JMT基因的转基因植株的每一个叶片上，却没有出现明显的损伤(见表4所示)。这个实验结果表明，用JMT基因转化的转基因植物，存在有抵抗有害昆虫的抵抗力。
表4.用JMT基因转化的转基因阿布属植物的抵抗有害昆虫的抵抗力。
例证11.转基因水稻类植物抵抗枯萎病的抵抗力的研究以水稻枯萎病的病原体(Magnaporthe grisea)接种用JMT基因转化的转基因水稻植株，在水稻植株体中，研究JMT基因针对病原体产生的抵抗力的影响。每一个转基因型的水稻植株和野生型的水稻类植株培育10周后，以喷洒的形式接种106/ml浓度的Magnaporthegrisea孢子，在相对湿度为100％以及温度为25℃的条件下放置过夜，然后在植物孵育器中进行培养。其结果已经证实，5天以后，在野生型植株的每一个叶片上，出现了5-10个褐色斑点，其中所计算出的损伤面积大约占80％，而在稳定表达JMT基因的转基因植株的每一个叶片上，仅仅出现了2的褐色斑点(见表5所示)。这个实验结果表明，用JMT基因转化的转基因水稻类植物，存在有抵抗枯萎病的抵抗力。
表5.用JMT基因转化的转基因水稻类植物的抵抗枯萎性疾病的抵抗力。
例证12.转基因烟草植物抵抗烟草镶嵌病的抵抗力的研究以烟草镶嵌病毒(TMV)接种用JMT基因转化的转基因烟草植株，在烟草植株体中，研究JMT基因针对病毒病原体产生的抵抗力的影响。每一个转基因型的烟草植株和野生型的烟草植株培育10周后，在它们的叶片上与碳化硅一起接种烟草镶嵌病毒。其结果已经证实，一周以后，在野生型植株的每一个叶片上，出现了50-100个褐色斑点，而在稳定表达JMT基因的转基因植株的每一个叶片上，仅仅出现了少于10的褐色斑点(见表6所示)。这个实验结果表明，用JMT基因转化的转基因烟草植物，存在有烟草镶嵌病毒症的抵抗力。
表6.用JMT基因转化的转基因烟草植物的抵抗烟草镶嵌病毒的抵抗力。
例证13.转基因马铃薯植物抵抗Phytophthora infestans病的抵抗力的研究以晚期枯萎病的病原体(Phytophthora infestans)接种用JMT基因转化的转基因马铃薯植物，在马铃薯植物体中，研究JMT基因针对真菌类病原体产生的抵抗力的影响。在每一个转基因型的柑橘类植株和野生型的柑橘类植株的上，均以喷洒接种了浓度为107/ml的Phytophthora ibfestans的孢子。其结果已经证实，一周以后，在野生型植株的每一个叶片上，出现了50-100个褐色斑点，而在稳定表达JMT基因的转基因植株的每一个叶片上，仅仅出现了少于10的褐色斑点(见表7所示)。这个实验结果表明，用JMT基因转化的转基因马铃薯植物，存在有抵抗晚期枯萎病的抵抗力。
表7.用JMT基因转化的转基因马铃薯植物的抵抗晚期枯萎病的抵抗力。
例证14.转基因柑橘类植物抵抗灰色铸斑样腐烂病的抵抗力的研究以灰色铸斑样腐烂病的病原体(葡萄孢属cinerea)接种用JMT基因转化的转基因柑橘类植物，在这类植物体中，研究JMT基因针对真菌类病原体产生的抵抗力的影响。在每一个转基因型的柑橘类植株和野生型的柑橘类植株的果实上，均喷洒接种了浓度为107/ml的葡萄孢属cinerea的孢子。其结果已经证实，一周以后，在野生型植株的果实表面已完全覆盖了灰色铸斑，而在稳定表达JMT基因的转基因植株的果实表面，仅仅很少见地出现一个或者二个小的真菌菌落(见表8所示)。这个实验结果表明，用JMT基因转化的转基因柑橘类植物，存在有抵抗灰色铸斑样腐烂病的病原体的抵抗力。
表8.用JMT基因转化的转基因柑橘类植物的抵抗灰色铸斑样腐烂病的抵抗力。
例证15.转基因西瓜对Fusarium枯萎病的抵抗力的研究以Fusarium枯萎病的病原体(镰刀菌属oxysporum)接种用JMT基因转化的转基因西瓜，在植物体中研究JMT基因对Fusarium枯萎病的病原体产生抵抗的影响。悬浮镰刀菌属oxysporum孢子，浓度为107/ml，并且与土壤混在一起，然后把西瓜植物的秧苗移植到土壤。结果发现，3周后野生型植物发生了茎的分裂和根的腐烂，而持续表达JMT基因的转基因植物则仅仅发生了轻微的病变，但是看起来相对正常(见表9)。这个结果表明，用JMT基因转化的转基因西瓜植物对西瓜的Fusarium枯萎病具有抵抗力。
