专利名称：抗猪圆环病毒2型的双峰驼重链单域抗体及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种抗体及其制备方法和用途，特别涉及以ー种抗PCV2型的双峰驼单域重链抗体。此外，还涉及到该抗体的制备方法、功能鉴定和用途。本发明属于生物技术领域。
背景技术：
猪圆环病毒病是近些年来流行的一种猪的病毒性传染病，病原为猪圆环病毒2型(PCV2XPCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症的主要病原，并且还与猪繁殖障碍、猪呼吸道病综合症、猪皮炎与肾炎综合症、猪增生性坏死性肺炎、先天性振颤等疾病发生有夫。猪圆环病毒属于圆环病毒科、圆环病毒属，该病毒无囊膜，是单股负链环状DNA病毒。根据其致病性、抗原性及核苷酸序列将PCV分为PCVl和PCV2两个血清型。PCV2为致病病原，目前没有PCVl致病的报道。PCV2编码有11个开放阅读框0RF，由开放阅读框0RF2编码的CAP蛋白为病毒的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳，能诱导机体产生中和抗体，还具有型特异性的表位。血清学调查表明，猪圆环病毒在世界上流行的范围很广，主要以混合感染和隐性感染为流行特点，猪群中存在大量病毒携帯者，表现为血清抗体阳性的亚临床症状。我国自有圆环病毒感染的报道以来，很多地区都有发病的报道，流行不断加剧。PCV2感染会引起机体的免疫抑制，这就为其它病原的感染提供了便利。猪圆环病毒病已经成为威胁养猪业的又一大传染病。面对如此严峻的疫病形式，建立快速、敏感、特异的诊断方法进行及时的诊断显得尤为重要。重链抗体(HCAbs)是发现于骆驼和软骨鱼等体内的ー种天然缺失轻链，仅有重链的饥体(Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, . et al. Naturally occurringantibodies devoid of light chains [J] Nature, 1993，363:446-448.)。这类抗体的抗原结合位点仅由重链可变区单域结构域组成，称为单域重链抗体(variable domain oftheheavy chain of HCAbs, VHH)D由于天然缺失轻链，单域重链抗体靠仅有的3个互补决定区(CDRs)就具备了特异的抗原结合能力及高亲和力，而普通抗体则需要6个CDRs才具备与抗原结合的能力。VHH是目前可以得到的具有完整功能的最小抗体分子片段，分子量仅15kD，是常规抗体的1/10，单克隆抗体的1/3，其晶体结构为直径2. 5nm，长4nm的圆柱体，有人也称其为纳米抗体(Nanobody)。VHH的抗原结合环的结构组成比普通抗体VH更大，⑶R3区也更长，能够形成更多的新结构，因而能补偿抗原结合位点VL的缺乏。并且，VHH具有易表达、水溶性好、耐高温、耐极度pH值等独特性质。作为ー种小分子抗体，VHH抗体有其独特的应用潜力。可应用在制备肤类药物、制备体内显影剂、构建免疫融合物、构建多价及多功能抗体、制备亲和纯化材料、作为细胞内抗体药物以及用于基础研究当中。抗体做为检测试剂的核心部分，其特异性及亲和カ决定了測定结果的准确性和灵敏度。目前，已有大量关于利用高特异性、高亲和カ的单域重链抗体建立检测方法的又献报道。Deckers 等(Deckers, N. , D. Saerens, et al. Nanobodies a promisingtool for species-specific diagnosis of Taenia solium cysticercosis. [J]int Jparasitol, 2009, 39(5) :625-633.)采用单域重链抗体建立了检测猪带绦虫囊尾蝴的ELISA检测方法，具有良好的特异性。Perruchini 等(Perruchini, C. , F. Pecorari, et al. LlamaV(H)H antibody fragments against GFAP:better diffusion in fixed tissues thanclassical monoclonal antibody [J]. Acta Neuropathol, 2009，118 (5) :685-695.)