专利名称：细胞级分包括能分化为神经细胞的细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及源于骨髓细胞，脐血细胞或能分化成神经细胞的胚胎肝脏组织以及包含这些细胞的细胞级分(fraction)。这些细胞及细胞级分能用于治疗神经疾病，尤其是自体移植术治疗。
背景技术：
移植少突胶质细胞(即，少突神经胶质)(Archer D.R.，et al.，1994.Exp.Neurol.125268-77；Blakemore W.F.，Crang A.J.，1988.Dev.Neurosci.101-11；Gumpel M.，et al.1987.Ann.New York Acad.Sci.49571-85)或髓鞘-形成细胞，如Schwann细胞(Blakemore W.F.，1977.Nature 26668-9；Blakemore W.F.，Crang A.J.，1988.Dev.Neurosci.101-11；Honmou O.et al.，1996.J.Neurosci.163199-208)或嗅觉鞘-形成细胞(myelin-forming cell)(Franklin R.J.et al.，1996.Glia17217-24；Imaizumi T.et al.，1998.J.Neurosci.18(16)6176-6185；Kato T.et al.，2000.Glia 30209-218)能使模型动物的髓鞘再生及电生理功能恢复。从病人或其他人身上制备这些细胞用于细胞治疗是可能的。然而，因为组织材料必须来自大脑或神经使这种方法存在相当的问题。
源于大脑的神经祖细胞或干细胞，有自我更新能力并可分化成各种神经元及神经胶质细胞谱系(Gage F.H.et al.，1995.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9211879-83；Lois C.，Alvarez-Buylla A.，1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.902074-7；Morshead C.M.et al.，1994.Neuron 131071-82；Reynolds B.A.，Weiss S.，1992.Science 2551707-10)。来自胎儿组织的人类神经干细胞被植入新生鼠脑后分化成神经元及星形细胞(Chalmers-Redman R.M.et al.，1997.Neurosci.761121-8；Moyer M.P.et al.，1997.Transplant.Proc.292040-1；Svendsen C.N.et al.，1997.Exp.Neurol.148135-46)且髓鞘化轴突(myelinate the axon)(FlaxJ.D.et al.，1998.Nat.Biotechnol.161033-9)。有报道称源自成年人脑组织的神经祖(干)细胞植入脱髓鞘的啮齿类动物脊髓，髓鞘再生且恢复神经冲动的传导。
这些研究暗示将上述提及细胞用于神经疾病以便再生的策略是可能的，这引起了人们浓厚的兴趣(Akiyama Y.et al.，2001.Exp.Neurol.；Chalmers-Redman R.M.et al.，1997.Neurosci.761121-8；Moyer M.P.et al.，1997.Transplant.Proc.292040-1；Svendsen C.N.et al.，1997.Exp.Neurol.148135-46；Yandava B.D.et al.，1999.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.967029-34)。然而为建立细胞移植治疗(包括自体移植)而应用这些细胞仍存在问题，如采集方法的建立以及应用营养因素对细胞膨胀(expansion)的要求均有待解决。
