一种体外诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞方法

专利名称：一种体外诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，涉及神经细胞诱导的方法，具体涉及一种体外诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞方法，尤其涉及嘌呤衍生物(Purmorphamine)诱导01ig2+-GFP+-mES的神经细胞分化的方法及其用途。
背景技术：
脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)是临床常见的外伤性疾患之一。SCI的发生大多源于交通伤、坠落伤或运动伤等，近年呈上升趋势。SCI —旦形成，常常导致严重的行为功能障碍，给患者、家庭和社会带来极大负担。近年来，再生医学给脊髓损伤的治疗带来新的希望。胚胎干细胞(ESC)以其具有很强的增殖和分化能力，可被大量地诱导分化成为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞等优势，成为再生医学移植供体的理想来源。但由于 胚胎干细胞直接移植体内具有形成畸胎瘤的危险，因此应用胚胎干细胞移植治疗脊髓损伤一般先在体外诱导分化出神经前体细胞或神经细胞，然后再移植进脊髓组织，具体而言，目前临床实施胚胎干细胞移植治疗脊髓损伤的过程包括如下两部分一是体外诱导胚胎干细胞分化成为纯度高、数量多、有功能的神经细胞；二是移植到脊髓内的细胞可迁移、增殖以及与宿主组织形成很好的整合，从而发挥功能。当前，胚胎干细胞的体外诱导分化方法中，还存在着诱导分化的细胞纯度低、数量少等问题。神经分化的过程受多种信号通路的调控，其中音渭酸(Sonic hedgehog, SHH)信号通路起着重要的作用。嘌呤衍生物Purmorphamine是小分子化合物，已经被证实能与SHH信号通路中的Smoothened结合，激活SHH信号通路，被认为是SHH的替代物，在发育中起着重要的作用。目前已知，Olig基因是碱性螺旋一环一螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子家族的一员，包括Oligl和01ig2两种，最初被认为是少突胶质细胞或其前体细胞特异性表达的基因而得名；01igl特异性地参与少突胶质细胞的发育，而01ig2早在胚胎8. 5天时少突胶质细胞尚未发生时就已经表达。有研究表明，01ig2在脊髓胚胎发育中，位于腹侧的2/3区域，在SHH(胚胎发育过程中由脊索产生的一种因子)的诱导下早期能促进运动神经元、抑制V2区中间神经元的生成；后期则促进少突胶质细胞，抑制星形胶质细胞的生成，揭示01ig2与其它转录因子的协同作用共同调节神经元和少突胶质细胞的顺序发生。目前，尚未见有关应用Purmorphamine替代SHH,诱导胚胎干细胞分化,获得纯度高、数量多、有功能的脊髓运动神经元和少突胶质细胞，以及Purmorphamine替代SHH,能否引起SHH信号通路、背-腹轴通路、运动神经元和少突胶质细胞发育中相关基因的变化，同时诱导分化的少突胶质前体细胞移植到脊髓损伤组织内，能否与宿主整合，进而迁移、分化来发挥修复损伤的作用的报道。

发明内容
