专利名称：一种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记及其特异性引物和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于海洋生物技术领域，具体的说是ー种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记及其特异性引物和应用。
背景技术：
长心卡帕藻(Kappaphycusalvarezii)和细齿麟麟菜(Eucheuma denticulatum)分别是国际上生产K _和t -卡拉胶的重要原料。其主产区主要有印度尼西亚、菲律宾、马来西亚、越南等东南亚国家，坦桑尼亚、肯尼亚等部分非洲国家，巴西、墨西哥等中南美洲国家以及我国海南省。上述国家地区人工规模化栽培长心卡帕藻和细齿麒麟菜是维持国际卡拉胶相关产业发展的基础。
卡拉胶由D-半乳糖和3，6-内醚半乳糖残基组成的海藻细胞粘性多糖。依据其残基中酯式硫酸基盐的含量和分子链接位置的差异，卡拉胶可以被分为K型、X型、t型、il型和V型等多种类型的卡拉胶。目前生产应用最为广泛的是K型卡拉胶，其次为t型卡拉胶。其主要原料分别是长心卡帕藻与细齿麒麟菜。目前在市场流通过程中，存在着某些长心卡帕藻中掺杂有细齿麒麟菜的现象，尤其在长心卡帕藻半精品颗粒中掺杂细齿麒麟菜颗粒比较严重。这是由于长心卡帕藻与细齿麒麟菜在形态上比较接近，其干品在外观上难以区分，特别是经过初加工处理的半精品如何检测尚没有具体办法。由于两种藻含有的卡拉胶的类型不同，提取エ艺也不尽相同，两种海藻的掺杂不仅大大降低原材料的利用率，而且直接影响产品质量，导致产品不稳定。而凭借长心卡帕藻和细齿麒麟菜的藻株外形等形态学物种鉴定方法存在着易受生理状态和人为因素影响等弊端，以及长心卡帕藻半精品颗粒中掺杂细齿麒麟菜颗粒难以检测等问题，不仅会扰乱了正常市场交易，而且不利于后续产品的进ー步开发和应用，易造成不必要的商品经济损失，并且也会影响栽培、加工和供应商之间的商业信誉。为此，有必要开发ー种客观、高效、稳定的方法鉴别两种海藻以及其半精品的技术方法。微卫星标记是以DNA为基础的分子标记，由于具有易扩增、重复性高、检测位点多、中性标记等特点，不受生理、生活环境变化以及人为因素影响的优点，被广泛应用到动植物的物种鉴别和种质鉴定。
发明内容
本发明目的提供ー种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记的特异性引物及其应用。为实现上述目的，本发明采用技术方案为ー种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记，长心卡帕藻微卫星标记为SEQ.ID. NO I-5碱基序列所示；细齿麒麟菜的微卫星标记为SEQ. ID. N06-10碱基序列所示。
ー种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记的特异性引物所述SEQ. ID. NOl碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为F:TTCCTCAAGACGCTCCACCAAAC, R:GCGAGGTGTGAGATGCCGAGT ；SEQ. ID. N02碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为F: GCCAACTCTGGTTACACATATT, R: GAGGTTTGGTTGATGAATTGA ；SEQ. ID. N03碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为
F:ACAATCATATACGTCGCAAACG,R:ACAGGTAGTTGAGTGGTTGGAAAC ；SEQ. ID. N04碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为F: TGTGACGACGGCGGAGAATG, R: TCTCACCAGGCGACTGCTCATC ；SEQ. ID. N05碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为F: GATGGCGTGAAGATAAAAGAGA, R: ATCACTTCCACTGTCCCTATGT ；SEQ. ID. N06碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为F:CCCGCGACTAATGCAAAAGGT，R:CGTGGCTCACTATGATGAATCTAAC ；SEQ. ID. N07碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为F:TGAATGTTAGCTCGCATACCG, R:TCACAGGGCAACTTCAACAA ；SEQ. ID. N08碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为F:GATGTTGAGCAGCCTTGGGG，R: GGGTGTTTACCGCTTCTTCTTTT ；SEQ. ID. N09碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为F:CCCGTCTATTCTCGACCAGGCA，R:TTTGTGAATGTTAGCTCGCATACCG ；SEQ. ID. NOlO碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为F:ACGCCCTTGTATTGCTTGTACGG，R:GACATCAAGAAGGCTCCGAGCTAC。利用SEQ. ID. N01-10碱基序列所示微卫星标记的特异性引物扩增，样品中扩增出约150bp的特异性DNA片段，进而区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜以及检测这两种海藻半精品是否互相掺杂。本发明所具有的优点本发明利用特定微卫星标记客观、稳定、高效的鉴别长心卡帕藻和细齿麒麟菜，根据琼脂糖凝胶电泳相应带型的有无可以直观判断待测藻株属于哪种藻株，以及分析一种藻的半精品颗粒是否掺杂着另ー种藻的颗粒。
图I为本发明实施例提供的利用细齿麒麟菜微卫星标记Ed002、Ed003和Ed005对8个藻株样品的基因组DNA进行扩增效果图(其中，8个藻株样品为细齿麒麟菜的新鲜样品5F、干燥样品以及半精品5S，长心卡帕藻的新鲜样品7F、8F、12F、半精品12S以及干燥样品 13D ;M 为 DL500 (Takara)，从下往上 7 条带分别代表 50bp、lOObp、150bp、200bp、300bp、400bp 和 500bp。)。图2为本发明实施例提供的利用细齿麒麟菜微卫星标记Ed006和Ed007对8个藻株样品的基因组DNA进行扩增效果图(其中，8个藻株样品为细齿麒麟菜的新鲜样品5F、干燥样品以及半精品5S，长心卡帕藻的新鲜样品7F、8F、12F、半精品12S以及干燥样品 13D ；M 为 DL500 (Takara)，从下往上 7 条带分别代表 50bp、lOObp、150bp、200bp、300bp、400bp 和 500bp。)。图3为本发明实施例提供的利用长心卡帕藻微卫星标记Kall39、Kal272和Kal340对8个藻株样品的基因组DNA进行扩增效果图(其中，细齿麒麟菜的新鲜样品5F、干燥样品以及半精品5S，长心卡帕藻的新鲜样品7F、8F、12F、半精品12S以及干燥样品13D ；M 为 DL500 (Takara)，从下往上 I 条带分别代表 50bp、lOObp、150bp、200bp、300bp、400bp 和500bp。)。图4为本发明实施例提供的利用长心卡帕藻微卫星标记Ka1450和Ka1476对8个藻株样品的基因组DNA进行扩增效果图(其中，细齿麒麟菜的新鲜样品5F、干燥样品5D以及半精品5S，长心卡帕藻的新鲜样品7F、8F、12F、半精品12S以及干燥样品13D ；M 为 DL500 (Takara)，从下往上 7 条带分别代表 50bp、lOObp、150bp、200bp、300bp、400bp 和500bp。)。图5-9为本发明实施例3提供的是利用10个微卫星标记对长心卡帕藻半精品和细齿麒麟菜半精品的相互掺杂样品的检测示意图(其中，长心卡帕藻半精品中掺杂质量比例为3%、5%和10%的细齿麒麟菜半精品，它们分别用3E、5E和10E来表示；细齿麒麟菜半精品中掺杂质量比例为3%、5%和10%的长心卡帕藻半精品，它们分别用3K、5K和10K来表示)。
具体实施例方式实施例I从NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. rov/)下载长心卡帕藻和细齿麒麟菜的EST序列；利用软件MISA筛选含有微卫星核心序列的片段,然后利用Primer Primer5. 0根据核心序列两侧的保守序列设计引物；对各个引物进行反应条件优化，各选取5个反应稳定、带型清晰的长心卡帕藻和细齿麒麟菜的微卫星标记(參见表I)。分别提取细齿麒麟菜和长心卡帕藻不同状态样品的DNA，以此DNA为模板，利用上述特异性引物，PCR扩增反应，其产物经琼脂糖凝胶电泳，利用微卫星标记的种特异性，区分这两种海藻。。分别提取不同比例掺杂的两种海藻(细齿麒麟菜和长心卡帕藻)半精品的DNA，以此DNA为模板，利用上述特异性引物，PCR扩增反应，当一种藻株半精品中含有微量的另ー种藻株半精品时，提取的DNA即是两个物种DNA的混合物，因此利用两个物种的微卫星标记进行扩增，其产物经琼脂糖凝胶电泳，均有得到相应的条带，用于判断这两种海藻半精品是否互相掺杂。