根据最近研究揭示神经干细胞在活体内可分化或转化成造血细胞，提示神经祖(干)细胞并不限于神经细胞谱系(Bjornson C.R.et al.，1999.Science 283534-7)。而且，据报道在新生小鼠侧脑室内注入的骨髓间充质细胞可分化成星形细胞(Kopen G.C.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9610711-6)，而且当在合适的细胞培养条件下在体外可分化成神经元(Woodbury D.et al.，2000.J.Neurosci.Res.61364-70)。
发明内容
本发明者已从成年人大脑中分离及培养出神经干细胞并建立了一些细胞系。研究其功能，发明者最近发现神经干细胞是多能的并能自我更新。从成年人大脑获取的单个的神经干细胞膨胀以建立了细胞系。建立的细胞进行体外克隆分析。结果显示细胞系是多能的(即分化成神经元，星形胶质(或星形细胞)，少突神经胶质(即少突胶质细胞)并能自我更新(即增生能力)。这样，可确认这些细胞具有神经干细胞的特征。
在鼠脑缺血或损伤模型中移植这些细胞的确有利于移植物存活，移动并分化。而且，在鼠脊髓脱髓鞘模型中移植这些细胞可形成有功能的髓鞘。这样，在鼠脊髓脱髓鞘模型中这种移植使脱髓鞘的轴突再生髓鞘并恢复神经功能。应用这些细胞进行移植治疗的意义已被组织学，电生理学及行为研究所认可。
从上述发现判断，将患者大脑中采集到的少量神经组织分离并培养出神经干细胞，然后植入患者损伤的脊髓中已是应用广泛的自体移植治疗法。
然而，为了不导致神经损伤，从大脑采集包括神经干细胞在内的组织相对来讲是有创的。所以，鉴于当今有必要建立各种复杂神经系统疾病的治疗方法，建立一种更安全，更简单的自体移植治疗法是很重要的。
所以本发明的目的在于提供治疗神经疾病的有效细胞材料，它们的制备过程会安全简单。本发明的另一目的是提供治疗神经疾病的方法，尤其是应用细胞材料进行自体移植治疗的方法。
考虑到上述情况，本发明者为建立供者细胞将重点放在应用更简单的方法从骨髓中采集骨髓细胞，而不用当今医学传统的神经干细胞采集法。首先，他们从小鼠骨髓中采集骨髓细胞，分离出单核细胞级分，然后将这些级分作为供者细胞植入脊髓脱髓鞘的鼠模型。令人惊奇的是经过治疗后脱髓鞘的轴突髓鞘再生。因此，本发明者揭示从骨髓细胞制备的单核细胞级分有分化为神经细胞的能力。本发明者还发现从单核细胞级分分离出的包括中胚层干细胞，间叶干细胞，基质细胞及AC133-阳性细胞在内的细胞级分均可分化成神经细胞。除了骨髓细胞，这些细胞级分还可从脐血细胞(cord blood cell)中制备。而且，AC133-阳性细胞可从胚胎肝脏组织制备。
这样，本发明者提供了能分化成神经细胞的细胞级分及细胞，它们可从骨髓细胞，脐血细胞及胚胎肝脏组织中分离出来。
在另一实施方案中，这些细胞级分包括具有以下特点的间叶干细胞SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)，和CD45(-)。
在另一实施方案中，这些细胞级分包括具有以下特点的基质细胞Lin(-)，Sca-1(+)，CD10(+)，CD11D(+)，CD44(+)，CD45(+)，CD71(+)，CD90(+)，CD105(+)，CDW123(+)，CD127(+)，CD164(+)，纤连蛋白(+)，ALPH(+)及胶原酶-1(+)。
在另一实施方案中，这些细胞级分包括具有AC133(+)特征的细胞。
另外，本发明提供能分化成神经细胞的细胞，它们包含于上述细胞级分。
而且本发明提供治疗神经疾病的组合物，包括上述单核细胞级分或细胞。依照本发明优选的实施方案，可治疗以下神经疾病中枢及外周脱髓鞘病；中枢及外周退行性病变；脑卒中；脑瘤；大脑高级功能障碍；精神疾病；痴呆；癫痫；外伤性神经疾病及脊髓梗塞。
而且本发明提供治疗神经疾病的方法，包括移植上述单核细胞级分，细胞或组合物。在首选实施方案中，供体细胞来自受体。