本发明的目的是提供一种诱导神经细胞的方法，具体涉及一种体外诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞方法，尤其涉及嘌呤衍生物(Purmorphamine)诱导01ig2+-GFP+-mES的神经细胞分化的方法。本发明的进一步目的是提供所述的方法在制备修复脊髓损伤的制剂中的用途。本发明采用拟胚体介导的神经诱导法，以01 i g2-GFP+-mES作为细胞模型，利用该细胞系在神经诱导分化过程中表达少突胶质细胞转录因子2 (Oligodendrocytetranscription factor 2, 01ig2)、并能方便观测到绿色突光蛋白(Green FluorescentProtein, GFP)的表达,从而,提供Purmorphamine结合低浓度的全反式维甲酸定向诱导分化为脊髓运动神经元和少突胶质前体细胞的方法。本发明的目的通过下述技术方案实现一、建立 01ig2+-GFP+-mES 细胞模型
在小鼠胚胎干细胞的01ig2基因上转入GFP蛋白建立01ig2+-GFP+-mES细胞模型。采用无血清培养方式，以不同浓度的Purmorphamine诱导拟胚体(EBs),通过细胞培养、免疫细胞化学、FACs和RT-PCR等方法观察其对胚胎干细胞定向分化为脊髓运动神经元和少突胶质细胞的作用。实验结果显示，Purmorphamine可以完全替代SHH促进胚胎干细胞向神经细胞分化；促进01ig2基因的表达；从而促进在EB8D后向脊髓运动神经元分化，分化率超过50%，引起与脊髓运动神经元相关基因的表达变化；促进在EB12D后向少突胶质细胞分化，分化率超过80%，引起与少突胶质细胞相关基因、背-腹轴通路和SHH信号通路相关基因的表达变化。二、建立大鼠脊髓撞击伤模型证实获得的细胞移植后的作用应用NYU-Impactor II建立大鼠脊髓撞击伤模型，将Purmorphamine诱导分化01ig2+-GFP+-mES获得的01ig2+-GFP+-0PC移植到脊髓损伤组织内，通过免疫组织化学、透射电镜、Western blot、行为学和神经电生理等方法观察移植细胞是否促进脊髓功能的恢复，证实获得的细胞移植在脊髓损伤恢复中所起的作用。本发明的实验结果显示，Purmorphamine作为SHH的替代物，能有效地诱导01ig2+-GFP+-mES分化为高纯度、有功能的脊髓运动神经元和少突胶质细胞，并引起相关基因的改变；移植所诱导的01ig2+-GFP+-0PC可以促进大鼠脊髓损伤后功能和形态的部分恢复，从而促进脊髓损伤后再生和功能重建的作用，为临床应用细胞移植治疗脊髓损伤提供一定的实验依据。本发明中，所述的01ig2+-GFP+-mES是利用遗传工程的方法，通过四环素诱导表达系统，在小鼠胚胎干细胞(Mouse embryonic stem cell,mESC)的01ig2基因座上插入GFP制成；其在神经诱导分化过程中，能直观地判断诱导的神经细胞的出现和筛选，也便于细胞移植时，通过观察GFP的表达来确定移植细胞在宿主体内的迁移、分化和增殖等。本发明中，所述的01ig2+-GFP+-0PC是由Purmorphamine诱导分化01ig2+-GFP+-mES 制得。本发明的体外诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞方法，是采用拟胚体介导的神经诱导法，即综合RA诱导法和五步法使01ig2+-GFP+-mES向脊髓的运动神经元和少突胶质细胞分化的方法，其包括以下步骤①将01ig2+-GFP+-mES放入含有白血病抑制因子(LIF，20u/ml)的胚胎干细胞培养基悬浮培养2d ；
②放入含有全反式维甲酸RA (O. 5 μ Μ)和不同浓度Purmorphaine的神经分化培养基中培养4d ；③放入含有bFGF (10ng/ml)的神经分化培养基分别培养2d和6d，采用荧光激活的细胞分选(FACs)筛选01ig2+-GFP+-阳性细胞；④分别在神经元培养基和少突胶质细胞培养基继续培养，诱导生成脊髓运动神经元和少突胶质细胞。本发明方法的步骤④中，所述的在神经元培养基中培养为贴壁培养7 14d ;所述的在少突胶质细胞培养基培养为贴壁培养14d。本发明的方法中,Purmorphamine通过影响SHH信号通路和背-腹轴通路中的相关基因表达，分别通过上调运动神经元和少突胶质细胞的相关基因来诱导01ig2+-GFP+-mES定向分化为脊髓运动神经元和少突胶质细胞；