表9.用JMT转化的转基因西瓜对Fusarium枯萎病的抵抗
例证16.转基因黄瓜对霜霉病的抵抗力的研究以粉末样霉菌的病原体(粉末样霉属cubensis)接种用JMT基因转化的转基因黄瓜植物，在植物体中研究JMT基因对粉末样霉菌病的病原体产生抵抗的影响。把每个转基因的和野生型的黄瓜植物培养10周，然后通过把用粉末样霉菌感染的黄瓜叶子分成2半并且转基因植物的每片叶子以1/2的比率使用接种粉末样霉菌属cubensis。结果发现，2周后野生型植物从叶子边缘开始发生微黄色的褐斑病并且开始变干，而持续表达JMT基因的转基因植物则仅仅发生轻微的褐斑(见表10)。这个结果表明，用JMT基因转化的转基因黄瓜植物对粉末样霉菌病具有抵抗力。
表10.用JMT基因转化的转基因黄瓜对粉末样霉菌病的抵抗力
例证17.转基因阿布属植物对干旱的抵抗力的研究通过停止供水2周，用JMT基因转化的转基因阿布属植物研究JMT基因对植物体的干旱抵抗产生的效应。把每个转基因的和野生型的阿布属植物培养6周，然后停止供水2周。结果发现，即使重新供水，大多数野生型植物还是已经凋谢且逐渐死亡，而持续表达JMT基因的转基因植物则显示出存活率约为65％(见表11)。这个结果表明，用JMT基因转化的转基因植物对水的不利因素有抵抗。
表11.用JMT转化的转基因阿布属植物对干旱的抵抗力
例证18.转基因阿布属植物对盐的抵抗力的研究通过在高盐浓度下培养植物，用JMT基因转化的转基因阿布属植物研究JMT基因对植物体的盐抵抗产生的效应。把每个转基因的和野生型的阿布属植物放在添加了300毫摩尔浓度盐的MS培养基中进行发芽。结果发现，一周后野生型植物没有充分发芽，而持续表达JMT基因的转基因植物则显示出发芽率约为82％(见表12)。这个结果表明，用JMT基因转化的转基因植物对不利的盐浓度有抵抗。
表12.用JMT转化的转基因阿布属植物对盐的抵抗力
例证19.转基因阿布属植物对冷的抵抗力的研究通过低温培养植物，用JMT基因转化的转基因阿布属植物研究JMT基因对植物的冷抵抗产生的效应。把转基因的和野生型的阿布属植物放在4℃冷藏库中一周，然后一周后在23℃对它们的存活率进行分析。结果发现，大多数的野生型植物不能恢复且已经凋谢和逐渐死亡，然而持续表达JMT基因的转基因植物则显示出存活率约为70％，且在健康的状态下相对生长(见表13)。这个结果表明，用JMT基因转化的转基因植物对植物体的不利温度有抵抗。
表13.用JMT转化的转基因阿布属植物对冷的抵抗力
工业适用性本发明中的茉莉酮酸羧基甲基转移酶基因，是一个仅在植物的花中特异性表达的新基因。用一个表达载体转化植物，进行含有上述基因的植物转化，能够得到一个对植物的整体生长特性不产生负面效应，且能够有效地显出对一般的真菌性疾病、细菌性疾病、病毒性疾病或有害昆虫引起的损伤，有高度抵抗力的转基因植物，尤其是水稻植株出现植物枯萎、细菌性的叶片枯萎病、人为的黑穗病和叶蝉；大麦的结痂；玉米的棕褐色斑；豆科的花斑病；马铃薯的花斑病；红胡椒的晚期枯萎病和炭疽病；中国卷心菜和中国萝卜的轻度腐烂、根部结节性疾病和花斑病和卷心菜蝴蝶所造成的损害；芝麻的细菌性的枯萎病；草莓的灰色铸斑样腐烂和枯萎病病；西瓜的镰刀菌属性的枯萎病；西红柿的细菌性的枯萎病；黄瓜的粉末样霉菌病和绒毛样霉菌病；烟草的烟草花斑病；西红柿的镰刀菌属的枯萎病；人参植株的根部腐烂；棉花的多角状的叶斑病；果树如苹果、梨、桃、猕猴桃、葡萄和柑橘类的炭疽病和灰色铸斑样腐烂病；草料农作物，其中包括黑麦草、红色三叶草、果园草、紫花苜蓿等等的粉末样霉菌病和锈斑病；在开花性植株，其中包括蔷薇属、大丁草、康乃馨等等的灰色铸斑样腐烂病和枯萎病；蔷薇属的黑斑病；剑兰和兰花的花斑病；或者是百合花的茎干部腐烂病等等。上述转基因植物也显示出对各种各样的外界不利因素包括低温、水分不足、盐浓度高等有高度的抵抗力。这样以来，因为根据本发明的转基因植物能够对植物疾病显示出高度的抵抗力，并减少农用化学品的使用，所以期望转基因植物能够极大地引起经济作物产量的增加。此外，本发明揭示了在植物对植物病原体和有害昆虫的抵抗中主要涉及JaMe。根据这种结果，未来在发育的植物体抵抗植物病原体和有害昆虫中，期望能够有效地利用根据本项发明的JMT基因和酶蛋白搜寻它的这种新的茉莉酮酸羧基甲基转移酶和基因。