本发明提供从骨髓细胞，脐血细胞或胚胎肝脏组织分离的单核细胞成分，这些成分中包含能分化成神经细胞的细胞。本发明提供的细胞级分中的细胞分化成神经细胞究竟是由于所称的造血细胞转化为神经细胞还是由于包含于骨髓细胞等中的能分化成神经细胞的非成熟细胞分化而成尚不清楚。然而，能分化成神经细胞的大多数细胞可能为干细胞或前体细胞，即，细胞具有自我更新能力和多能性。或者这些能分化成神经细胞的细胞是在某种程度上能分化成内胚层或中胚层的干细胞或前体细胞。
本发明细胞级分中的细胞在一些营养因素中不一定扩增(然后在营养因素存在时又能扩增)。所以，这些细胞从神经系统疾病自体移植技术发展的立场来讲是单一且实用的，而且在医学工业中是有益的。通常，本发明的细胞级分源自脊椎动物，优选是哺乳动物(如小鼠，大鼠，人等)本发明的细胞级分可从脊椎动物的骨髓细胞或脐血细胞中制备，将这些细胞的溶液以2,000rpm的速度进行密度-梯度离心，根据比重要有充足的时间以确保分离。然后在1.07到1.1g/ml的比重范围内回收细胞级分。这里的“根据比重要有充足的时间以确保分离”指细胞根据它们的比重在溶液中移动到一个位置的充足时间，有代表性的时间为10到30分钟。细胞级分的比重在1.07到1.08g/ml之间的回收(例如，1.077g/ml)。溶液，如Ficoll及Percoll溶液可用于密度-梯度离心，但不限于此。
特定的，第一步为，将从脊椎动物采集到的骨髓(5到101)溶于溶液中(2ml L-15加3ml Ficoll)，然后2,000rpm离心15min以分离出单核细胞级分(约1ml)。将单核细胞级分溶于培养液(2ml NPBM)以洗涤细胞，再将细胞以2,000rpm速度离心15分钟。然后去除悬浮物留取细胞。除股骨外，本发明获取细胞成分的来源还包括胸骨及组成骨盆的髂骨。只要足够长其他骨亦可。本发明的细胞级分也可从骨髓库或脐血库中的骨髓及脐血细胞中制备。
本发明细胞级分的另一实施方案包括从骨髓细胞或脐血细胞中分离并提纯单核细胞级分，这些骨髓细胞或脐血细胞包括能分化成神经细胞的中胚层(间充质)的干细胞。“中胚层(间充质)干细胞”一词指那些能复制(分裂及增生)成和本身具一样潜能的细胞并能分化成中胚层(间充质)组织的各型细胞。中胚层(间充质)细胞组成的组织在组织学分类属于中胚层，包括血细胞。中胚层(间充质)干细胞包括细胞特征为SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)及CD45(-)。例如，获取包含中胚层(间充质)干细胞在内的细胞级分，可选择具有细胞表面标记的细胞，如SH2，从按上述离心骨髓细胞或脐血细胞获取细胞级分(根据权利要求2的细胞级分)。
此外，包含能分化为神经细胞的中胚层(间充质)干细胞在内的细胞级分可从脊椎动物的骨髓细胞或脐血细胞中制备，将这些细胞的溶液以900G速度进行密度-梯度离心，根据比重要有充足的时间以确保分离。然后在1.07到1.1g/ml的比重范围内回收细胞级分。这里的“根据比重要有充足的时间以确保分离”指相应于细胞在溶液中的比重移动到一个特定位置的充足时间，有代表性的时间为10到30分钟。回收细胞级分的比重依据细胞源自不同动物品种(如，人类，大鼠及小鼠)而变动。用于密度-梯度离心的溶液包括Ficoll及Percoll溶液，但不限于此。
特定的，第一步为，将从脊椎动物采集到的骨髓(25ml)或脐血溶于等体积的PBS溶液中，然后以900G离心10min。沉淀的细胞和PBS溶液混在一起，通过去除血液成分而回收(细胞密度约为4×107细胞/ml)。然后每5ml和Percoll溶液混合(1.073g/ml)，以900G速度离心30分钟以萃取单核细胞级分。萃取的单核细胞级分和培养液混合(DMEM，10％ FBS，1％抗生素-抗真菌溶液)洗涤细胞，以2,000rpm离心15min。最后去除上清留取沉淀细胞，在37℃及5％ CO2大气条件下培养。
本发明细胞级分的另一实施方案为从骨髓细胞或脐血细胞(包括能分化成神经细胞的基质细胞)分离单核细胞级分。例如，基质细胞的特征包括Lin(-)，Sca-1(+)，CD10(+)，CD11D(+)，CD44(+)，CD45(+)，CD71(+)，CD90(+)，CD105(+)，CDW123(+)，CD127(+)，CD164(+)，纤连蛋白(+)，ALPH(+)及胶原酶-1(+)。制备包括基质细胞在内的细胞级分，可从离心的骨髓细胞或脐血细胞中(据权利要求2的细胞级分)获取上述的细胞级分，通过选择具有细胞表面标记的细胞，如上述Lin。