诱导分化的01ig2+-GFP+_0PC移植到大鼠脊髓撞击伤模型后能够和宿主整合，在宿主体内继续增殖和分化，分化成为成髓鞘的少突胶质细胞，促进神经丝蛋白和髓鞘蛋白的恢复，促进髓鞘再生和神经功能的恢复，显著改善SCI大鼠愈后。本发明的神经细胞分化的方法具有以下优点①嘌呤衍生物Purmorphamine替代SHH,诱导01ig2+-GFP+_mES定向分化为脊髓运动神经元，诱导分化率超过50% ；②嘌呤衍生物Purmorphamine替代SHH，诱导Ol ig2+-GFP+_mES定向分化为少突胶质细胞，诱导分化率超过80% ；③嘌呤衍生物Purmorphamine在01ig2+-GFP+_mES神经诱导分化过程中引起运动神经元和少突胶质细胞相关基因的表达；④嘌呤衍生物Purmorphamine在01ig2+-GFP+_mES神经诱导分化过程中引起SHH信号通路和背-腹轴通路中相关基因的表达；⑤应用NYU脊髓致伤仪,成功构建大鼠脊髓撞击伤模型；⑥诱导得到的01ig2+-GFP+_0PC移植到脊髓损伤模型后，成功在宿主体内进行增殖并分化，分化为少突胶质细胞和神经元，促进髓鞘再生和神经功能的恢复。


图I是本发明中01ig2+-GFP+-mES和MEF的形态图，其中，A C:01ig2+-GFP+-mES在MEF上生长，克隆边缘清晰，结构紧密，隆起生长，细胞间界线不清楚；A bar = 100 μ m ；B bar = 50 μ m ；C bar = 10 μ m ;★示 MEF, ▲示01ig2+-GFP+-mES。图2是本发明中01ig2+-GFP+_mES的免疫荧光鉴定图，其中，AmESC 的 Oct-3/4 和 Sox-I 的共标；B mESC 的 Oct-3/4 和 Sox_2 的共标，bar = 50 μ m ;免疫荧光染色显示，01ig2+-GFP+-mES 细胞克隆的 Oct-3/4、Sox-I 和 Sox_2染色强阳性，而01ig2+-GFP+-mES周围的MEF完全不着色。图3是本发明中01ig2+-GFP+_mES免疫荧光染色的阳性细胞计数分析图，其中，阳性细胞百分率=阳性细胞数/DAPI复染细胞总数。图4表明01ig2+_GFP+_阳性细胞在EB不同阶段的表达，
其中，bar = 50 μ m，不同阶段的EB均有上百个细胞组成，其形态基本为圆球形，表面不光滑；EB2D无01ig2表达，EB6D开始表达01ig2，随着诱导时间延长，01ig2的表达逐渐增多，至EB12D 01ig2表达量最高。图5 表明 Purmorphamine 诱导 01ig2 和 Nestin 的表达，其中，图A EB6D神经球01ig2和Nestin共表达,bar = 100 μ m ;图B :是A图方框中的高倍图，箭头表示“玫瑰花环”的神经管样状，bar = 25 μ m0图6表明免疫细胞化学检测01ig2和Hb9在EB8D的表达，其中，图A:免疫细胞化学检测01ig2和Hb9在不同处理组中的表达，bar =ΙΟΟμπι ;图B :统计直方图显示EB8D，01ig2和Hb9在不同处理组中的阳性细胞表达率；Purmorphamine 组与 SHH 组和 Control 组相比较，林P < O. 01。图7表明免疫细胞化学检测01ig2在神经元不同阶段的表达，·其中，图A 01ig2和Tujl在神经元不同阶段的免疫荧光染色，a :表示神经元前体细胞；b :表示成熟神经元，bar = 100 μ m ;图B :统计直方图显示，01ig2在神经元不同阶段的阳性细胞表达率；神经元前体细胞组与成熟神经元组相比较，< O. 01。