将单域重链抗体用于免疫组化实验，结果证实单域重链抗体 用于免疫组化实验中，具有扩散的距离长、有利于较厚切片的免疫标记和測定等优点。利用双峰驼制备PCV2VHH免疫抗体库，筛选PCV2特异性的VHH抗体，研制病原快速诊断方法在国内外尚无报道。本发明首次利用PCV2灭活疫苗免疫双峰驼，利用噬菌体展示技术建立PCV2VHH免疫抗体库，筛选具有良好型特异性和抗原亲和性的单域抗体，对于建立敏感和特异的PCV2抗体检测方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之ー是提供ー种抗猪圆环病毒2型的双峰驼单域重链抗体；本发明的目的之ニ是提供编码所述双峰驼单域重链抗体的核苷酸序列；本发明的目的之三提供所述的双峰驼单域重链抗体或其编码序列在制备检测或诊断PCV2病毒感染试剂中的应用。为了达到所述的目的，本发明采用了以下技术手段本发明使用PCV2灭活疫苗免疫双峰驼并利用噬菌体展示技术建立了 PCV2VHH免疫抗体库，经过三次大量连接和转化，随机选择15个克隆进行测序，结果表明，15个克隆的片段均为编码重链抗体的可变区的基因，计算得到库容为I. 12X108的骆驼免疫单域抗体库，将该抗体库命名为NAL-PCV2，从中筛选出具有高特异性和抗原结合能力的单域重链抗体(VHH)。本发明的ー种抗猪圆环病毒2型的双峰驼单域重链抗体，其特征在于所述的抗体具有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列(a) SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列；或(b)与SEQ ID NO. I所示的序列同源性在95%以上的氨基酸序列。在本发明中，优选的，所述的与SEQ ID NO. I所示的序列同源性在95%以上的序列包括SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的序列。进ー步的，本发明还提供了编码以上所述的双峰驼单域重链抗体的核苷酸序列。在本发明中，优选的，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5或SEQID NO. 6所示的序列。再进ー步的，本发明还提供了一种重组表达载体，其特征在于含有以上所述的核苷酸序列。更进一歩的，本发明还提供了ー种宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有以上所述的核苷酸序列的真核或原核细胞。
在本发明中，优选的，所述的宿主细胞为含有以上所述的表达载体的真核或原核细胞。本发明对得到的编码所述双峰驼单域重链抗体的基因进行了原核表达和纯化，通过结合力、特异性鉴定以及识别表位鉴定试验，证实获得的3株抗体具有很好的PCV2结合活性，其中2株(clonel和clone4)具有PCV2型特异性,通过抗体叠加实验证实3株抗体识别CAP蛋白上的不同表位。获得的VHH抗体能够在pH值2. 0的情况下耐受胃蛋白酶消化 30min。 利用有型特异性的2株抗体(clonel和clone4),通过双抗体夹心ELISA方法,对已知的PCV2阴性和阳性血清进行检测，结果表明该方法能够区分出血清抗体的阴阳性，并且能够反映出血清中PCV2抗体的含量，具有高敏感性和特异性。结果表明这2株抗体能够有效结合PCV2CAP蛋白，可以应用于PCV2血清抗体ELISA检测方法的建立。因此，最后，本发明提供了所述的双峰驼单域重链抗体在制备检测或诊断猪圆环病毒感染试剂中的应用。及所述的双峰驼单域重链抗体在制备检测或诊断猪圆环病毒2型感染试剂中的应用，其中所述的双峰驼单域重链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 3所示。及所述的核苷酸序列在制备检测或诊断猪圆环病毒感染试剂中的应用。及所述的核苷酸序列在制备检测或诊断猪圆环病毒2型感染试剂中的应用，其中所述的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 6所示。本发明首次利用PCV2灭活疫苗免疫双峰驼，利用噬菌体展示技术建立PCV2VHH免疫抗体库，筛选出具有良好型特异性和抗原亲和性的单域抗体，对于建立敏感和特异的PCV2抗体检测方法具有重要意义。