此外，这些细胞级分可从脊椎动物的骨髓细胞或脐血细胞中制备，将这些细胞的溶液以800G密度-梯度离心，根据比重要有充足的时间以确保分离。然后在1.07到1.1g/ml的特定比重范围内回收细胞成分。这里的“根据比重要有充足的时间以确保分离”指在密度-梯度离心中相应于细胞在溶液中的比重移动到一个特定位置的充足时间，有代表性的时间为10到30分钟。回收细胞级分的比重的最适宜范围在1.07t到1.08g/ml(如，1.077g/ml)。用于密度-梯度离心的溶液包括Ficoll及Percoll溶液，但不限于此。
特定的，第一步为，将从脊椎动物采集到的骨髓或脐血溶于等体积的溶液中(PBS，2％ BSA，0.6％柠檬酸钠，and 1％青霉素-链霉素)，然后每5ml和Ficoll+Paque溶液混合(1.077g/ml)并800G离心20min以获取单核细胞级分。单核细胞级分和培养液混合(Alfa MEM，12.5％ FBS，12.5％马血清，0.2％ i-肌糖，20mM叶酸，0.1mM 2-巯基乙醇，2mM L-谷氨酰胺，1μM氢化可的松，1％抗生素-抗真菌溶液)以洗涤细胞。然后以2,000rpm速度离心15分钟，去除上清。采集沉淀细胞在37℃及5％ CO2大气条件下培养。
本发明细胞级分的另一实施方案为从骨髓细胞，脐血细胞或胚胎肝脏组织分离出单核细胞级分，包括特征为AC133(+)能分化为神经细胞的细胞。通过选择具有细胞表面标记的细胞，如上述的AC133(+)，可从离心的骨髓细胞或脐血细胞中(据权利要求2的细胞成分)获取上述的细胞级分。
此外，这些细胞级分可从脊椎动物的胚胎肝脏组织获取，将胚肝组织溶液中2,000rpm密度-梯度离心，根据比重要有充足的时间以确保分离。然后在1.07到1.1g/ml的比重范围内回收细胞级分。从细胞级分中回收特征为AC133(+)的细胞。这里的“根据比重要有充足的时间以确保分离”指在密度-梯度离心中相应于细胞在溶液中的比重移动到一个特定位置的充足时间，有代表性的时间为10到30分钟。用于密度-梯度离心的溶液包括Ficoll及Percoll溶液，但不限于此。
特定的，第一步为，将从脊椎动物采集到的肝脏组织在L-15溶液中清洗，然后在包含0.01％DNaseI，0.25％胰岛素及0.1％胶原酶的L-15溶液中37℃酶处理30分钟。再用吸量管将组织分散成单个的细胞。按实施例1(1)中从股骨制备单核细胞级分那样同样步骤离心单个分散的胚胎肝脏细胞，获取并洗涤细胞，应用AC133抗体从洗涤的细胞中采集AC133(+)细胞。这样即能从胚胎肝脏组织中制备能分化成神经细胞的细胞。应用磁珠或细胞分类器(cell sorter)(FACS等)可得到抗体-基础上回收的AC133(+)细胞。
将包括中胚层干细胞，间叶干细胞，基质细胞或AC133-阳性细胞的任何细胞级分植入脱髓鞘的脊髓均可使髓鞘脱失处髓鞘再生。尤其是将上述包含间叶干细胞的细胞级分植入脑梗塞模型时，可利于植入并分化成包括神经胶质在内的神经谱系中的细胞。
本发明亦提供能分化成神经细胞的细胞，所述细胞包含在上述提及的细胞级分中。这些细胞包括如神经干细胞，中胚层干细胞，间充质干细胞，基质细胞及AC133-阳性细胞，均保含在上述提及的细胞级分中，但不只限这些，只要能分化成神经细胞即可。
本发明也提供治疗神经疾病的组合物，包括本发明的细胞级分或细胞。不经修饰即植入本发明的细胞或细胞级分是可能的。然而，为提高治疗率，植入这些组合物时可结合各种添加剂或导入基因。本发明组合物的制备包括(1)添加物质以提高本发明细胞级分中细胞的增殖率或增强细胞分化成神经细胞，或导入有同样效果的基因；(2)添加物质以提高本发明细胞级分中细胞在损伤的神经组织中的生存力，或导入有同样效果的基因；(3)添加的物质抑制损伤的神经组织对本发明细胞级分中的细胞的不利影响，或导入有同样效果的基因；(4)添加的物质延长供体细胞生命，或导入有同样效果的基因；(5)添加物质以调整细胞周期，或导入有同样效果的基因；(6)添加物质以抑制免疫反应或炎症，或导入有同样效果的基因；(7)添加物质以提高代谢能力，或导入有同样效果的基因；(8)添加物质以改善宿主组织中供体细胞的迁移，或导入有同样效果的基因；(9)添加物质以改善血流(包括诱导血管生成)，或导入有同样效果的基因，但不仅限于这些。