图8表明免疫细胞化学检测脊髓运动神经元相关蛋白的表达，其中，图A-a :倒置相差显微镜下观察，bar = 50 μ m ；b :神经元的Hb9阳性表达，bar = 50 μ m ；c :神经元的MNR2阳性表达，bar = 100 μ m ；d :神经元的Isll阳性表达，bar=10 μ m ；e :神经元的01ig2阴性表达，bar = 10 μ m ；f :神经元的Hoxb4阳性表达，bar =ΙΟμπι;图B :统计直方图显示，脊髓运动神经元相关蛋白的阳性表达率。图9表明RT-PCR检测脊髓运动神经元相关基因的表达，其中，图A :PCR产物的2%琼脂糖凝胶电泳；图B :RT_PCR半定量统计图。图10是相差显微镜下01ig2+-GFP+_0PC的形态，其中，a和b :相差显微镜下观察,可见双极或三极的OPC ；c和d分别为a和b的突光相差显微镜下观察；a, c bar = 100 μ m ；b, d bar = 50 μ m。图11是相差显微镜下01ig2+_GFP+_少突胶质谱系的形态，其中，a :可见大量OPC从神经球中迁出，bar = 50 μ m ;b :可见双极的0PC, bar =50 μ m ；c :箭头表示未成熟的少突胶质细胞，bar = 25 μ m ；d :箭头表示成熟少突胶质细胞，bar = 10 μ m。图12是荧光相差显微镜下01ig2+_GFP+_少突胶质谱系的形态，其中，a :可见大量OPC从球中迁出，bar = 50 μ m ；b :可见未成熟的少突胶质细胞，箭头表示未成熟少突胶质细胞，bar = 50 μ m ；c :示成熟的少突胶质细胞,bar = 25 μ m ;d是c方框中的高倍图，箭头表示成熟少突胶质细胞，bar = ΙΟμπι。图13是01ig2+_GFP+_成熟少突胶质细胞的免疫荧光染色，其中，a:少突胶质细胞的01ig2和CNPase共表达，bar = 25 μ m;b :少突胶质细胞的 01ig2 和 GC 共表达，bar = 25 μ m。图14表明星形胶质细胞不表达01ig2 (bar = 25 μ m)。图15是SHH信号通路中相关基因在01ig2+-GFP+_mES神经诱导分化过程中表达，其中，图A :PCR产物的2 %琼脂糖凝胶电泳；图B :统计折线图显示，SHH信号通路中相关基因在神经诱导分化过程中的表达变化。
图16是背-腹轴中的相关基因在01ig2+-GFP+_mES神经诱导分化过程中的表达，其中，图A :PCR产物的2 %琼脂糖凝胶电泳；图B :统计折线图显示，背-腹轴中的相关基因在神经诱导分化过程中的表达变化。图17表明SCI行为学评分，其中，A =BBB评分；B =Tarlov评分；n = 6，与假手术组比较，*P < O. 05。图18表明脊髓后索髓鞘相对光密度值(η = 12，< O. 01)。图19表明移植细胞在SCI后脊髓组织内分化，其中，A :01ig2和GFAP共表达；B :01ig2和NG2共表达，箭头表示移植细胞是少突胶质前体细胞；C 01ig2和MAP2共表达，箭头表示移植细胞和神经元共标；D 01ig2和MBP共表达，箭头表示移植细胞表达MBP，bar = 10 μ m。 图20是脊髓后索髓鞘在移植前后的超微结构，其中，A和B:假手术组，B是A的高倍图，/示致密髓鞘；(和0:细胞移植前(即SCI后7d)，D是C中方框中的高倍图，☆示空泡样变性，▲示小胶质细胞，★示变性的髓鞘，箭头表示无髓鞘轴突；E和F :细胞移植组，*示少突胶质细胞，箭头表示再生的髓鞘结构松散。图21是细胞移植后SCI大鼠的Tarlov和BBB评分图，其中，A :Tarlov评分；B BBB评分，η = 6，I示移植时间，*P < O. 05vs假手术组，▲ P < O. 05vs手术对照组。图22是细胞移植前后SCI大鼠MEP检测图，其中，A :假手术组；B :细胞移植前(即SCI后7d) ；C :细胞移植后lw(即SCI后14d) ；D :细胞移植后2w(即SCI后21d) ；E :细胞移植后4w(SCI后35d) ；F MEP的潜伏期(ms) ；G MEP 的波幅(mv) ;n = 6。