实施例2从海南陵水养殖基地收集细齿麒麟菜的新鲜样品(5F)、干燥样品(5D)以及半精品(5S)(Hayashi et al. 2007),Hayashi L. , de Paula E. J. & Chow F. (2007)Growth rateand carrageenan analyses in four strains of Kappaphycus alvarezii(Rhodophyta, bigartinales)farmed in the subtropical waters of Sao Paulo State, Brazil. Journa丄of Applied Phycologyl9, 393-9.长心卡帕藻的新鲜样品(7F、8F、12F)、干燥样品(13D)、半精品(12S)。上述海藻的原材料均为从印度尼西亚引进的优良种质。每株藻株提取DNA各ー份，调整DNA浓度至20ng/ul。以每份DNA为模板，SEQ. ID. NOl-IO序列所示的微卫星标记特异性引物为引物，各个PCR扩增的PCR反应体系为20ul，每个反应体系中加入模板DNAlul, 2 X PCR Mix Buffer (含有Mg2+，dNTPs)(购自广州东盛生物科技有限公司)10ul，正向引物(10禮)0.5111，反向引物(101111)0.5111，HS Taq酶(购自广州东盛生物科技有限公司)0. 2ul (0. 5U)，双蒸水补齐体系至20ul。各个PCR扩增反应程序如下94° C预变性5min后进入循环反应，94° C变性30s，58。C退火30s，72。C延伸30s，共35个循环，最后72。C延伸5min，4。C冰箱保存。PCR反应产物在2. 5%的琼脂糖凝胶电泳(电压120V，25min)，胶成像系统拍照，分析胶图，查看各个PCR反应产物中的特异性条带。SEQ. ID. NO I-5 所示的微卫星标记 Ed002、Ed003、Ed005、Ed006 和 Ed007 只有以细齿麒麟菜基因组DNA为模板，才能稳定扩增出细齿麒麟菜特有的约为150bp的条带(參见图I和图2);结果显示细齿麒麟菜3个藻株样品在约150bp处有特异性条带产出，而长心卡帕 藻5个藻株样品均无扩增产物。SEQ. ID. N06-10 所示的微卫星标记 Kal 139、Kal272、Kal340、Kal450 和 Kal476 只有以长心卡帕藻基因组DNA为模板，才能稳定扩增出长心卡帕藻特有的约150bp的条带(參见图3和图4)。结果显示长心卡帕藻5个藻株样品在约150bp处有特异性条带产出，而细齿麒麟菜3个藻株样品均无扩增产物。利用这10个微卫星标记可以清晰、客观、准确地鉴别细齿麒麟菜和长心卡帕藻。实施例3从海南养殖基地采集两种海藻样品制作半精品(半精品制备为IOg海藻干燥样品与250ml含10%Na0H和5%KC1的碱混合液混合，混合液于60° C水浴处理2h，去除碱液后，加水浸洗四次至中性，65° C烘干至恒重，干燥破碎)。然后将细齿麒麟菜半精品按照质量比3%、5%和10%的比例混入到长心卡帕藻半精品中，得到3份混合样品；同理，得到3份细齿麒麟菜半精品混合样品，它们分别混有3%、5%和10%长心卡帕藻半精品。。按照康为世纪植物基因组试剂盒说明书，提取所述6份混合样品的DNA各ー份，调整DNA浓度至20ng/ul。以每份DNA为模板，SEQ. ID. N01-10序列所示的微卫星标记特异性引物为引物。各个PCR扩增的PCR反应体系为20ul，每个反应体系中加入模板DNAlul，2XPCRMix Buffer (含有Mg2+，dNTPs)(购自广州东盛生物科技有限公司)10ul，正向引物(IOmM)0. 5ul，反向引物(IOmM)O. 5ul，HS Taq酶(购自广州东盛生物科技有限公司)0. 2ul (0. 5U)，双蒸水补齐体系至20ul。各个PCR扩增反应程序如下94° C预变性5min后进入循环反应，94° C变性30s，58。C退火30s，72。C延伸30s，共35个循环，最后72。C延伸5min，4。C冰箱保存。PCR反应产物在2. 5%的琼脂糖凝胶电泳(电压120V，25min)，胶成像系统拍照，分析胶图，查看各个PCR反应产物中的特异性条带。10个微卫星标记以6种半精品DNA为模板，微卫星标记PCR产物的带型亮度与检测样品中其对应物种样品的浓度呈正比，但均可以扩增出特异性的条带(附图5至图9)，结果显示这些微卫星标记均能将样品检测成功，说明当长心卡帕藻半精品中仅含有3%的细齿麒麟菜时，细齿麒麟菜的微卫星标记便可将掺入的细齿麒麟菜检出；同样，当细齿麒麟菜半精品中仅含有3%的长心卡帕藻时，长心卡帕藻的微卫星标记也可将掺入的长心卡帕藻检出。表I
