专利名称：用于检测ros1基因融合突变的引物、探针及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种用于检测ROSl基因融合突变的引物、探针及检测试剂盒。
背景技术：
肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率居各癌症之首。每年全世界有超过130万的患者死于肺癌。在我国肺癌死亡率为30. 83/10万，肺癌已经成为我国发病率和死亡率第一位的恶性肿瘤。(Orras JM, Fernandez E, Gonzalez JR, et al. Lungcancer mortality in European regions(1955-1997). Ann Onc ol, 2003，14(I):159)。在发达国家肺癌患者的5年生存率可以达到20%左右，而我国肺癌患者的5年生存率仅为13%，其主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏的基因突变检测和确诊技术，从而使患者无法及时接受科学的治疗方案，进而使患者错失了治疗的最佳时机。目前化疗仍是肺癌主要治疗手段，然而多数化疗会产生较大的毒副作用，不同患者间的化疗效果也会有较大差异。随着肿瘤分子诊断技术的发展，肺癌的分子靶向治疗因其毒副作用低，特异性高，日益成为临床医生首选治疗方式。新融合基因ROSl的发现为肺癌患者提供了新的治疗靶点。ROSl是胰岛素受体家族的一种受体型酪氨酸激酶(ReceptorTyrosine Kinase), ROS I融合首先发现于恶性胶质瘤中，其融合突变发生于6号染色体 q22 区(Birchmeier et al. Proc Natl Acad Sci.87 (12):1990;Charest et al. GenesChromosomes Cancer. 37:58，2003)。ROSl融合包含一个完整的酪氨酸激酶区域，其融合突变会导致细胞下游信号通路的激活，从而影响细胞的生长，增殖和分化。最新的研究表明ROSl是一种新的肿瘤驱动突变基因，其融合在非小细胞肺癌中被定为一种新的分子亚型。临床研究显示小分子祀向药物Crizotinib (克里唑蒂尼，Pfizer)可以特异作用于ROSl基因融合突变，通过抑制ROSl酪氨酸激酶区域的活性，阻断其下游异常信号通路，从而抑制肿瘤细胞的生长。因此，检测ROSl融合突变状态是指导靶向药物Crizotinib用药的前提，在化疗之前通过高灵敏的检测方法检测ROSl融合基因突变对于提高肺癌患者的生存率，延长生存期、避免过度化疗、提高生存质量有着重要意义。目前，可以临床上检测融合基因突变的检测方法主要为实时荧光PCR方法和直接测序法。然而，直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20-30% ;检测操作复杂，效率低，通常要1-2天才可出检测结果。因而，直接测序法无法满足临床检测实际的需求，临床迫切需要开发一种快速融合基因检测方法，以实现采用快速的检测方法对融合突变进行同时检测。目前，还没有ROSl融合基因突变的检测方法和检测试剂盒，本发明首次开发一种快速、操作简便的ROSl融合基因突变检测试剂盒及检测方法。本检测方法可以一次同时检测ROSl基因产生的4种融合突变，检测灵敏度高，检测时间只需90分钟即可完成，同时具备了灵敏度高，廉价快速，操作简单等优点，可以满足临床快速检测的实际需求
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于ROSl基因融合突变检测引物和探针，或与其有同一性核苷酸序列，该检测试剂盒包含以下引物及探针序列表I. ROSl融合突变引物和探针核苷酸序列SL-RO-Ml-Fl GGAGATTGATTTTACTTCTCGGATTTCTCTACSEQID NO 1SR-Ml SL-RO-Ml-Rl CCCTTCTAGTAATTTGGGAATGCCTGGSEQID NO 2SR-M2 SL-R0-M2-R1 CCMCTATAATAGTAAGTATGAAACTTGTTTCTGGTATCC SEQID NO 3 SL-RO-Ml-Pl 5-FAM-CTCCAACCAGCTGGMGGCGCTAC-3-BHQ1 SEQID NO 4CD-R0-M1-F2 GAMTGAGCAGGCACTCCTTGGAGSEQID NO 5CR-M1CD-R0-M1-R1 CCCTTCTAGTAATTTGGGAATGCCTGGSEQID NO 6CR-M2CD-R0-M2-R1 CCMCTATAATAGTAAGTATGAAACTTGTTTCTGGTATCC SEQID NO 7CD-RO-Ml-Pl 5-FAM-CCCACTGACGCTCCACCGAAAG-3-BHQ1SEQID NO 8此处所述的“同一性核苷酸序列”表示在严格条件下(最大严紧性条件下)与靶杂交的寡核苷酸，以及在具有适当的核苷酸插入或缺失情况下进行对比时，在核苷酸的至少约60%的核苷酸相同于上述核苷酸片段。更佳地,为具有80%同一'丨生的核苷酸,最佳地,为具有90%同一'丨生的核苷酸。杂交条件根据杂交时所用条件的严紧性程度来分，严紧性程度可以核酸结合复合物或探针的的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”为Tm-5°C (低于探针Tm 5°C)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10°C 中等严紧性”发生在Tm以下约10-20°C ;低严紧性发生在Tm以下约20-25°C。在本发明中，“同一性”指，两种或以上的序列或亚序列进行比较时，相同或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是根据BLAST或BLAST2. O算法，它们分别在以下文献中公开Altschul等(1977)Nucl. Acid,res. 25:3389-3402 和 Altschul 等(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410.本发明另一方面提供了一种用于检测ROSl基因融合突变检测试剂盒，其PCR反应