图I为双峰驼外周血淋巴细胞RNA提取结果；I :总 RNA ；M 入 _EcoT14 I digest 标准分子量图2为VHH基因第一轮PCR扩增结果；M DL2000标准分子量；I. PCR扩增产物；图3为VHH基因第二轮PCR扩增结果；I PCR扩增产物；M DL2000标准分子量图4为VHH基因第三轮PCR扩增结果；I PCR扩增产物；M DL2000标准分子量图5为双峰驼PCV2 VHH基因1、3和4号克隆的PCR电泳结果；M DL2000Marker ；1 clonel 基因；2 clone3 基因；3 clone4 基因
图6为PCV2VHH抗体的原核表达；M :蛋白分子量标准(SM0431) ;1，4，6分别为未诱导的对照；2，3，5分别为clone3、clonel、clone4 表达组；图7 为 western bloting 鉴定结果；1，3，5为未诱导的空白对照；2，4，6分别为clonel、clone3、clone4诱导后的总蛋白”为蛋白分子量标准(SM0431)
图8为可溶性分析和目的蛋白纯化；I, 3, 5 :分别是 clonel clone3 和 clone4 纯化结果;2，4，6 :分别是表达 clonelclone3和clone4菌进过超声波破碎后，收集的上清；M :蛋白分子量标准(SM0431)图9为PCV2 VHH抗体抗原结合能力鉴定；Aclonel ；B clone3 ；C clone4注clone+CAP+serum表示包被抗体与衣 壳蛋白和阳性血清依次作用；CAP+serum表示包被的CAP蛋白与血清直接作用作为实验对照；Sumo+CAP+serum表示包被sumo蛋白与衣壳蛋白和阳性血清依次做用作为对照；clone+serum表示包被抗体与阳性血清直接作用作为对照！Clone+CAP+Negserum表示抗体与衣壳蛋白和PCV2阴性血清作用作为对照；图10为PCV2 VHH抗体型特异性分析；Aclonel ；B clone3 ；C clone4注Clone PCV2表示抗体与PCV2抗原和阳性血清依次作用；Clone PCVl表示抗体与PCVl抗原和阳性血清依次作用；Clone control表示与PCVl和PCV2双阴性血清作用；图11为胃蛋白酶消化实验。I :作用 40min, 2 :作用 30min, 3 :作用 20min,4 :作用 IOmin, 5 :胃蛋白酶对照，6 蛋白对照，M :蛋白marker (SMO431)
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进ー步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。实施例I抗猪圆环病毒2型的双峰驼VHH重链抗体的制备I.材料与方法I. I 材料I. I. I试验动物、抗原、佐剂I峰雄性双峰驼(I周岁)，I峰雌性双峰驼(6月龄)；PCV2灭活疫苗(IngelvaccircoFLEX, Serial NO. 309-211),重组 PCV2VLPs 抗原(Shuanghui Yin, Shiqi Sun, ShunliYang,et al. Self-assembly of virus-1ike particles oi porcine circovirustype 2capsid protein expressed from Escherichia coli[J. ]Virology Journal2010，7:166)。I. I. 2菌株、辅助噬菌体和试剂大肠杆菌TGl和HB2151、辅助噬菌体M13K07、载体pHEN2购自Novagen公司；表达载体pSMK本所孙世琪博士惠赠；限制性内切酶购自NEB ;淋巴细胞分离液(I. 077)购自上海生エ；Trizol、DNA片段回收试剂盒和质粒提取试剂盒为OMEGA产品；镍亲和层析树脂购自Qiagen ;PCR相关试剂购自宝生物公司；其他生化试剂均为国产分析纯。I. 2 方法I. 2. I免疫方法、抗原接种剂量、免疫程序和血清抗体的测定在双峰驼的颈部皮下、背部皮下、腹部皮下和后腿皮下进行分点接种PCV2灭活疫苗(Ingelvac circoFLEX)。首次免疫前和每次免疫后采集静脉血，用CAP蛋白ELISA方法检测抗体产生情况(Shuang-hui YIN, Shun-Ii YANG, Hong TIAN, et al. An ELISA Based on aTruncated Soluble ORF2 Protein for the Detection of PCV2Antibodies in DomesticPigs[J]VIR0L0GICA SINICA, 2010，25 (3) : 191-198.)，第五次免疫后 5 天，静脉采血 500ml,进行下一歩实验。具体动物免疫程序和抗原接种剂量见表I。表I双峰驼免疫程序和抗原剂量
