专利名称：烟草基因组分子标记探针与序列集合群及获得方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和基因工程技术领域，进一步属于烟草基因研究与应用技术领域，具体涉及一种烟草基因组分子探针与序列集合群及获得方法与应用。
背景技术：
烟草(Nicotianatabacum)属于爺科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana),是一年生草本植物。对于植物学科的发展来说，无论是基础研究还是应用研究，烟草作为模式植物都起了很大的作用，如烟草的转基因研究、烟草有益基因分子标记等。尽管我国在烟草种质资源研究方面已做了大量研究工作，但由于受技术手段的限制及烟草各品种间遗传多样性低等原因，至今还未建成一张高密度、覆盖整个基因组的遗传图谱，严重影响了烟草重要农艺性状的遗传基础和遗传规律的研究。目前，在烟草中所应用的分子标记大部分为RAPD标记，尽管该检测技术简便，但重复性较差、可靠性较低且不能鉴别杂合子和纯合子。因此，迫切要求科研人员开发共显性、多态性高、重复稳定性好、简单易用、自动化程度高的新型分子标记技术，对于烟草品种的鉴别有重要意义。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种烟草基因组分子标记探针与序列集合群 ’另一目的在于提供一种获得烟草基因组分子标记探针与序列集合群的方法；第三目的在于烟草基因组分子标记的探针与序列集合群用于高分辨地鉴别烟草品种。本发明的第一目的是这样实现的，包括序列表中所列出的Ns 9" Na 25任一序列的全部或者部分序列。本发明的另一目的是这样实现的，包括序列群获得、独立序列获得、未知序列筛选、新序列筛选、新序列鉴别，具体包括
A、序列群获得搜索和聚集目前公开的烟草基因组原始序列，建立一个烟草基因组序列数据库，以MITE-Hunter软件扫描该数据库，挖掘出；
B、独立序列获得侯选系列利用MITE二级结构的预测技术，归类MITE候选序列，并去除冗余序列，获得独立的MITE候选序列集合；
C、未知序列筛选；以这些候选MITE序列为模板，同源搜索目前所有的MITE序列数据库，去除已知获已报道的MITE序列，并筛选出未知类型的MITE候选序列；
D、新序列筛选以TD技术鉴定和分析每一类候选MITE序列在不同烟草品系的拷贝数和多态性，筛选出明确的MITE新序列集合；
E、新序列鉴别利用筛选完成的MITE新序列集合，分别设计Southern杂交探针、MP引物和TD引物，以Southern杂交、IMP和TD方法逐一评价以上这些MITE新序列的应用价值，并最终确认一种高分辨各类烟草品种方法的烟草基因组分子标记的探针与序列集合群。本发明的第三目在于烟草基因组分子标记的探针与序列集合群应用于下列领域(I)烟草分子标记辅助育种，也就是烟草新品种的选择和培育；(2)烟草遗传图谱的构建和烟草DNA指纹的鉴别；(3)在烟草基因组中定位重要的功能基因并克隆；(4)烟草重要农艺性状的早期鉴别和筛选；(5)不同烟草品系的亲缘关系鉴别(如在混杂的烟草样品中鉴别其品系构成、烟草栽培品系与其野生种的区分等)；(6)烟草产品的真伪鉴定(如特定品牌的烟草制品其原料构成等)。MITE是一类广泛分布于动植物基因组中的DNA转座元件，具有以下特征
(1)其序列长度一般不超过500个核苷酸碱基；
(2)其序列的5’和3’端分别具有末端反向重复(TerminalInverted Repeat, TIR),并可形成典型的发夹式二级结构，且同一家族成员的TIR序列高度保守； (3)在其转座到基因组的其他位置时，一般在插入点处产生靶标位点重复(TargetSite Duplication , TSD)的序列结构；
(4)拷贝数较高，并偏好插入到基因组编码区。Southern杂交是一种进行基因组DNA特定序列定位的重要技术。其原理是利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位转移至尼龙膜等固相支持物上，再与相对应标记探针进行杂交，通过用放射自显影或酶反应显色，检测特定DNA分子的含量及其位置。IMP是一种利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)来扩增相邻两个MITEs间的序列所具有的长度多态性的分子标记技术。