扩增体系如下模板4 5
Takara IOXPCR Buffer卜2.5 ^iL
各引物I.O 4,0 pmol
各探针I,O 3.0 pmol
Taqfff0.5 2.0 U
dNTPI 2 mmol
MgCI22 3 mmol
甲酰胺i 2
总体积^本发明另一方面提供了一种用于mRNA反转录cDNA的方法，方法包括反转录体系组成以及如下操作步骤mRNA反转录cDNA体系包括如下成分
5XM-MLV buffer5hL
引物终浓度2 pM
dNTPO. 5mM
M-MLV200U
RNA6
补DEPC水至25PLCa)取逆转录反应混合液18μ 1，M-MLV逆转录酶I μ 1，加入无菌离心管中，混匀。(b)加入待测样品RNA 6 μ 1，RNA总量在O. I 5 μ g范围内，补水至25 μ I。(c ) 42 °C保温I个小时。(d) 95°C保温5分钟后冰上冷却，得到cDNA模板.。本发明再一方面提供一种用于检测ROSl基因融合突变方法，其方法包括以下步骤(I)根据COSMIC数据公布的人类ROSl为野生型基因序列，针对ROSl基因4种融合突变，来设计特异引物和探针。(2)提取检测样本的RNA，检测样本包括新鲜病理组织和石蜡包埋组织。(3)配制实时荧光PCR扩增反应体系。(4)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于等于30 :阴性；Ct值小于30 :阳性。本发明的有益效果是本发明采用了特异引物和探针技术，可以特异检测人类ROSl基因融合突变。此方法(I)建立了实时荧光PCR体系，可同时检测ROSl基因4种融合突变；(2)灵敏度高，10-20拷贝的突变可以检出；(3)操作简单，检测廉价，临床应用范围广；(4)样本检测范围广，样本可以为新鲜病理组织，石蜡包埋组织；(5)检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。
图I为本发明检测质粒PCR图。图2为灵敏度分析试验结果PCR图。图3为检测临床样本突变阳性PCR图。图4为检测临床样本野生型PCR图。
具体实施例方式本发明以基因工程构建的突变质粒为模板，构建ROSl实时荧光PCR扩增反应体 系，以FAM为突变信号检测通道，针对ROSl融合突变4个位点设计特异性探针和引物，通过引物及检测体系的优化实现高灵敏特异检测。检测ROSl基因融合突变的方法包括以下步骤(I)针对突变位点设计合成引物和探针根据COSMIC数据库公布的人类ROSl基因序列为野生型序列，针对ROSl基因4种融合突变来设计特异性引物和探针。通过特异性引物和探针体系优化，实现高灵敏和特异检测，ROSl基因4个融合突变位点见表2。针对选定的4个融合突变位点,应用Premier 6. O引物设计软件设计多对特异引物和多条探针，引物和探针序列如表I所示。表2. ROSl基因融合检测位点
融合名称 SLC34A2/CD74外显子ROSl外显子COSMIC ID 公司命名_
SLC34A2-ROS1 SLC34A2 Exon4P1197 SR-MI
SLC34A2-ROS1 SLC34A2 Exon44/SR-M2CD74-ROS1CD74 Exon61203 CR-M! CD74-ROSI C.D74 Exon6 34 12()1 CR-M2(2 )样本处理与RNA的提取样品处理与RNA的提取样本适用范围包括新鲜肿瘤组织和石蜡包埋组织。新鲜病理组织，取I克左右，使用TIANGEN的RNA提取试剂盒提取其RNA。石蜡包埋组织，使用Qiagen的组织RNA提取试剂盒提取其RNA。上述具体操作步骤按试剂盒说明书操作。(3 )建立PCR扩增反应体系将所提上述RNA溶于O. P/oDEPC水中，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度0D260/0D280为I. 9-2. 1，并读取其含量。取O. Γδ μ g的RNA作为其cDNA合成的模板，采用厦门艾德生物医药科技有限公司的试剂盒合成cDNA，合成cDNA体系如下5 X M-MLV buffer4-5Λ
引物终浓度2 pM
DntpO. SmM
M-MLV200U
RNA6μ
补DEPC水至25HL
应用上述反转录体系按如下步骤进行逆转录Ca)取逆转录反应混合液18μ 1，M-MLV逆转录酶I μ 1，加入无菌离心管中，混匀。(b)加入待测样品RNA 6 μ 1，RNA总量在O. I 5 μ g范围内，补水至25 μ I。(c)42°C保温I个小时。(d) 95°C保温5分钟后冰上冷却，得到cDNA模板.。将上述所得cDNA模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行PCR扩增