免疫次数首免 ニ免三免四免五免 剂量(ml) I 2 2 34
间隔时间(天)0I2135 49I. 2. 2淋巴细胞分离最后一次免疫后5天，静脉采集抗凝血，用比重为I. 077的淋巴细胞分离液，分离外周血淋巴细胞，用1640液洗涤分离的淋巴细胞，细胞计数，液氮冻存备用。I. 2. 3细胞总RNA的提取利用Trizol法抽提分离的淋巴细胞总RNA。I. 2. 4VHH基因扩增，噬菌体展示载体的构建和免疫库的构建根据參考文 献(Ana Monegal, Diletta Ami, Chiara Martinelli.et al. immunological applications of single-aomam 丄lama recombinantantibodies isolated from a naive library[J]. Protein Engineering design andselection, 2009，22 (4)，273-280.)做适当修改设计三对引物扩增VHH基因片段，引物CH2D位于高度保守的CH2区序列，HlR位于抗体编码区前导序列，H2S和H2SfiI位于可变区框架I (framework regionl, FRl), H3D 和 H3NotI 位于可变骨架 4 (framework region4, FR4)。引物见表2。表2VHH基因片段扩增用引物
扩增轮次引物片段(bp)
第一轮扩增 HlR 5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’两条片段
CH2D 5'-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3'(9()0,6()0)
丨收600
沁..轮ダ.培 H2S 5!-GCCATGGCTSAKGTBCAGCTGSTGGAGTCTGG-3'450-500
H.3D 5’-GCGGCTGAGGAGACGGTGACCWGG-3’
’免轮扩柄 H2‘v;1 5 ATTACTGGCCCAGCCGGCCGGCTGAKGTBCAGCT 450_500
(Sfil)
GGTGG AGTCTGG RGG AGGCT-3'
H3 Noi\ 5 ^ATTATTAGTGCGGCCGCTG AGG AG ACGGTG A CC_WGGGTCC-3. _注划线部分为引用酶切位点以Oligo dT为反转录引物，将提取的RNA转录为cDNA，然后以cDNA为模板，H1R、CH2D为上下游引物扩增得到大小分别为600bp和900bp的2条带，回收600bp条带作为模板，进行第二轮PCR扩增。以第二轮PCR产物为模板，H2S、H3D为上下游引物得到约大小450bp条带。以第二轮PCR产物为模板，以H2SfiI，H3NotI为上下游引物进行第三轮扩增，得到约450bp条带。将第三轮PCR产物经过Sfil/Notl双酶切后，克隆入pHEN2载体，通过电转化方法将连接产物转化到大肠杆菌TGl中，电转结束后，细胞立即倒入ImL SOC培养液中，37°C、150r/min培养lh，然后菌液以1:100比例后涂布于2YTG平板(2%葡萄糖、Ampr50mg/L,2XYT,2YTG)平板，另取IOul菌液做1000倍稀释后涂板，37°C过夜培养，用于计算库容。平板过夜培养后，用IOmL的2XYT培养基将培养板上长出的菌苔刮洗干净，加入终浓度25%的甘油，分装保存在_70°C备用，此为获得的抗PCV2单域重链抗体(VHH)免疫