具体实施例方式实施例101ig2+-GFP+-mES的培养和鉴定1，实验所用细胞小鼠(CF-I)胚胎成纤维细胞(MEF)，原代培养；，2，01ig2+-GFP+-mES细胞系由复旦大学长江学者特聘教授张素春教授提供。，3，主要试剂明胶Gelatin、DAPI、DMSO :购自 Sigma (美国)；DME/F12谷氨酰胺、β -巯基乙醇、非必需氨基酸、丙酮酸钠、胰酶-EDTA，胎牛血清(FBS):购自Gibco BRL公司(美国)；6孔和24孔细胞培养板、离心管、巴斯德吸管购自Greiner公司(德国)；突光封片剂购自Vector公司(美国)；小鼠抗0ct-3/4 抗体(Santa Cruz, SC-5279)、山羊抗 Sox2 抗体(R&D，AF2018)、山羊抗 Soxl 抗体(R&D, AF3369)；驴抗山羊荧光Alexa Fluor 594标记IgG 二抗，驴抗小鼠荧光Alexa Fluor 488标记IgG 二抗购自Invitrogen公司(美国)；其它试剂均为进口或国产分析纯试剂。4，主要仪器设备
相差显微镜(Nikon-TS100),突光显微镜(Nikon-Eclipse TE 2000-S),湿度CO2细胞培养箱(Heraus)，超净工作台(苏静集团安森公司)，Milli-Q超纯水制备系统(MiIlipore, D-5623)，离心机(Eppendorf)，液氮罐(Mve)，冻存盒(Nalgene)。5，主要试剂配制表I小鼠胚胎成纤维培养基
试剂名称体积终浓度
DMEM89ml89%
FBSIOml10%· I OOxNonessential Amino acidsI ml1%表2MEF冻存液
试剂名称体积终浓度
DMEM6ml60%
FBS2ml20%
DMSO2ml20%表3胚胎干细胞培养基
_试剂名称__终浓度
DMEM87 ml87%
FBSIOml10%L-glutamine(200mM)+p-ME (55mM)I ml1%
Sodimn Pyruate (IOOmM)I ml1%
I OOxNonessential Amino acids I ml 1% _LJF_0.1 ml_lOQOU/ml表4胚胎干细胞冻存液
_试剂名称_#|R_终浓度
mESC 培养基8ml80%
FBSIml10%
__DMSO _Iml10%6，实验方法I)小鼠胚胎干细胞的培养CF-I系小鼠购于中科院细胞所，将雄性和雌性成年小鼠按I : 2于5:00PM左右合笼，第二天7:30AM前检查阴栓，检栓当日中午记为孕O. 5d，取孕13. 5d小鼠胚胎分离胎鼠成纤维细胞(MEF)。
2)制备MEF饲养层MEF 分离(I)常规处理13. 5d孕鼠，获得胚胎，去除胚胎外组织，用PBS洗胚胎三次；(2)常规处理胚胎组织；(3)将(2)的组织移至15ml离心管中，加入约5ml O. 25%胰酶溶液消化30min后，用MEF培养基终止；1000rpm，离心5min收集细胞；(4)接种细胞按照每只胚胎接种3瓶T25细胞培养瓶的比例接种；(5)接种24h后更换新鲜MEF培养基。细胞汇合至90%时，部分冻存于液氮中，留作种子细胞；部分继续扩增培养(3代以内)，照射后冻存于液氮中，复苏后直接作为饲养层细胞应用。 MEF冻存MEF生长至90%融合的细胞，吸去培养液，PBS清洗，加入O. 25 %胰酶-EDTA消化，用含血清的MEF培养基中止消化，细胞悬液转移至IOml离心管中，IOOOrpm,离心5min ;细胞沉淀用MEF冻存液重悬，移入冻存管，-80°C过夜，次日移入液氮罐中长期保存，冻存的细胞密度为lX106cellS/cm2。