序列表<110>科技基因成果有限公司(Scigen Harvest Co.，Ltd.)<120>用于S-腺苷L-甲硫氨酸茉莉酮酸羧基甲基转移酶的基因以及应用该基因开发抗病原体和抗不利因素植物的方法<130>OPF0154<150>KR2000/32365<151>2000-06-13<160>5<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>1170<212>DNA<213>阿布属thaliana(Arabidopsis thaliana)<400>1atggaggtaa tgcgagttct tcacatgaac aaaggaaacg gggaaacaag ttatgccaag60aactccaccg ctcagagcaa cataatatct ctaggcagaa gagtaatgga cgaggccttg120aagaagttaa tgatgagcaa ttcagagatt tcgagcattg gaatcgccga cttaggctgc180tcctccggtc cgaacagtct cttgtccatc tccaacatag ttgacacgat ccacaacttg240tgtcctgacc tcgaccgtcc agtccctgag ctcagagtct ctctcaacga cctccctagc300aatgacttca actacatatg tgcttctttg ccagagtttt acgaccgggt taataataac360aaggagggtt tagggttcgg tcgtggagga ggagaatcgt gttttgtgtc ggccgtccca420ggttcgttct acggacgttt gtttcctcgc cggagccttc actttgtgca ttcttcttct480agtttacatt ggttgtctca ggttccatgt cgtgaggcgg agaaggaaga caggacaata540acagctgatt tagaaaacat ggggaaaata tacatatcaa agacaagtcc taagagtgca600cataaagctt atgctcttca attccaaact gatttcttgg tttttttgag gtcacgatct660gaggagttgg tcccgggagg ccgaatggtt ttatcgttcc ttggtagaag atcactggat720cccacaaccg aagagagttg ctatcaatgg gaactcctag ctcaagctct tatgtccatg780gccaaagagg gtatcatcga ggaagagaag atcgatgctt tcaacgctcc ttactatgct840gcgagctccg aagagttgaa aatggtgata gagaaagaag ggtcattttc gatcgatagg900
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<221>CDS<222>(15)..