库。 电转化后的随机挑选电转后的克隆，抽提质粒进行测序，鉴定抗体库的多祥性，根据克隆的正确率来计算实际库容。I. 2. 5制备噬菌体抗体库(I)取用甘油保存的VHH文库，接种到500ml2YT-G(2XYT，Glucose :0. 5%)培养基中，37° C 250rpm震摇培养直到菌浓度达到OD6tltl值为0. 8-0. 9。(2)加入M13K07辅助噬菌体至终浓度5X109pfu/mL，首先，在37° C静置培养30min，然后在进行200rpm震摇培养30min，使噬菌体充分感染。(3)2200g离心15min重新收获菌体，然后重悬到相同体积的2YT_AK(2XYT，2%葡萄糖，50ug/ml Kanamycin, 100ug/ml Ampicillin)中，30° C 300rpm 过夜震摇培养。⑷7000g，4° C离心15min收集含有噬菌体的上清，加入到容量为IL的提前预冷的三角瓶内。加入0. 3体积的噬菌体沉淀剂PEG/NaCl (20%PEG80002. 5mol/LNaCl)。混匀冰上静置Ih，使噬菌体沉淀。(5)7000gl5min离心两次，尽可能多的收集噬菌体沉淀，重悬到8ml的PBS中。(6)分装到小离心管12000g离心IOmin确保细菌充分分离，收集上清。最后滴定噬菌体，将得到的噬菌体稀释后感染TGl在涂到含有TGl的2TY-AG(2XYT，Ampr 100u g/mL ；Glucose :0. 5%)平板，培养，确定抗Amplr克隆的数量。然后4° C保存噬菌体，准备进行筛选。I. 2. 6抗体库的淘选(I)抗原包被在96孔酶标板中用碳酸盐缓冲液(pH9. 6)包被PCV2VLPs，三轮筛选包被浓度分别为30 u g/ml、15 u g/ml、10 u g/ml, 100 u L/孔，4°C包被过夜,制成抗体淘洗板。(2)封闭弃去孔内液体，加入 100 u L/ 孔封闭液(TBST+5mg/ml BSA, 0. 02%NaN3),37°C 封闭 2h。(3)去封阻液，在用TBST(TBS+0. l%Tween-20)缓冲液快速洗板6次。每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液。(4)用IOOiU的TBST缓冲液稀释噬菌体原始文库，然后加到已包被好的板上，室温温和摇动60min。(第一轮淘洗噬菌体颗粒的数量比文库大小高100倍)。(5)倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。
(6)洗脱用IOOu I的非特异性缓冲液(0. IM HCl-Glycin pH2. 2)洗脱，室温摇动30min，吸出洗脱液，用80ii L左右IM Tris-HCl (pH9. I)中和至pH等于7. 4。(7)取少量洗脱液(IOiU)进行噬菌体滴度測定和产出量计算，同时将剩余洗脱的噬菌体感染20ml指数生长的TG1，37°C 300rpm扩增培养5h。(8)将培养物转入ー离心管中，然后，4°C 10 OOOrpm离心lOmin。上清液转入另一离心管中，再离心。将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4°C沉淀过夜。4°C 10 OOOrpm离心15min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。(9)沉淀物重悬于Iml TBS中，悬液转入微量离心管中，4°C离心5min使残余细胞沉淀。上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育60min。4°C离心lOmin，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去 残余上清。沉淀物重悬于200 y ITBS中。离心lmin，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鮮管中。此即为扩增后的洗脱物。分装冻存_70°C备用。(10)根据常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。4°C贮存。按以上步骤进行“结合-洗涤-洗脱(感染)”，反复进行三轮。I. 2. 7噬菌体ELISA鉴定阳性克隆(I)挑取经过三轮经筛选后的克隆于96孔深孔板中，每孔250 ii L2X YTATG(2X YT培养基中添加 Amp1 ;100u g/mL ；Tetr 10u g/mL ；Glucose :0. 