权利要求
1.一种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记，其特征在于长心卡帕藻微卫星标记为SEQ. ID. N01-5碱基序列所示；细齿麒麟菜的微卫星标记为SEQ. ID. N06-10碱基序列所示。
2.一种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记的特异性引物，其特征在于 所述SEQ. ID. NOl碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为F:TTCCTCAAGACGCTCCACCAAAC, R:GCGAGGTGTGAGATGCCGAGT ； SEQ. ID. N02碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为F:GCCAACTCTGGTTACACATATT, R:GAGGTTTGGTTGATGAATTGA ； SEQ. ID. N03碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为F:ACAATCATATACGTCGCAAACG,R:ACAGGTAGTTGAGTGGTTGGAAAC ； SEQ. ID. N04碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为F:TGTGACGACGGCGGAGAATG, R: TCTCACCAGGCGACTGCTCATC ； SEQ. ID. N05碱基序列所示的长心卡帕藻微卫星标记的特异性引物为F: GATGGCGTGAAGATAAAAGAGA, R: ATCACTTCCACTGTCCCTATGT ； SEQ. ID. N06碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为F:CCCGCGACTAATGCAAAAGGT,R:CGTGGCTCACTATGATGAATCTAAC ； SEQ. ID. N07碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为F: TGAATGTTAGCTCGCATACCG, R: TCACAGGGCAACTTCAACAA ； SEQ. ID. N08碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为F:GATGTTGAGCAGCCTTGGGG, R: GGGTGTTTACCGCTTCTTCTTTT ； SEQ. ID. N09碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为F:CCCGTCTATTCTCGACCAGGCA,R:TTTGTGAATGTTAGCTCGCATACCG ； SEQ. ID. NOlO碱基序列所示的细齿麒麟菜微卫星标记的特异性引物为F:ACGCCCTTGTATTGCTTGTACGG,R:GACATCAAGAAGGCTCCGAGCTAC。
3.按权利要求2所述的区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记的特异性引物的应用，其特征在于利用SEQ. ID. N01-10碱基序列所示微卫星标记的特异性引物扩增，样品中扩增出约150bp的特异性DNA片段，进而区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜以及检测这两种海藻半精品是否互相掺杂。
全文摘要
本发明属于海洋生物技术领域，具体的说是一种区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的微卫星标记及其特异性引物和应用。长心卡帕藻微卫星标记为SEQ.ID.NO1-5碱基序列所示；细齿麒麟菜的微卫星标记为SEQ.ID.NO6-10碱基序列所示。利用SEQ.ID.NO1-10碱基序列所示微卫星标记的特异性引物扩增，样品中扩增出约150bp的特异性DNA片段，进而区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜以及检测这两种海藻半精品是否互相掺杂。采用本发明微卫星标记进行区分长心卡帕藻与细齿麒麟菜的方法高效、稳定性高、操作简单，能在约4小时内完成鉴别、检测工作。
文档编号C12N15/11GK102757957SQ20121024915
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月18日 优先权日2012年7月18日
发明者刘建国, 庞通, 张振, 李凌, 林伟 申请人:中国科学院海洋研究所