(1181)<223>open reading frame for JMT<400>2aaagagagag agagatg gag gta atg cga gtt ctt cac atg aac aaa 47Met Glu Val Met Arg Val Leu His Met Asn Lys1 5 10gga aac ggg gaa aca agt tat gcc aag aac tcc acc gct cag agc aac95Gly Asn Gly Glu Thr Ser Tyr Ala Lys Asn Ser Thr Ala Gln Ser Asn15 20 25ata ata tct cta ggc aga aga gta atg gac gag gcc ttg aag aag tta143Ile Ile Ser Leu Gly Arg Arg Val Met Asp Glu Ala Leu Lys Lys Leu3035 40atg atg agc aat tca gag att tcg agc att gga atc gcc gac tta ggc191Met Met Ser Asn Ser Glu Ile Ser Ser Ile Gly Ile Ala Asp Leu Gly45 5055tgc tcc tcc ggt ccg aac agt ctc ttg tcc atc tcc aac ata gtt gac239Cys Ser Ser Gly Pro Asn Ser Leu Leu Ser Ile Ser Asn Ile Val Asp60 65 7075acg atc cac aac ttg tgt cct gac ctc gac cgt cca gtc cct gag ctc287Thr Ile His Asn Leu Cys Pro Asp Leu Asp Arg Pro Val Pro Glu Leu80 8590aga gtc tct ctc aac gac ctc cct agc aat gac ttc aac tac ata tgt335Arg Val Ser Leu Asn Asp Leu Pro Ser Asn Asp Phe Asn Tyr Ile Cys95100105gct tct ttg cca gag ttt tac gac cgg gtt aat aat aac aag gag ggt383Ala Ser Leu Pro Glu Phe Tyr Asp Arg Val Asn Asn Asn Lys Glu Gly
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<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′primer for PCR of JMT gene<400>4cgcgtccgaa ttcgagagag agagaatgga 30<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3′primer for PCR of JMT gene<400>5tttgaagaat tcacgactaa tgcgtctaca 30
PCT/RO/134表国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约国际表原始保藏存单至崔良焘(CHOI，Yang-Do)(Shinbanpo 7thApt.，301-907，#65-32，Chamwon-dong，Seocho-ku，Seoul 137-030，Republic of Korea)韩国 汉城市
权利要求
1.一种茉莉酮酸羧基甲基转移酶JMT，具有序列ID No.3表达的一种氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的茉莉酮酸羧基甲基转移酶的cDNA基因。
3.根据权利要求2中所述的cDNA基因，包含一种如序列IDNo.1表达的氨基酸序列。
4.根据权利要求3中所述的JMT的cDNA基因，包含有一种序列ID No.2表达的氨基酸序列，(入藏号No.KCTC 0794BP)。
5.一种用于植物的转化重组体载体，包含有权利要求2中所定义的用于茉莉酮酸羧基甲基转移酶的cDNA基因。
6.根据权利要求5所述的用于植物转化的重组体载体pCaJMT，包含有一种cDNA基因，该基因带有一种序列ID No.1表达的核苷酸序列。