本发明中的细胞级分，细胞及组合物可用于治疗神经系统疾病，包括，如中枢及外周脱髓鞘疾病；中枢及外周退行性病；脑卒中(包括脑梗塞，脑出血及蛛网膜下腔出血)；脑瘤；高级脑功能失调包括痴呆；精神疾病；癫痫，神经系统外伤(包括脑损伤，脑挫裂伤及脊髓损伤)及脊髓梗塞，但不限于此。
根据本发明，源自受体骨髓细胞的细胞可作为供体细胞移植(自体移植治疗)。这有以下优点(1)移植的排斥反应危险性低；(2)应用免疫抑制剂无困难。当自体移植治疗困难时，可应用其他人或动物的细胞。也可用冷冻保存的细胞。供体细胞可能源自脐血。
采集骨髓时可将供体动物(包括人)麻醉(局麻或全麻)，用针穿入胸骨或髂骨，用注射器吸取骨髓。另一种已建立收集脐血的方法为将针穿入刚出生婴儿的脐带中，用注射器抽取血液保存。
细胞植入病人的过程例如，首先用注射器抽取预先贮存在人工脑脊液或生理盐水中的要植入的细胞。然后，手术暴露神经损伤伤口，用针直接将细胞注入损伤处。由于本发明细胞级分中的细胞具有高度游走性，它们可移动到神经组织内。所以，可将细胞植入临近损伤处。而且，将细胞注入脑脊液中亦有效。在这种情况下，病人只需局麻下行腰穿术将细胞注入而无需手术。这样，病人在病房中即可接受治疗(而非手术室)，使本方法有优势。或者，静脉内注射细胞亦有效。这样，移植可通过典型的血液输液进行，优点是病人在病房中即可接受治疗。
而且，由于本发明中细胞级分中的细胞具有高度游走性，它们可作为基因的携带者(载体)。例如，将来可应用细胞作为基因载体治疗各种神经疾病如脑瘤。
附图简述
图1显示的是光学显微镜下所见的脊髓后柱(dorsal column)的横段面，制备成间隔1-mm厚。(A)，正常轴突；(C)损伤的脱髓鞘轴突。后柱高倍放大后的显示(B)正常轴突(D)脱髓鞘轴突。刻度(scale bar)250μm在(A)及(C)；10μm在(B)及(D).
图2显示大鼠脊髓髓鞘再生的缩影照片(A)，移植成年小鼠骨髓细胞后；(C)，移植Schwann细胞后；高倍放大的显微镜照片显示髓鞘再生的轴突(B)，移植骨髓细胞后；(D)，移植Schwann细胞后。刻度(A)及(C)中250μm；(B)及(D)中10μm图3显示电子显微照片，植入骨髓后的后柱髓鞘再生的轴突。应用底物X-Gal处理组织，发现在损伤组织中植入的骨髓细胞包含β-半乳糖苷酶基因(反应产物用箭头标记)。在高倍放大下观察发现基底膜环绕纤维(楔形影标记；刻度1μm)。植入细胞存在大量细胞质和核区域及基底膜提示外周髓鞘形成。
描述发明的优选模式以下，本发明将参照特定实验详尽描述。[实施例1]制备骨髓细胞及Schwann细胞(1)骨髓单核细胞从成年LacZ(β-半乳糖苷酶的结构基因)转基因小鼠(The JacksonLaboratory，Maine，USA)的股骨提取小鼠骨髓细胞(10μl)。采集的样品于含3ml Ficoll的L-15培养基(2ml)中稀释并以2,000rpm速度离心15min。从单核细胞级分中采集细胞，悬于2ml无血清培养基中(NPMM神经祖细胞维持培养基)。离心(2,000rpm，15min)后，去除上清，采集沉淀细胞并重悬于NPMM中。(2)Schwann细胞根据Honmou等的方法(J.Neurosci.，16(10)3199-3208，1996)，从新生小鼠(P1-3)的坐骨神经建立初级Schwann细胞的培养物。具体地说，通过酶及机械处理使细胞脱离坐骨神经。以每平皿8×105个细胞将其铺于100-mm2涂有聚(L-赖氨酸)组织培养平皿中并将细胞培养于Dulbecco’s修饰的Eagle’s培养基中(DMEM)，其内加入10％(vol/vol)胎牛血清。