模板4 5
Takara IO X PCR BulTcrI 2.5 μL
各引物I.O 4.0 pmol
各探针1.0 3.0 pmol
Taq 酶0. 2.0 LI
dNTPI 2 mmol
MgC 122 3 mmol
甲酰胺I 2%
总体积25 pL实时PCR反应条件是95°C预变性5分钟，I个循环；95°C变性25秒，64°C退火20秒，72°C延伸20秒，15个循环；93°C变性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31个循环。后31个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。(4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准检测FAM荧光信号Ct值，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果检测反应体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于或等于30 :阴性；Ct值小于30 :阳性。以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。
实施例I运用本发明体系检测质粒，实验用质粒模板(含ROSl融合)，利用上述荧光PCR检测ROSl基因融合突变的方法如下( I)质粒处理与提取质粒的提取采用TIANGEN (HighPure Plasmid Kit, DP116)的质粒提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。所提DNA溶于Tris-HCl中(IOmmol/L, PH8. O),经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl (10mmol/L, PH
8.O)溶液调整DNA浓度到2ng/ μ L作为PCR模板，取5 μ L进行PCR反应扩增。(2)建立PCR扩增反应体系将上述所得cDNA模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行 PCR扩增
模扳4 5 μΕ
Takara 10XPCR Buffer I 2‘5 μι 各引物1.0 4.0 pmol
各探针I.O 3.0 pmol
Taqli0.5 2.0 U
dNTPI 2 mmol
M gC I2 3 mmol
甲酰胺I 2%
总体积25 μL实时PCR反应条件是95°C预变性5分钟，I个循环；95°C变性25秒，64°C退火20秒，72°C延伸20秒，15个循环；93°C变性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31个循环。后31个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。(4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准采用MX3000P实时荧光PCR仪进行扩增，在后31个循环退火阶段检测FAM和HEX的荧光信号，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于等于30 :阴性；Ct值小于30 :阳性灵敏度分析取经定量后浓度为1000个拷贝的样品DNA，进行10倍稀释，然后分别对3个浓度进行检测，每次反应加入5μ L DNA。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，10拷贝DNA基因组即可检出，结果如图2。重复性试验每个反应分别加入突变质粒DNA1000拷贝、100拷贝，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值相差不到O. 5个循环。检测结果表明，本发明的检测体系可以准确检测质粒检测ROSl融合突变，检测的灵敏度可达到5-10拷贝。实施例2运用本发明检测临床肺癌石蜡包埋组织样本，取经直接测序法检测确定的ROSl融合阳性4例和11例ROSl野生型样本，利用本发明特异引物和探针荧光PCR体系检测15例临床样本的ROSl融合基因突变步骤如下(I)样本处理与RNA的提取(a)取上述各肺癌样本，分别加入Iml 二甲苯，混匀，室温下14000RPM离心2min,弃上清液，加入Iml无水乙醇到沉淀中，震荡混匀(去除二甲苯)，室温下14000RPM离心2min弃上清液，打开离心管盖，37°C晾干；(b)在离心管中加150 μ I Buffer PKD及10 μ I蛋白酶K，震荡混匀，56°C孵育15min,8CTC孵育 15min,待降到室温后，加入 16ul DNase Booster Buffer 和 IOul DNaseI原液，室温孵育15min，后加入320 μ I Buffer RBC，混匀；(c)往上清液加入720 μ I无水乙醇，混匀，取700 μ I样品包括前面生成的沉淀转移到带有2ml收集管的RNA MinElute离心柱里,大于10，OOOrpm离心15s,弃废液，重复上一步直到样品转移到RNA MinElute离心柱里。 (d)打开盖子加入500 μ I Buffer RPE，盖紧盖子，大于IOOOOrpm离心2min，将柱子转移到收集管中，向吸附膜中间部位滴加14-30 μ I RNase-free water,离心Imin后收集RNA.(2 )建立PCR扩增反应体系将所提上述RNA溶于O. P/oDEPC水中，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度0D260/0D280为I. 9-2. 1，并读取其含量。取O. Γδ μ g的RNA作为其cDNA合成的模板，采用厦门艾德生物医药科技有限公司的试剂盒合成cDNA，cDNA合成体系如下
