专利名称：一种检测cyp3a4*4基因分型的焦磷酸测序试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及体外核酸检测领域，具体涉及一种检测CYP3A4*4基因分型的焦磷酸测序试剂盒。
背景技术：
CYP3A4基因的全称叫做细胞色素P450同工酶3A4，细胞色素P450 (CytochromeP450, CYP450)是一组含有亚铁血红素蛋白酶系，又称混合功能单加氧酶系统。它主要存在于人类肝脏，对外源物处置以及内源物代谢起重要作用。已发现与药物代谢密切相关的CYP450主要有CYPl 4，其中以CYP3A4亚族最为重要，占人肝脏CYP450总量的30%，主要成员包括CYP3A3、3A4、3A5和3A7，成人肝脏中以3A4为主。CYP3A4参与的药物代谢的种类很多，临床上50%以上的药物代谢都是通过CYP3A4,主要有多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、依托泊苷(etoposide)、伊立替康(irino-tecan)、伊马替尼(imatinib)、长春瑞宾(vinorelbine)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine )等等。编码CYP3A4蛋白的CYP3A4基因位于染色体7q21.3 22. 1，它包含13个外显子和12个内含子的编码区域，长约27kb。自1998年以来，国外学者陆续报道CYP3A4基因存在多态性，根据近几年中国的研究文献报道，在中国人群中被普遍关注的是CYP3A4*4基因，在这个基因中存在一个有意义的SNP位点(A13871G，1118V)，这个点突变主要是一个单碱基突变，突变导致118为氨基酸从异亮氨酸变为颉氨酸。这个改变使得代谢酶的活性降低，减弱了个体对依托泊苷/替尼泊苷药物代谢能力，增强其毒副作用。根据卫生部最新的《医疗检测项目服务管理规范》中，在个体化医疗项目中，就明确提到了检测CYP3A4的意义。目前医院用于CYP3A4*4基因分型检测的“金标准”是PCR-直接测序法，但直接测序法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20%以上的肿瘤组织，对于含〈10%突变细胞的肿瘤组织以及外周血，常规PCR+直接测序法几乎无能为力。相比于直接测序法，焦磷酸测序的灵敏性更高、成本更低。焦磷酸测序(Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序(确定DNA中核苷酸的顺序)方法，是新一代DNA序列分析技术。它是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP,继续DNA链的合成。通过分析出峰情况，达到测定DNA序列的目的。目前市场上还没有利用焦磷酸技术进行CYP3A4*4的基因多态性检测的产品。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种特异性高、成本低、定量、准确检测CYP3A4*4的基因分型的试剂盒。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为
所述检测CYP3A4*4基因分型的焦磷酸测序试剂盒中包括如下引物
正向扩增引物5’ -GTCCAGTGGGATTTATGAAAAGTG-3’ (SEQ ID NO. I)；
反向扩增引物:5，-TTCCATTCTTCATCCTCAGCTATA-3’ (SEQ ID NO. 2)；
测序引物5’ -TTCATCCTCAGCTATAGAGA-3’ (SEQ ID NO. 3)；
其中，正向扩增引物或反向扩增引物中的任意一条引物的5’端进行生物素标记。试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。
进一步地，所述试剂盒中还包括质控品TAYGGTTTGCA (SEQ ID NO. 4) (controloligo)和作为空白对照品的超纯水；质控序列是由QIAGEN设计合成的一段寡聚核苷酸链，用于检测PyroMark Q24测序仪的各项性能指标。进一步地，所示试剂盒中还包括由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶组成的酶混合物，以及由5’ -磷酰硫酸和荧光素组成的底物混合物。进一步地,所述试剂盒中还包括尿喃唳DNA糖基化酶、Taq聚合酶。与现有技术相比，本发明的有益效果为
1)本发明提供的定量检测CYP3A4*4基因分型的焦磷酸测序试剂盒定性准确，具有灵敏性高、特异性强的优点，样品处理简单，测序速度快，高通量，半个小时完成一次上机反应，直接给出检测位点频率分析，结果直观；
2)本发明提供的定量检测CYP3A4*4基因分型的焦磷酸测序试剂盒灵敏度和特异性
闻;
3)本发明提供的定量检测CYP3A4*4基因分型的焦磷酸测序试剂盒检测速度快；
4)本发明提供的定量检测CYP3A4*4基因分型的焦磷酸测序试剂盒步骤简单；
5)本发明提供的定量检测CYP3A4*4基因分型的焦磷酸测序试剂盒可同时进行高通量的样本检测。由于设计了灵敏度高，特异性好的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒能够对CYP3A4*4基因分型进行快速检测。本发明的试剂盒可实时监测反应进程，反应时间短，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简便，反应时间短，高通量，比金标准——毛细管电泳测序灵敏度高，更适合用于突变分析。
图I为临床CYP3A4*4野生型的焦磷酸测序结果 图2为临床CYP3A4*4突变型的焦磷酸测序结果 图3为临床质控品control oligo的焦磷酸测序结果 图4为临床空白对照的焦磷酸测序结果 图5为多组设计引物的凝胶电泳图；图中①、②表明非特异性条带，③表明特异性和片段大小均比较合适，④表明目的带片段大小不对。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例I :试剂盒的制备
1.引物和探针的设计与合成
研究表明目前针对CYP3A4*4基因突变主要集中在13871号碱基中，选择特异的突变位点(表1)，使用PyroMark Assay Design2. O软件,设计并确定了引物(表2),试剂盒中最主要的影响试剂盒的准确性的就是引物，包括扩增引物和测序引物，在设计的初期，我们设计了多组引物进行比较(见图5);其中扩增引物和测序引物先经过PAGE纯化，再经HPLC纯化，其中SEQ ID NO. I所示正向扩增引物的5’端为生物素标记。表I突变位点与类型·
权利要求
1.一种检测CYP3A4*4基因分型的焦磷酸测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的扩增引物，以及如SEQ ID NO. 3所示的测序引物；其中，扩增引物中的任意一条引物的5’端进行生物素标记。
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括如SEQID NO. 4所示的质控品和空白对照品。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述空白对照品为水。
4.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所示试剂盒中还包括由DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶组成的酶混合物，以及由5’ -磷酰硫酸和荧光素组成的底物混合物。
5.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶。
全文摘要
本发明公开了一种检测CYP3A4*4基因型的试剂盒，属于体外核酸检测领域，所述试剂盒包括尿嘧啶DNA糖基化酶、Taq聚合酶、PCR扩增引物以及测序引物；本发明提供的试剂盒灵敏度高，特异性好，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简便，反应时间短，比金标准——毛细管电泳测序灵敏度高，更适合用于突变分析。
文档编号C12Q1/68GK102719555SQ201210250210
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月19日 优先权日2012年7月19日
发明者韩勇 申请人:韩勇