[实施例2]实验动物的制备及移植(1)脱髓鞘大鼠模型的制备实验应用12周的Wistar大鼠。应用X线放射及注射溴化乙锭(EB-X处理)形成后柱局灶脱髓鞘。具体地，用克他命(75mg/kg)及甲苯噻嗪(10mg/kg)i.p.进行麻醉，利用Softex M-150WZ放射线仪器(100kV，1.15mA，SSD 20cm，dose rate 200cGy/min)，通过铅屏蔽(4mm厚)上2×4cm开口，将表面剂量为40 Grays的X线从脊髓尾侧照射到1/10胸椎水平(T-10)。X线放射后的3天，如前麻醉大鼠，于第11胸椎处(T-11)行无菌椎板切除术(laminectomy)。用末端拔出的玻璃微吸管将溴化乙锭(EB)直接注入后柱以形成脱髓鞘损伤。含0.3mg/ml EB的0.5μl盐水注射到0.4及0.7mm的深度。(2)移植可分化或转化成神经谱系的干细胞或祖细胞。
EB注射后3天，从实施例1提取的1μl细胞悬浮液(1×104细胞/μl)注入EB-X诱导的损伤中心。移植后的大鼠用cyclosporin A(10mg/kg/天)行免疫抑制。[实施例3]组织学检查戊巴比妥钠深度麻醉大鼠(60mg/kg，i.p.)，经心脏插管灌注，首先灌注PBS，然后灌注固定剂，其为含2％戊二醛及2％多聚甲醛的Sorensen’s磷酸盐缓冲液，pH7.4。原位固定后10min，小心切除脊髓，切成1mm切片保存于新鲜固定液中。组织在Sorensen’s磷酸盐缓冲液中冲洗数次，在25℃ 1％OsO4中后固定2小时，然后通过浓度逐级升高的乙醇脱水，经环氧丙烷埋入EPON。接着，将组织切成切片(1μm)，用含0.5％亚甲蓝及含0.5％天青II的0.5％的硼砂复染，在光学显微镜下观察(ZeissAxioskop FS)。超薄切片在双氧铀及含铅盐中复染，在60kV下用JEOL JEM1200EX电子显微镜观察(JEOL，Ltd.，Japan)。
形态学分析的细胞取材于靠近最初注射处的脊髓后柱中心50×50μm的标准区。计数本区域中髓鞘再生的轴突及其相连的胞体数量；计算平方微米密度。而且，测量相同标准区的轴突及胞体直径，计数多叶核细胞及有髓鞘形成细胞的数量。每只大鼠测量及计数5张切片，每个实验条件分析5只(n＝5)大鼠。所有差异表现为标准差(±SEM)。
脊髓后柱大多数由有髓轴突组成(图1A，B)。X线对腰部脊髓后柱的放射抑制了内生胶质细胞的增殖。而且，应用核酸螯合剂——溴化乙锭后发现胶质细胞，如少突细胞损伤及局部脱髓鞘。依据本程序产生的损伤特征为几乎所有内生胶质细胞(星形细胞及少突细胞)消失而轴突保留(图1C)。光学显微镜高倍放大观察损伤区发现由脱髓鞘轴突组成的密集区域比肩接踵，其相互之间由存在髓鞘碎片和巨噬细胞的区域相分隔(图1D)。损伤几乎占据后柱整个背腹级分，纵向长达5-7mm。在第6-8周前几乎没有内生Schwann细胞及星形细胞出现。一旦出现，这些胶质细胞便从周边开始侵入损伤区。这样，在体内至少6周内均存在一个脱髓鞘及无胶质(glial-free)的状态。
将LacZ转基因小鼠骨髓细胞(BM)植入免疫抑制及脱髓鞘大鼠模型的损伤中心区3周后，可观察到脱髓鞘轴突大量髓鞘再生(图2A及2B)。贯穿后柱冠状面，遍及损伤前后径(antero-posterior extent)，均可观察到髓鞘再生。图2C及2D显示将异源Schwann细胞(SC)植入EB-X损伤模型后髓鞘再生的模式。值得注意的是移植BM及SC后在髓鞘再生的轴突周围发现了大量胞核及胞质区，这是外周髓鞘质的特点。[实施例4]体内β-半乳糖苷酶反应产物的发现移植后3周，体内发现了表达β-半乳糖苷酶的髓鞘质-形成细胞。采集脊髓并固定于0.5％戊二醛磷酸缓冲液中1小时。切片机切片(100μm)后放于终浓度为1mg/ml的X-Gal(与β-半乳糖苷酶发生反应而显影)显影液(PBS中含35mM K3Fe(CN)6/35mM K4Fe(CN)63H2O/2mM MgCl2)中，37℃，孵育一夜，以使表达β-半乳糖苷酶的髓鞘质-形成细胞在X-Gal存在下胞内显影为蓝色。然后，切片在含3.6％(vol/vol)戊二醛的磷酸盐缓冲液(0.14M)中再固定3小时，在光学显微镜下观察蓝色反应产物(β-半乳糖苷酶反应产物)是否存在。在埋入EPON前，需用1％ OsO4处理组织，逐级系列的乙醇脱水，环氧丙烷中浸泡少量时间。电子显微镜下观察超薄切片无需进一步处理。