5XM-MLV buffer 5PL 引物终浓度2 pM
dNTP0.5mM
M-ML\200U
RNA6PL
补DEPC水至25μ 应用上述反转录体系按如下步骤进行逆转录Ca)取逆转录反应混合液18μ 1，M-MLV逆转录酶I μ 1，加入无菌离心管中，混匀。(b)加入待测样品RNA 6 μ 1，RNA总量在O. I 5 μ g范围内，补水至25 μ I。(c ) 42 °C保温I个小时。 (d) 95°C保温5分钟后冰上冷却，得到cDNA模板.。将上述所得cDNA模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行PCR扩增模板5 μ
Takara IOXPCR Buffer2.5 \xL·
各引物1.0 4.0 pmol
各探针I.O 3.0 pmol
Taq 酶0.5 2.0 U
dNTP卜 2 mmol
MgCli2 3 mmol
甲酰胺I 2%
总体积23 μL实时PCR反应条件是95°C预变性5分钟，I个循环；95°C变性25秒，64°C退火20秒，72°C延伸20秒，15个循环；93°C变性25秒，60°C退火35秒，72°C延伸20秒，31个循环。后31个循环在退火时检测FAM和HEX或ROX荧光信号。(4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准检测FAM荧光信号Ct值，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断结果检测反应体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于等于30 :阴性；Ct值小于30 :融合阳性检测结果表明所检测15例肺癌样本中有4例发生有ROSl融合突变，该荧光PCR方法的灵敏度与测序法检测方法的一致率为100%，进一步证明了本发明体系检测的准确性，结果见表3。表3.本发明检测结果与直接测序法比较
权利要求
1.用于检测ROSl融合基因突变的引物、探针，其特征在于，包括以下序列SEQID NOI-SEQID NO 8。
2.用于检测ROSl融合基因突变的试剂盒，其特征在于，包括以下序列SEQID NOI-SEQID NO 8。
3.如权利要求2所述的检测ROSl融合基因突变的检测试剂盒，其特征在于包括如下的荧光PCR的反应体系。
模板4 I pLTakara 10XPCR Buffer I 2.5各引物1.0 4.0 pmol各探针1.0 3.0 pmol Taqfi0.5 2.0 U dNTPI ' -2 inmol MgCl22-3 mmol 甲酰胺I 2% 总休枳25
4.如权利要求2所述的检测ROSl融合基因突变的检测试剂盒，其使用方法包括以下步骤 (I)提取检测样本中的RNA，检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织或胸腔液组织中的RNA ； ⑵RNA反转录cDNA，配制实时荧光PCR扩增反应体系； (3)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于等于30 :阴性；Ct值小于30 :阳性。
5.如权利要求4所述的检测ROSl融合基因突变的检测试剂盒，其特征在于，mRNA反转录cDNA的反应体系为。
5XM-MLV buffer 4-5 PL 引物终浓度2 PMdNTP0.5mMM-MLV200URNA6PL补DEPC水至25PL
6.如权利要求4所述的检测ROSl融合基因突变的检测试剂盒，其特征在于，RNA反转录cDNA包括以下操作步骤 Ca)取逆转录反应混合液18μ 1，M-MLV逆转录酶I μ 1，加入无菌离心管中，混匀。
(b)加入待测样品RNA 6 μ 1，RNA总量在O. I飞μ g范围内，补水至25 μ I。(c)42°C保温I个小时。 (d)95°C保温5分钟后冰上冷却，得到cDNA模板。
全文摘要
本发明公开了用于检测ROS1融合基因突变的引物、探针及检测试剂盒，其中，引物和探针包括以下序列SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 8。本发明采用了特异引物和探针技术，可以特异检测人类ROS1基因融合突变。本发明方法(1)建立了实时荧光PCR体系，可同时检测ROS1基因4种融合突变；(2)灵敏度高，10-20拷贝的突变可以检出；(3)操作简单，检测廉价，临床应用范围广；(4)样本检测范围广，样本可以为新鲜病理组织，石蜡包埋组织；(5)检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。
文档编号C12Q1/68GK102776286SQ20121024965
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月18日 优先权日2012年7月18日
发明者张海龙, 江风阁, 罗捷敏, 郑立谋, 阮力 申请人:厦门艾德生物医药科技有限公司