MEF复苏从液氮中取出细胞冻存管，浸入37°C水浴锅，使冰晶融化，融化的细胞悬液转移至装有培养液的离心管中，吹打混匀，常温，IOOOrpm,离心5min，细胞沉淀用MEF培养基重悬，细胞密度按照O. 7X105cellS/cm2接种于6孔培养板；第二天更换培养液，去除死细胞，2- 3d即可传代，或制备饲养层。MEF照射MEF传代培养2 4次后，用6ciCo Y处理照射，总剂量达8000rads，灭活其有丝分裂活性，照射后换新鲜的培养液，置37°C平衡至少4h，消化、以I X 106cells/cm2分支冻存于液氮中；使用时MEF需提前复苏，接种至O. I %明胶包被的6孔细胞培养板中即可，细胞密度按照O. 7X105cells/cm2接种。3)01ig2+-GFP+-mES 的培养将01ig2+-GFP+-mES细胞接种在MEF饲养层上，加入mESC培养基，37°C，5% CO2条件下培养，隔日更换培养液，3 4d传代。(I)01ig2+-GFP+-mES 的消化、传代提前Id制备MEF饲养层，于第2d吸去培养液，PBS清洗3次后，加入mESC细胞培养液，37°C培养箱中平衡至少lh，吸去mESCs细胞培养液，PBS清洗3次，加入O. 05%胰酶-EDTAlml，37°C水浴锅中放置5min后，加入培养基终止消化，IOOOrpm,离心5min，以I X 104cells/cm2的密度传代至含有mESC细胞培养液的六孔培养板上，剩余细胞用于EB的神经诱导分化。(2)01ig2+-GFP+-mES 的冻存和复苏胰酶法消化01ig2+-GFP+-mES, IOOOrpm,离心5min后去除上清，加入mESC冻存液制成细胞悬液，装入冻存管，冻存盒中_80°C过夜，次日转移到液氮中长期保存；将冻存管由液氮中取出，浸入37°C水浴锅，当仅剩一小块冰晶时，将冻存管取出，吸出细胞悬液，加入到预先备有9ml mESC细胞培养基的15ml离心管中，轻吹打使细胞混匀；常温，IOOOrpm,离心5min，除去上清液，再重复用培养基洗一次；加入2ml细胞培养基重悬细胞，逐滴接种至预先铺有MEF并平衡后的6孔板中；隔24h后给细胞换液。4)免疫细胞化学染色
体外培养5 7d的01ig2+-GFP+-mES细胞，用免疫荧光细胞化学方法检测细胞表面抗原0ct-3/4、Sox-I、Sox-2的表达，以确定其全能性和未分化性。(I)吸出培养基，用PBS洗3次，；(2)吸出PBS，加入4%多聚甲醛室温固定20min ;(3)吸出固定液，用PBS洗3次，每次IOmin ；(4)加入 O. 3% Triton X-100，室温静置 15min ;PBS 洗 3 次，每次 IOmin ;(5)加入驴血清封闭，室温静置15min ；(6)吸出血清，加入相应的一抗(I 2000抗Oct-3/4+l 2000抗Sox-Ι和抗Sox-2)，4°C冰箱过夜；PBS洗3次，每次IOmin ；
(7)加入驴抗山羊荧光Alexa Fluor 594标记IgG 二抗和驴抗小鼠荧光Alexa Fluor 488 标记 IgG 二抗，室温静置 60min ；(8)加入 DAPI (I 1000 稀释)染细胞核 IOmin ；PBS 洗 3 次，每次 IOmin ；(9)封片剂封片，荧光显微镜下观察、照相。5)阳性细胞计数应用ImageJ软件对拍好的荧光照片进行细胞计数。分别计数DAPI、0ct_3/4、Sox-U Sox-2的阳性细胞数后，进行数据统计。实验数据用均数土标准差(无土《S)表示，用SPSS统计软件进行分析处理，组间比较用t检验。结果显示,如图I所示，原代MEF细胞不纯，除有成纤维样细胞外,还有神经样细胞、心肌细胞以及一些类型不明确的细胞；经过细胞传代后杂细胞迅速减少，传2 3代后细胞成分趋于单一，均为成纤维细胞。