电子显微镜下发现大多数源自供体的髓鞘质-形成细胞保留了基底膜(图3楔形阴影标记)。而且，髓鞘质-形成细胞的胞核及胞质相对较多，提示外周神经系统类型的髓鞘形成。
可以确信的是本发明中的损伤模型至少6周内几乎没有少突细胞或Schwann细胞的内生髓鞘再生。而且，电子显微镜水平观察到了含报道基因LacZ的供体细胞，如X-Gal-阳性的供体细胞(图3箭头)。
植入EB-X损伤的骨髓细胞可分化成神经元及胶质细胞，而植入SC则不能。EB-X损伤中5％的lacZ-阳性细胞(移植的骨髓细胞)显示NSE(神经元特异性烯醇化酶)-免疫反应性，3.9％显示GFAP(胶质神经纤维酸蛋白)-免疫反应性。这表明在体内一些骨髓细胞可各自分化成神经元或胶质细胞。
而且，本发明者应用抗体从实施例1(1)获取的细胞级分中分离出特征细胞标记为SH2(+)，SH3(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)及CD45(-)的间叶干细胞。他们进一步发现植入大鼠脊髓脱髓鞘区的细胞导致更有效的髓鞘再生。这也揭示了植入脑梗塞模型大鼠中的细胞顺利存活且分化成神经元或神经细胞及胶质细胞。
另外，本发明者从实施例1(1)获取的细胞级分中分离出细胞表面标记为Lin(-)，Sca-1(+)，CD10(+)，CD11D(+)，CD44(+)，CD45(+)，CD71(+)，CD90(+)，CD105(+)，CDW123(+)，CD127(+)，CD164(+)，纤连蛋白(+)，ALPH(+)及胶原酶-1(+)的基质细胞。大鼠脊髓脱髓鞘区植入的细胞也导致有效地髓鞘再生。
此外，本发明者从实施例1(1)获取的细胞级分中分离出细胞表面标记为AC133(+)的细胞。大鼠脊髓脱髓鞘区植入此细胞也导致有效地髓鞘再生。
而且，本发明者应用以下方法从大鼠胚胎肝脏组织中获取了含AC133-阳性且能分化成神经细胞的细胞级分。首先，采集大鼠胎儿肝脏组织置于L-15溶液中洗涤。然后在含0.01％ DNaseI，0.25％胰岛素及0.1％胶原酶的L-15溶液中，37℃，经酶处理30分钟。球管吸取数次以使组织分散为单个细胞。如实施例1(1)一样(从股骨制备单核细胞级分)离心单个-分散的胚胎肝脏组织以分离单核细胞级分。洗涤获取的单核细胞级分，然后应用抗-AC133抗体回收AC133(+)细胞。应用磁珠或细胞分类器(FACS或其相似者)分离AC133-阳性细胞。大鼠脊髓脱髓鞘区植入AC133-阳性细胞也导致有效地髓鞘再生。
工业实用性如上所述，本发明提供通过收集骨髓源的骨髓细胞，脐血细胞源的细胞或胎儿肝脏源的细胞分离及提纯的单核细胞级分。将这些单核细胞级分植入脱髓鞘的动物模型一定能使脱髓鞘的轴突髓鞘再生。
从骨髓中吸取少量骨髓液分离出用于移植的细胞并在收集后数十分钟内制备以便移植是相对简单的。这样，这些细胞即可成为治疗脱髓鞘疾病的自体移植方法中有用且能再生的细胞材料。
本发明集萃了治疗中枢神经系统脱髓鞘疾病的自体移植方法的发展。而且，正视了本发明在移植及再生治疗对于神经系统更广泛及播散损伤中的作用。换句话说，本发明阐明了针对缺血性脑损伤，外伤性脑损伤，脑退行性疾病及中枢和外周神经系统代谢疾病的自体移植治疗。
根据本发明，造血系统(骨髓或脐血)的细胞被用作供体细胞。这样，在治疗神经系统疾病时，细胞可直接植入血管而非直接植入神经组织。已明确，植入血管的供体细胞可移动到神经组织从而再生神经组织。所以，本发明在非侵入性移植治疗法的发展中是一大突破。
而且，本发明着重补充阐述了非神经细胞，如造血细胞和间充质细胞，分化成神经细胞的机理。当已明确且分析出决定分化的基因后，应用这种基因可以大量非神经细胞，如造血细胞及间充质细胞在活体内有效地转化为神经细胞。这样，本发明是诱导神经系统组织再生的“基因治疗”领域中的一大突破。