7.一种转基因植物，它由上述权利要求5所定义的用于植物转化的重组体载体进行转化，而且该植物具有一种增强的抗植物病原体和有害昆虫、外界的不利因素损伤的抵抗力。
8.一种抗植物病原体和有害昆虫、外界的不利因素损伤的抵抗力的增强方法，包括应用一种用于转化植物的、包含有一种编码茉莉酮酸羧基甲基转移酶的重组体载体，来进行植物的转化。
9.根据权利要求8中所述的方法，编码茉莉酮酸羧基甲基转移酶的基因是权利要求2中所描述的基因。
10.在权利要求9中所述的方法中，编码茉莉酮酸羧基甲基转移酶的基因是权利要求3或4中所描述的基因。
11.根据权利要求8中所述的方法中，其中的由植物病原体和有害的昆虫对植物造成的损害，包括真菌性疾病、细菌性疾病、病毒性疾病或者是由于有害的昆虫造成的损伤。
12.根据权利要求11中所述的方法，其中由植物病原体和有害的昆虫造成的损害是，水稻植株中的植物枯萎、细菌性的叶片枯萎病、人为的黑穗病和叶蝉所致的损伤；大麦的结痂；玉米的棕褐色斑；豆科植株的花斑病；马铃薯的花斑病；红胡椒的晚期枯萎病和炭疽病；中国卷心菜和中国萝卜的轻度腐烂、根部结节性疾病和花斑病和卷心菜蝴蝶所造成的损害；芝麻的细菌性的枯萎病；草莓的灰色铸斑样腐烂和枯萎病病；西瓜的镰刀菌属性的枯萎病；西红柿植株的细菌性的枯萎病；黄瓜植株的粉末样霉菌病和绒毛样霉菌病；烟草的烟草花斑病；西红柿的镰刀菌属的枯萎病；人参的根部腐烂；棉花植株的多角状的叶斑病；果树包括苹果、梨树桃、猕猴桃、葡萄和柑橘类的炭疽病和灰色铸斑样腐烂病；苹果的癌肿病；枣树的“witches”金雀花病；草料农作物植株包括黑麦草植株、红色三叶草植株、果园草植株、紫花苜蓿植株等等的粉末样霉菌病和锈斑病；在开花性植株，包括蔷薇属、非洲菊、康乃馨等的灰色铸斑样腐烂病和枯萎病；蔷薇属的黑斑病；剑兰和兰花的花斑病；或百合花的茎干部腐烂。
13.根据权利要求8中所述的方法，其中的被转化的植物是从一组包括有粮食农作物、蔬菜农作物、特殊用途的农作物、果树、开花类植物和草料类农作物中挑选出来的。
14.根据权利要求13中所述的方法，其中的粮食农作物是从一组包括有水稻植株、小麦、大麦植株、玉米植株、马铃薯植株、红色豆科类植株、燕麦属植株和非洲黍米类植株中挑选出来的；蔬菜农作物是从一组包括有阿布属植株、中国卷心菜、萝卜、红色胡椒、草莓、西红柿、西瓜、黄瓜、卷心菜、瓜类、南瓜、绿色洋葱、洋葱类和胡萝卜中挑选出来的；特殊用途农作物是从一组包括有人参、烟草、棉花植株、芝麻、甘蔗、糖用甜菜、绿色紫苏类、花生和油菜中挑选出来的；果树是从一组包括有苹果树、梨树、枣树、桃树、猕猴桃树、葡萄、柑橘类、柿子树、李子、杏和香蕉中挑选出来的；开花类植物是从一组包括有蔷薇属、剑兰、大丁草、康乃馨、菊花、百合花和郁金香中挑选出来的；以及草料类农作物是从一组包括有黑麦草类、红色三叶草、果园草、紫花苜蓿、高酥油草和多年生黑麦草中挑选出来的。
15.根据权利要求8中所述的方法，其中的抵抗不利因素(stresses)的是指抵抗干旱的、抵抗含盐量和抵抗寒冷。
全文摘要
本发明涉及一种新的S－腺苷－L－蛋氨酸基因，该基因可编码茉莉酮酸羧基甲基转移酶，进而催化合成一种新的茉莉酮酸羧基甲基转移酶蛋白，并且与一种新的由一种含有上述基因的表达性载体进行转化的转基因植物相关。已知上述的酶以茉莉酮酸和S－腺苷蛋氨酸作为底物，可以催化合成茉莉酮酸羧基甲基酯，而且茉莉酮酸羧基甲基酯是一种复杂的产物，它可以介导针对外源侵入的植物病原体微生物和有害昆虫的防御性应答，并且还是一种能够调节植物生长的化合物。通过导入植物体内这种上述的、新型的、可在花朵中特异性表达的酶，可获得了一种能够表现出具有抗植物病原体、抗有害昆虫和抗外界的不利因素的抵抗力的转基因植物，而且这种抵抗力对植物的生长没有任何的副作用。
文档编号C12N15/82GK1503841SQ01813929
公开日2004年6月9日 申请日期2001年6月5日 优先权日2000年6月13日
发明者崔良焘, 郑从柱, 李钟燮, 宋宗泰, 宋尚翼, 徐学洙, 具然钟 申请人:科技基因成果有限公司, 崔良焘