道1为蛋白质marker，泳道2为IPTG诱 导的重组蛋白，泳道3为纯化的酯酶EstZ蛋白。
[0025] 图4.基因工程菌降解高效氯氰菊酯的HPLC色谱图。
[0026] 图5. PA01降解高效氯氰菊酯的HPLC色谱图。
[0027] 图6.高效氯氰菊酯降解产物质谱图中高效氯氰菊酯质谱图。
[0028] 图7.高效氯氰菊酯降解产物质谱图中间苯氧基苯甲酸质谱图。
[0029] 图8.高效氯氰菊酯降解产物质谱图中间苯氧基苯甲醛质谱图。
[0030] 图9.高效氯氰菊酯降解产物质谱图中a_羟基-3-苯氧基苯乙腈质谱图。
[0031] 图10.高效氯氰菊酯降解途径。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对 本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常 规试剂、方法和设备。
[0033] 实施例中使用的微生物来源如下： 大肠杆菌万.cohDH5a购自Gibco公司；转座子菌株万.co/iS17-l(pBT20)华南农 业大学广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室保存；大肠杆菌克隆载体PUCP19 华南农业大学广东省微生物信号与作物病害防控实验室保存；大肠杆菌高表达载体 pET28a(+)-His-Pl华南农业大学广东省微生物信号与作物病害防控实验室保存；表达宿 主菌大肠杆菌万.co/iBL21购自Novagen公司。
[0034] 能够降解含酯键农药的铜绿假单胞菌aer收'ifliosa)菌株PA01已于 2014年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏号是CCTCC M 2014630 ;保 藏地址为湖北省武汉市武汉大学。
[0035] 实施例1酯酶基因湖克隆(见图1) S1.转座子突变体文库的构建 利用转座子mariner随机插入突变的原理，采用双亲株杂交的方法，以铜绿假单胞菌 aer收"ifliosa)菌株PA01和转座子菌株凡co/iS17_l(pBT20)作为亲本进行双 亲接合，将转座子mariner随机插入到PA01基因组后，利用转座子上的庆大霉素抗性基因 和降解过程中产生水解圈与否筛选突变株。通过这种方法获得降解功能缺失的突变株。
[0036] S2. Tail-PCR侧翼序列扩增 根据转座子mariner已知的插入片段序列设计左翼嵌套式特异性引物和右翼嵌套式 特异性引物，结合适合所有物种基因组序列扩增的随机简并引物，采用Tail-PCR (热不对 称交错PCR)技术分别向插入位点两侧扩增，获得未知基因片段后，继续设计引物扩增向两 侧拉长基因，直至获得降解基因的完整序列。通过和基因组序列比对锁定转座子mariner 的插入位点，通过BlastX比对初步确定基因功能。
[0037] S3.酯酶基因的克隆及功能验证 将扩增获得的目的基因序列用DNAStar的Seqman软件进行序列拼接，使用FramePlot 3. Obeta在线软件和CLONE软件分析DNA序列的开放阅读框（ORFs)。使用BLAST在线搜 索分析目的蛋白氨基酸序列，并与蛋白数据库中的已知氨基酸序列进行比对。将目的蛋白 的氨基酸序列通过在线网络资源SMART及其他网络资源进行蛋白质结构域的分析，从而对 目的基因进行功能预测并作图，判断整个降解相关基因的完整序列。通过直接在大肠杆菌 凡c 〇hDH5a中表达降解基因进行功能验证。获得的酯酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1，氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
[0038] 实施例2酯酶基因MdBL21 (pET28a(+))中的高效表达(见图2) S1.酯酶基因的PCR扩增 以正向引物 PI ：GCTCTAGATGCCGGCGCAAATAGCCAT (SEQ ID NO. 3)和反向引物 P2 : CGGAATTCATGTCTTCTCAAAGGGC (SEQ ID NO. 4)为引物，使用PCR方法从铜绿假单胞菌 aer收"ifliosa)菌株PA01的总DNA中扩增出酯酶基因片段。
[0039] PCR扩增体系：
【主权项】
1. 一种能降解含酯键农药的酯酶基因eWZ，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.I 所示。
2. -种能降解含酯键农药的酯酶EstZ，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
3. 含有权利要求1所述酯酶基因的重组克隆载体pUCP19- 其特征在于，将 权利要求1所述酯酶基因核酸片段插入pUCP19的EcoRI和XbaI位点之间所得。
4. 含有权利要求1所述酯酶基因的重组表达载体pET28a(+)-His-Pl，其特征在 于，将权利要求1所述酯酶基因的核酸片段插入pET28a(+)的BamHI和EcoRI位点 之间所得。
5. 含有权利要求1所述酯酶基因刀的基因工程菌。
6. 根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌以大肠杆菌 BL21为出发菌株。
7. 权利要求1所述酯酶基因降解农作物、农产品、土壤或水体中含酯键农药的 应用。
8. 权利要求1所述酯酶基因构建降解含酯键农药的转基因作物中的应用。
9. 权利要求2所述酯酶EstZ在去除农作物、农产品、土壤或水体中含酯键农药残留的 应用。
【专利摘要】本发明公开了一种酯酶基因estZ及其编码的蛋白质和应用。所述酯酶基因estZ全长为1206bp，G + C含量65.2%，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码产物酯酶EstZ含401个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。EstZ能催化降解高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯和嘧菌酯等含有酯键的农药。生产的酶制剂可用于蔬菜、水果、茶叶、棉花、烟草等农产品中的农药残留去除，提高农产品品质及增加附加值。酯酶基因estZ可进一步用于构建转基因作物彻底解决农业生产中农药残留超标问题，生产无公害绿色农产品；也可用于修复农药污染的土壤、水体等自然环境，解决环境污染问题，保护生态环境和人类健康。CCTCC M 201463020141205
【IPC分类】C12N1-21, A62D3-02, C12N9-18, C12N15-55, C12N15-70, B09C1-10, A62D101-04, A01H5-00, C02F3-00, C12R1-19, A62D101-28
【公开号】CN104694558
【申请号】CN201410774237
【发明人】张炼辉, 陈少华, 胡美英, 常长青, 邓音乐
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2014年12月16日