5%)培养基，37 °C 摇床培养至OD600约为0. 5，按照M0I=20 I加入辅助噬菌体，室温静置30min,37°C,150rpm/min培养30min，5000g离心IOmin收集沉淀，重悬于等体积2 X YTATG，30°C，摇床200rpm培养过夜。(2) 10000rpm/min离心IOmin收集上清,加入沉淀剂收集卩遼菌体。重悬于Iml无钙镁离子的磷酸盐缓冲液(DPBS)中，反复离心确保没有任何杂质颗粒存在。(3)包被PCV2 VLPs 10 y g/ml，加入96孔酶标板中，100 y L/孔，4°C包被过夜。(4)弃包被液，用DPBS溶液220 u L/孔洗5次，用封闭液(5%BSA+0. l%Tween_20)封闭，IOOii L/ 孔，37°C封闭 2h。(5)弃去封闭液，加入溶于洗液的单克隆噬菌体抗体，100 u L/孔，37°C静置2h。(6)弃去液体，用DPBS洗6次，220 ii I/孔。(7)将鼠抗M13-HRP抗体用封闭缓冲液按1:5000稀释，100 y L/孔，37°C作用lh。(8)弃去液体，酶标板用DPBS洗6次。(9)弃去洗涤液，加入底物OPD显色液，50 ii L/孔，室温静置显色。用50 y L/孔2MH2SO4终止显色。酶标仪测定0D490值。I. 2. 8阳性克隆的测序(I)进行噬菌斑扩增，然后，取500 ill含噬菌体上清转入一新鲜离心管。加200iilPEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置IOmin。(2)离心lOmin，弃上清液，再短暂离心，小心吸去残余上清。(3)沉淀物彻底重悬于 100 u I 碘化物缓冲液[IOmM Tris-HCl (pH8. 0)，ImMEDTA, 4MNaI]中，加入250 u Iこ醇,室温温育lOmin。短时间的室温温育使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。(4)离心lOmin，弃上清。用70%的こ醇洗沉淀，短暂真空干燥。沉淀重悬于30 ylTE[10mM Tris-HCl (pH8. 0), ImM EDTA]中。
(5) IOul的上述模板溶液送出测序，使用用通用测序引物测序。I. 2. 9筛选的PCV2VHH重链抗体在E. coli中表达、鉴定和纯化上述实验共获得阳性克隆，通过测序得到基因组序列，通过序列分析比较，该筛选序列为VHH重链抗体序列。利用含有BSAI和BamHI位点的弓I物进行PCR将这些序列扩増，胶回收PCR扩增后片段，然后双酶切酶切，酶切后的目的片段与E. coli表达载体pSMK连接，构建VHH重链抗体重组表达载体，并转化到E. coli [BL21-codon-Plus (DE3) -RHstrain(Stratagene)]中进行表达。利用SDS-PAGE鉴定表达的VHH抗体蛋白表达情况,利用抗His单抗进行Western blot实验,对蛋白表达进ー步验证,并使用镍柱进行目的蛋白的纯化。 I. 2. 10重组PCV2重链单域抗体(VHH)结合抗原能力和型特异性鉴定I. 2. 10. I双抗体夹心ELISA鉴定PCV2 VHH抗体结合力(I)抗体包被纯化VHH抗体包被酶标板(10 ii g/ml 100 yl/孔)，设定SUMO蛋白(10 u g/ml 100iil"L)、PCV2 VPLs (10 u g/ml 100 yl/孔)做对照，4°C 过夜包被。(2)加入抗原I XPBST洗涤4次，220 U L/孔，最后一次弃净孔内液体，拍干，按照50ug/ml 的浓度加入 PCV2 VPLs 100 yl/孔，37°C 作用 60min，洗板。(3)加入PCV2阳性多抗血清用血清稀释液(1%BSA，10%马血清，Ix PBST)，按照倍比稀释加入IOOiIl/孔，37°C作用60min，洗板。(4)加酶标ニ抗1 10000稀释抗猪HRP标记ニ抗，100 iil/孔，37°C作用60min，洗板。(5)显色加入OPD底物，50iU/孔，37°C避光显色15min。(6)终止并读数加入2M H2SO4终止反应，50 U I/孔，OD490读取吸光度值。I. 2. 10. 2双抗体夹心ELISA鉴定PCV2VHH抗体型特异性(I)抗体包被对纯化VHH抗体用碳酸盐缓冲液(pH值9. 