权利要求
1.单核细胞级分，其包括能分化成神经细胞的细胞，其中所述级分分离自由脊椎动物采集的骨髓细胞或脐血细胞。
2.权利要求1所述细胞级分，其可如下制备将采集的脊椎动物骨髓细胞或脐血细胞，在溶液中以2,000rpm的速度，进行充足时间的密度-梯度离心，确保按照比重分离，回收比重为1.07到1.1g/ml范围的细胞级分。
3.单核细胞级分，其分离自从脊椎动物采集的骨髓细胞或脐血细胞，其中所述级分包含具有特征为SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD34(-)，和CD45(-)的细胞，并且其能分化成神经细胞。
4.权利要求3所述细胞级分，其可通过从权利要求2的细胞级分中回收具有以下特征的细胞而制备SH2(+)，SH3(+)，SH4(+)，CD29(+)，CD44(+)，CD14(-)，CD 34(-)及CD45(-)。
5.权利要求3所述的细胞级分，其可如下制备将采集的脊椎动物骨髓细胞或脐血细胞，在溶液中以900G进行充足时间的密度-梯度离心，以确保按照比重分离，回收比重为1.07到1.1g/ml范围的细胞级分。
6.单核细胞级分，其包括分离自从脊椎动物采集的骨髓细胞或脐血细胞的细胞，其中所述级分包含具有以下特征的细胞Lin(-)，Sca-1(+)，CD10(+)，CD11D(+)，CD44(+)，CD45(+)，CD71(+)，CD90(+)，CD105(+)，CDW123(+)，CD127(+)，CD164(+)，纤连蛋白(+)，ALPH(+)，和胶原酶-1(+)，所述细胞级分能分化成神经细胞。
7.权利要求6的细胞级分，其可通过从权利要求2的细胞级分中回收以下特征的细胞而得到Lin(-)，Sca-1(+)，CD10(+)，CD11D(+)，CD44(+)，CD45(+)，CD71(+)，CD90(+)，CD105(+)，CDW123(+)，CD127(+)，CD164(+)，纤连蛋白(+)，ALPH(+)及胶原酶-1(+)。
8.权利要求6的细胞级分，其可如下制备将采集的脊椎动物骨髓细胞或脐血细胞，在溶液中以800G速度进行充足时间的密度-梯度离心，以确保按照比重分离，回收比重为1.07到1.1g/ml范围的细胞级分。
9.单核细胞级分，其分离自从脊椎动物采集的骨髓细胞，脐血细胞或胚胎肝脏组织，其中所述级分包括以AC133(+)为特征的细胞，并能分化成神经细胞。
10.权利要求9所述细胞级分，其可如下制备将从脊椎动物采集的骨髓细胞，脐血细胞或胚胎肝脏组织，在溶液中以2,000rpm的速度进行充足时间的密度-梯度离心，以确保按照比重分离，回收比重为1.07到1.1g/ml范围内的细胞级分，然后从所述细胞级分中回收特征为AC133(+)的细胞。
11.能分化成神经细胞的细胞，其包含在权利要求1-10中任何一项所述的细胞级分中。
12.能治疗神经疾病的组合物，其包括权利要求1-10中任一项所述的细胞级分或权利要求11所述的细胞。
13.权利要求12所述的组合物，其中神经疾病选自中枢及外周脱髓鞘疾病；中枢及外周退行性疾病；脑卒中；脑瘤；脑高级功能障碍；精神疾病；癫痫；外伤性神经疾病及脊髓梗塞。
14.治疗神经疾病的方法，包括将权利要求1-10任一项所述的细胞级分，权利要求11所述的细胞或权利要求12所述的组合物移植入受体。
15.权利要求14所述的治疗方法，其中神经疾病可从如下选择中枢及外周脱髓鞘疾病；中枢及外周退行性疾病；脑卒中；脑瘤；脑高级功能障碍；精神疾病；癫痫；外伤性神经疾病及脊髓梗塞。
16.权利要求15所述的治疗方法，其中被移植的细胞源自受体。
全文摘要
采集小鼠骨髓中的骨髓细胞并将分离出的单核细胞级分植入脱髓鞘的大鼠模型，则脱髓鞘的轴突髓鞘再生。
文档编号C12N5/079GK1449439SQ01813933
公开日2003年10月15日 申请日期2001年6月26日 优先权日2000年6月26日
发明者本望修, 端和夫, 上出廷治 申请人:株式会社雷诺再生医学研究所