经6tlCo Y照射后，细胞失去增殖能力，贴壁培养可维持10 14d，照射后的细胞有序排列呈长梭形或条带状，细胞之间相互接触呈单层排列。细胞质中央为卵圆形核，周边向外伸出纤维状伪足(见图I中女)。作为mESC饲养层的适宜细胞密度为 O. 75X 105cells/cm2。01ig2+-GFP+-mES细胞在小鼠成纤维细胞即饲养层上呈团聚状生长，细胞克隆呈典型集落状生长，呈圆形或椭圆形，克隆边缘清晰、光滑，细胞体积小而排列紧密，呈圆形，核大、核仁清晰，细胞核/细胞质比高。克隆周边与MEF饲养层界限清楚，无分化迹象(见图I中▲)。一般接种2 3d后集落接近汇合状态，需进行传代。传代比例一般为I : 6
I 8。通过对长期培养传代的01ig2+-GFP+-mES定期检测其特异性抗原的表达来鉴定该细胞的全能性、未分化性(如图2所示)，并通过细胞计数其特异性标志物Oct-3/4，Sox-I,Sox-2的阳性率(如图3所示)。统计结果表明01ig2+-GFP+-mES的0ct_3/4，Sox-1, Sox-2的阳性细胞率分别为84. 24±0· 04%,83. 28±0· 04%,85. 18±0· 05%，均超过80%，表明在此培养体系下的01ig2+-GFP+-mES能保持良好的全能性和未分化性。本实施例的结果表明，采用有饲养层的体外培养方式培养01 ig2+-GFP+-mESC，通过对胚胎干细胞相关基因0ct-3/4、Sox-1、Sox-2的检测，发现0ct-3/4、Sox-I、Sox_2的细胞阳性率均超过80%以上，表明该培养体系下的01ig2+-GFP+-mESC维持着未分化的状态，为后续实验提供可信的种子细胞。实施例2Purmorphamine诱导01ig2+-GFP+_mESC定向分化为脊髓运动神经元
I)细胞与实施例I相同。2)主要试剂和用品RA :购自Sigma公司(美国)；N2、B27、Neurobasal 培养基购自 Gibco BRL 公司(美国)；Purmorphamine :购自 Calbiochem 公司(美国)；bFGF、NT3、⑶NF、BDNF, PDGF-AA :购自 R&D 公司(美国)；RNA酶抑制剂、Oligo (dT)、dNTP、DNA聚合酶购自Takara公司(中国大连)；弓丨物上海生工公司合成；M-MLV逆转录试剂盒、Total RNA抽提试剂用Trizol :购自Invitrogen公司(美国)；兔抗Tujl 抗体(Convance, PRB-435P)、小鼠抗 Tujl 抗体(Sigma, T8660)、山羊抗 Hb9 抗体(Santa cruz, SC-22542)、小鼠抗 MNR2 抗体(DHSB，81. 5C10)，兔抗 Isll 抗体(Chemicon, AB5754)，小鼠抗 Hoxb4 抗体(R&D, AF3369)，小鼠抗 Nkx2. 2 抗体(DHSB,74. 5A5),山羊抗 01ig2 抗体(Santa cruz, SC-19969)小鼠抗 Nestin 抗体(Chemicon,MAB353)；驴抗兔荧光Alexa Fluor 594标记IgG 二抗，驴抗小鼠荧光Alexa Fluor 594标记IgG 二抗购自Invitrogen公司(美国)；无RNA酶枪头、离心管购自Axyge公司(美国)；其余用品与实施例I相同。3)主要实验仪器EPICS ALTRA流式细胞仪(Beckman)，PCR仪(Bio-Rad)，紫外凝胶成像分析仪(Syngene)，GS-800光密度扫描仪(BIO-RAD)，恒温冰冻切片机CM1900 (LEICA)，高速台式低温离心机(Eppendorf)，电热恒温箱DHP-9052(上海华进医疗器械有限公司)，Nanodrop2000超微量分光光度计(Thermo)。4)主要试剂配制表5 改良的神经培养基(ModifiedNS Medium, MNS)
权利要求