6)包被酶标板(10 ii g/ml 100111/孔)，4で过夜包被。(2)加入抗原I XPBST洗涤4次，220 U L/孔，最后一次弃净孔内液体，拍干，分别加入纯化的 PCVl CAP 和 PCV2 VPLS (50ug/ml，100iil/孔)，37°C 作用 60min，洗板。(3)分别加入PCV2和PCVl阳性多抗血清(产生于免疫鼠的多抗血清)和阴性对照血清(未免疫鼠血清)，用血清稀释液(1%BSA，10%马血清，Ix PBST)，按照倍比稀释加入IOOiU/孔，37°C作用 60min，洗板。(4)加酶标ニ抗1 10000稀释抗鼠HRP标记ニ抗，100 iil/孔，37°C作用60min，洗板。(5)显色加入OPD底物，50iil/孔，37°C避光显色15min。(6)终止并读数加入2M H2SO4终止反应，50iU/孔，OD490读取吸光度值。1.2. 11抗体叠加实验对获得的几株抗体进行叠加实验鉴定其是否结合同ー个抗原表位(I)抗体包被用碳酸盐缓冲液(pH值9. 6)按IOii g/ml加入PCV2 VPLs抗原IOOiU/孔，4°C过夜包被。(2)加入纯化抗体1 XPBST洗涤4次，220 ii L/孔，最后一次弃净孔内液体，拍干，超量加入纯化抗体(50 u g/ml),姆个抗体为选择两个实验重复孔,37°C作用60min,洗板。此时取其中一个实验重复孔，加入不同的抗体，IOOiI I/孔，37°C作用60min。(3)非重叠孔先加入抗HIS的鼠源单抗(I :1000)，然后做重叠的孔也按照相同的比列加入，IOOiU/孔，37°C作用60min，洗板。(4)加入HRP标记的抗鼠ニ抗，按照I 10000稀释，100111/孔，37で作用601^11，洗板。(5)显色加入OPD底物，50iU/孔，37°C避光显色15min。
(6)终止并读数加入2M H2SO4终止反应，50 U I/孔，OD490读取吸光度值。I. 2. 12抗体胃蛋白酶消化实验据报道VHH抗体具有很好的稳定性，在极端的条件下也很稳定，本实验采用猪的胃蛋白酶对获得抗体进行消化。(I)取纯化的抗体80 ii g (100 iil)，取等量的5份。(2)胃蛋白酶终浓度为0. 8mg/ml溶解于含有0. 8%体积浓盐酸的液体中(pH约为I. 6)。(3)加入等量的胃蛋白酶(100 ill)到抗体管中，此时pH值约为2. 2，按照10min20min 30min 40min 60min 分别进行消化。(4)终止加入2M的NaoH 10 yl，此时pH值约为6. O。(5)加入 5XSDS Ioadingbuffer 进行 SDS-PAGE。I. 2. 13PCV2 VHH在双抗体夹心ELISA血清抗体检测方法建立中的应用利用PCV2VHH抗体clonel和clone4，通过双抗体夹心ELISA方法对15份PCV2阳性和5份阴性血清进行抗体測定，从而对获得PCV2VHH抗体是否可以用于临床样品抗体检测进行验证。(I)抗体包被用碳酸盐缓冲液(pH值9. 6)，稀释clonel和clone4浓度均为
10u g/ml，加到载体反应板，50 u I/孔，4°C包被过夜。(2) 1XPBST5次洗版后，加入用稀释液稀释的PCV2VPLs (50ug/ml)，50 yl/孔，
37°C Ih。(3)加入倍比稀释的样品血清，50 iil/孔，37°C lh。(4)加入 HRP 标记ニ抗(I :10000), 50 iil/孔，37°C lh。(5)加入TMB底物，显色15min，加入2M H2SO4终止反应，50 yl/孔，OD45tl读取吸光度值。2.结果2. I完整淋巴细胞总RNA的提取提取外送免疫后双峰驼外周血淋巴细胞的总RNA，凝结电泳分析提取的总RNA无基因组污染，大小与预期相符，见图I所示。2. 2VHH重链抗体基因PCR扩增以Oligo dT为反转录引物，将提取的RNA转录为cDNA，以cDNA为模板，H1R、CH2D为上下游引物，进行第一轮PCR扩增，得到大小600bp和900bp左右2条带，见图2。回收600bp条带。以第一轮扩增的PCR产物为模板，H2S、H3D为上下游引物进行第二轮PCR扩增得到约450bp条带，见图3。以第二轮PCR产物为模板，以H2SfiI、H3NotI为上下游引物进行第三轮PCR扩增得到约450bp条带，见图4，此时VHH基因两端分别引入了 Sfil/Notl限制性酶切位点。