水稻侧根发生控制基因OsHK1及编码的蛋白质的制作方法
【专利说明】水稻侧根发生控制基因OsHKI及编码的蛋白质
[0001]本申请是原申请号为201310372601.0的发明专利申请的分案申请，其申请日为 2013年8月23日，发明名称为“水稻侧根发生控制基因OsHKl及编码的蛋白质”。
技术领域
[0002]本发明涉及水稻侧根发生控制基因，具体涉及水稻侧根发生控制基因OsHKl及编码的蛋白质。
【背景技术】
[0003]植物根系主要可分为直根系和须根系，水稻根系构型为须根系。须根系植物的根系由种子根、不定根和侧根组成，由于庞大的侧根，极大的增加了水稻从外界吸收水分和矿物质的能力。在高等植物中，侧根起始于主根上特定的细胞层一中柱鞘，根据其所背邻的维管组织，可将其分为两种细胞类型:在双子叶植物拟南芥中，侧根起始于临近木质部的中柱鞘细胞；在如水稻、玉米谷类作物中，侧根起始于临近原生韧皮部的中柱鞘细胞。水稻侧根的发育过程与拟南芥比较相似，首先两个临近的中柱鞘细胞进行垂周分裂，继而进行多次的垂周、平周分裂，原基逐渐膨大，并逐步穿过皮层，到最终突破表皮。水稻侧根的发育增强，对水稻生长及高产具有重要意义。如授权公告号为CN102268081的发明专利，就公开了水稻侧根控制基因OsIAAII及编码的蛋白质，该水稻侧根控制基因OsIAAII是从Osiaall突变体中克隆的基因，具有控制水稻侧根发育的功能，可培育出侧根控制功能较好的转基因水稻。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种水稻侧根发生控制基因OsHKl及编码的蛋白质，该控制基因OsHKl及编码的蛋白质可以使水稻对细胞分裂素不敏感，从而选育出控制侧根发生和生长的转基因水稻。
[0005]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:水稻侧根发生控制基因OsHKl，该控制基因OsHKl全长为5964bp(0sHKl基因号:L0C_0s02g50480)，其中CDS长为2994bp，⑶S的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。若⑶S核苷酸序列中在466bp处添加了如SEQ IDNO:3所示的44bp序列，成为突变体Oshkl-1水稻。或者⑶S核苷酸序列中在2923bp处的胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)，成为突变体Oshkl-2水稻。
[0006]本发明的基因改进:核苷酸序列还包括在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列中其它的添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
[0007]水稻侧根发生控制基因OsHKl编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，当控制基因OsHKl的CDS核苷酸序列中在466bp处增加了如SEQ ID NO:3所示的44bp序列时，造成翻译提前终止，编码产物只有如SEQ ID NO:4所示的176个氨基酸，突变的氨基酸位置位于CHASE结构域。当CDS核苷酸序列中在2923bp处的胞嘧啶突变为胸腺嘧啶时，氨基酸序列中975位的脯氨酸替换成了丝氨酸，该位点位于接收域。
[0008]本发明的蛋白质改进:氨基酸序列还包括在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中其它的添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生产的衍生物。
[0009]与现有技术相比，本发明的优点在于水稻侧根发生控制基因OsHKl及编码的蛋白质，控制基因OsHKl全长为5964bp，其中CDS长为2994bp，CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，该控制基因OsHKl中⑶S的添力口、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体，其编码的蛋白质表现为使水稻对细胞分裂素不敏感，而细胞分裂素抑制水稻侧根的发生但促进已生成的侧根的伸长，导致突变体侧根能正常发生，极大的增加了水稻从外界吸收水分和矿物质的能力。通过利用该基因对水稻品种进行转基因改造，因此本发明提供了水稻侧根发育的分子调控机制，并为通过基因工程手段调控水稻根系结构提供了基础。
【附图说明】
[0010]图1为水稻细胞分裂素不敏感突变体Oshkl-1和野生型秀水63在正常条件和0.2 μ M 6-ΒΑ处理7天后的全株照(A)和根部照(B);
图2为基因和编码的蛋白质的结构图和突变位点，图2中，A是基因结构和突变位点(箭头所指)；Β是蛋白质结构和突变方式(箭头所指)，数字代表对应功能域的氨基酸位点；
图3为功能互补实验Tl代转基因水稻的表型(A)和两个回复株系(0V1和0V2)的RT-PCR 检测图(B);
图4为转基因回复载体pCAMBIA-1300的结构示意图。
【具体实施方式】
[0011]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0012]实施例1
本发明人从实验室发展的EMS (ethyl methylsulfonate)诱变的籼稻(Oryza SativaL.ssp japonica)地方品种秀水63和日本晴突变体库中各筛选到一个水稻细胞分裂素不敏感(外源细胞分裂素不抑制侧根发生)突变体Oshkl-1 (⑶S核苷酸序列中在466bp处添加了 44bp序列)和Oshkl-2 (⑶S核苷酸序列中2923bp处的C突变为T)，这两个突变体是符合单基因控制的遗传规律的隐性突变体。在正常条件下突变体与野生型相比无明显表型差异，但对外源施加的细胞分裂素几乎完全不敏感，在0.2μ M 6-ΒΑ处理的条件下，突变体侧根能正常发生，而野生型在同样的条件则不能形成侧根(图1)。本发明人采用基因图位克隆方法分离OsHKl基因。首先创建了一个F2定位群体，由Oshkl突变体为母本，野生型籼稻Kasalath为父本杂交获得的F2中的隐性个体组成。并利用SSR (Simple SequenceRepeats)分子标记对OsHKl位点进行初步定位,粗定位结果表明突变体Oshkl-1和Oshkl-2是等位突变体，突变基因被定位在第2染色体上的标记RM5472和RM250之间，遗传距离分别为1.1cM和8.9cM。根据水稻基因注释信息,该区间有一个水稻细胞分裂素受体OsHKl。我们通过测序和比对发现OsHKl基因发生了突变，该基因DNA全长为5964bp，其中⑶S长为2994bp。OsHKl含有四分结构域，分别为CHASE结构域(细胞分裂素结合区)、两个跨膜结构域、传递域(或称为激酶域，histidine kinase domain)和接收域(receiver domain)。突变体Oshkl-1在⑶S序列的466bp处增加了 44bp，根据预测该突变造成翻译提前终止，编码产物只有176个氨基酸，突变的氨基酸位置位于CHASE结构域；突变体Oshkl-2在CDS序列的2923bp处的胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)，引起所编码的氨基酸序列中975位的脯氨酸替换成了丝氨酸，该位点位于接收域(图2)。为了确证突变体表型是由OsHKl基因突变引起的。我们对突变体进行了转基因回复验证。将由35S启动子驱动的完整的OsHKl⑶S序列(SEQ ID勵:1)克隆到双元植物转基因载体？041^从1300改中。将构建好的回复载体通过农杆菌介导转化突变体Oshkl-1愈伤，经过抗性愈伤诱导进而分化成转基因苗。转化了外源OsHKl基因的突变体(转基因阳性株系)对外源细胞分裂素的响应和野生型一样，侧根发生受