1.一种体外诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞方法，其特征在于，采用拟胚体介导的神经诱导法，以01ig2-GFP+-mES作为细胞模型，以嘌呤衍生物Purmorphamine结合全反式维甲酸定向诱导所述的01ig2-GFP+-mES细胞分化为脊髓运动神经元和少突胶质前体细胞；包括下述步骤 ①将01ig2+-GFP+-mES放入含有白血病抑制因子LIF的胚胎干细胞培养基悬浮培养2天; ②放入含有全反式维甲酸RA和嘌呤衍生物Purmorphaine的神经分化培养基中培养4天; ③放入含有bFGF的神经分化培养基分别培养2天和6天，采用荧光激活的细胞筛选01ig2+-GFP+-阳性细胞； ④分别在神经元培养基和少突胶质细胞培养基继续培养，诱导生成脊髓运动神经元和少突胶质细胞。
2.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤①的01ig2+-GFP+-mES是利用遗传工程的方法，通过四环素诱导表达系统，在小鼠胚胎干细胞的01ig2基因座上插入GFP制成。
3.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤①的胚胎干细胞培养基中含有白血病抑制因子LIF的浓度为20u/ml。
4.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤②的神经分化培养基中含有全反式维甲酸RA的浓度为O. 5μΜ。
5.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤③的神经分化培养基中bFGF的含量为 10ng/ml。
6.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤④的在神经元培养基中培养为贴壁培养7 14d。
7.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤④的在少突胶质细胞培养基培养为贴壁培养14d。
8.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的01ig2-GFP+-mES细胞分化为脊髓运动神经元，其分化率超过50%。
9.按权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的01ig2-GFP+-mES细胞分化为少突胶质细胞分化，其分化率超过80%。
10.权利要求I所述的方法在用于制备修复脊髓损伤的制剂中的用途。
全文摘要
本发明属于生物医学领域，涉及一种体外诱导胚胎干细胞分化成为神经细胞方法，尤其涉及嘌呤衍生物Purmorphamine诱导Olig2+-GFP+-mES的神经细胞分化的方法及其用途。本发明采用拟胚体介导的神经诱导法，以Olig2-GFP+-mES作为细胞模型，以嘌呤衍生物Purmorphamine结合全反式维甲酸定向诱导所述的Olig2-GFP+-mES细胞分化为脊髓运动神经元和少突胶质前体细胞；经实验证实，所述的Purmorphamine可作为SHH的替代物，有效地诱导Olig2+-GFP+-mES分化为高纯度、有功能的脊髓运动神经元和少突胶质细胞，并引起相关基因表达改变；移植实验结果证实，所诱导的神经细胞能促进大鼠脊髓损伤后功能和形态的部分恢复，具有促进脊髓损伤后再生和功能重建的作用。
文档编号A61P25/00GK102899285SQ20111021742
公开日2013年1月30日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者孙燕, 彭裕文, 张素春, 李瑞锡 申请人:复旦大学