2. 3噬菌体展示抗体库多多样性的确定和库容量经过三次大量连接和转化，随机选择15个克隆测序结果表明，15个克隆的片段均为编码重链抗体的可变区的基因，计算得到库容为I. 12X108的骆驼免疫单域抗体库，将该抗体库命名为NA L-PCV2。2. 4抗体库的淘选采用噬菌体文库NAL-PCV2淘洗能与PCV2抗原特异性结合的噬菌体颗粒，测定每轮筛选的噬菌体的回收率，经过3轮淘选，表明选择性吸附的噬菌体量明显增加(表3)，能与PCV2抗原特异性结合的噬菌体的得到了富集。对每ー轮洗脱无扩增得到的噬菌体文库进行phage-ELISA监测，在抗原包被浓度相同，噬菌体投入量相同的条件下，測定的吸光度值随着淘洗次数的增加而升高，说明能够与目标抗原结合的噬菌体克隆得到了富集，结果见表4。表3三轮淘选噬菌体富集结果
权利要求
1.抗猪圆环病毒2型的双峰驼单域重链抗体，其特征在于所述的抗体具有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列 (a)SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列；或 (b)与SEQID NO. I所示的序列同源性在95%以上的氨基酸序列。
2.如权利要求I所述的双峰驼单域重链抗体，其特征在于所述的与SEQID NO. I所示的序列同源性在95%以上的序列包括SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的序列。
3.编码权利要求I或2所述的双峰驼单域重链抗体的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列具有SEQID NO. 4或SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6所示的序列。
5.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求3或4所述的核苷酸序列。
6.一种宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有权利要求3或4所述的核苷酸序列的真核或原核细胞，优选的所述的宿主细胞为含有权利要求5所述的表达载体的真核或原核细胞。
7.权利要求I或2所述的双峰驼单域重链抗体在制备检测或诊断猪圆环病毒感染试剂中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的猪圆环病毒为猪圆环病毒2型，所述的双峰驼单域重链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 3所示。
9.权利要求3或4所述的核苷酸序列在制备检测或诊断猪圆环病毒感染试剂中的应用。
10.如权利要求9所述的的应用，其特征在于所述的猪圆环病毒为猪圆环病毒2型，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 6所示。
全文摘要
本发明公开了一种抗猪圆环病毒2型的双峰驼单域重链抗体及其制备方法和用途，属于生物技术领域。本发明首次利用PCV2灭活疫苗免疫双峰驼，利用噬菌体展示技术建立PCV 2免疫VHH抗体库，筛选与PCV特别是PCV 2型病毒抗原具有良好亲和力的高特异性单域重链抗体(VHH)，本发明所述的抗体具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.1所示的序列同源性在95%以上的氨基酸序列。本发明的PCV 2单域重链抗体对于研究猪圆环病毒，特别是对于研究猪圆环病毒2型的感染机理和建立高度敏感和特异的抗原快速检测或诊断试剂具有重要意义。
文档编号C12Q1/70GK102766207SQ20121024962
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月18日 优先权日2012年7月18日
发明者刘湘涛, 吴锦艳, 孙世琪, 尚佑军, 尹双辉, 张克山, 杨顺利, 田宏, 陈妍, 靳野 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所