根据MITE的保守TIR区设计引物，利用MITE自身拷贝数高，在基因组中分布均匀的特点，通过特异的几对MP弓I物组合即可达到覆盖整个基因组的目的。在水稻、玉米等作物的遗传标记开发中作为一种理想分子标记手段，已用于遗传图谱的构建和标记的辅助育种等研究。TD是一种在扩增片段长度多态性基础上改进的分子标记技术。它可以利用高拷贝保守的转座子在基因组中散布分布的特点发展新的分子标记，用于遗传连锁分析。TD技术具有操作简单、准确性高等特点，在水稻、玉米和拟南芥遗传进化研究中已经得到广泛应用。本发明自主鉴定和分离的新MITE转座元件，烟草分子标记探针和引物序列集合，来源于一系列新的微型反向重复转座元件，这些MITE引物序列可应用于烟草分子标记技术的建立和开发，具体包括Southern杂交探针、MP引物和TD引物的设计和制备。这些MITE引物序列，在烟草分子标记辅助育种、烟草遗传图谱的构建、烟草DNA指纹的鉴别、烟草重要的功能基因基因定位并克隆、烟草重要农艺性状的早期鉴别和筛选、不同烟草品系的亲缘关系鉴别以及烟草产品的真伪鉴定等方面具有广泛的应用前景。
图I为收集的24个烟草栽培样品的DNA多态性指纹图。烟草MITE元件的编号为Na :9。图中24个样品按I 24号的次序分别为MSK326、MS云烟85、MS云烟87、红大、K346、V2、z 烟 201、z 烟 202、z 烟 203、z 烟 97、z 烟 98、中烟 100、PVH19、z 烟 96、z 烟 99、z 烟100、云烟 108、云烟 105、KRK26、YH05、NC102、NC97、XYN87 和 KRK28。图2为烟草基因组中Ns :13序列的转座事件鉴定。C为对照gDNA样品，其来源为组织培养前取样的烟草品种K326的母体植株。I、号样品为来源于K326母体植株的一个幼嫩的叶片进行组织培养后的八个组培苗gDNA样品。核苷酸和氨基酸序列表中包括Pst I接头序列(Ns UNo :2)、T1P1A引物(Ns :3)、T1P2B引物(Ns :4)、接头特定引物Cl (Na :5)、接头特定引物C2 (Na :6)、T9P1A引物(Ns :7)、T9P2A引物(Ns 8)和编号为Ns :9 25的人工序列。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。本发明确定和设计的高分辨各类烟草品种方法的烟草基因组分子标记的探针与序列集合群，其核苷酸组成分别对应于本发明序列表中所列出的Ns 9"25所示序列的全部
或者部分序列。本发明所述的烟草基因组分子标记的探针与序列集合群获得方法，包括序列群获得、独立序列获得、未知序列筛选、新序列筛选、新序列鉴别，具体包括
所述的烟草MITE候选序列群的获得，是搜索和聚集目前公开的烟草基因组原始序列，建立一个烟草基因组序列数据库，以MITE-Hunter软件扫描该数据库，挖掘出；
所述的独立的烟草MITE候选序列的获得，是利用MITE二级结构的预测技术，归类MITE候选序列，并去除冗余序列，获得独立的MITE候选序列集合；
所述的新MITE候选序列的获得，是以这些候选MITE序列为模板，同源搜索目前所有的MITE序列数据库，去除已知获已报道的MITE序列，并筛选出未知类型的MITE候选序列；所述的候选MITE序列的DNA多态性鉴定，以TD技术鉴定和分析每一类候选MITE序列在不同烟草品系的拷贝数和多态性，筛选出明确的MITE新序列集合；
所述的MITE新序列集合的应用价值评价，利用筛选完成的MITE新序列集合，分别设计Southern杂交探针、IMP引物和TD引物，以Southern杂交、IMP和TD方法逐一评价以上这些MITE新序列的应用价值，并最终确认一种高分辨各类烟草品种方法的烟草基因组分子标记的探针与序列集合群。烟草基因组分子标记的探针与序列集合群的确认和设计，满足高分辨各类烟草品种的需要。下面以部分实施例进一步说明本发明
实施例I
(I)收集24个烟草栽培样品，分别为MSK326、MS云烟85、MS云烟87、红大、K346、V2、z 烟 201、z 烟 202、z 烟 203、z 烟 97、z 烟 98、中烟 100、PVH19、z 烟 96、z 烟 99、z 烟 100、云烟108、云烟105、KRK26、YH05、NC102、NC97、XYN87和KRK28。提取每个样品的脱氧核糖核酸(gDNA)。(2)以一种六碱基限制性核酸内切酶Pst I处理每一个gDNA样品，每50 μ L酶切反应体系中加入500 ng gDNA样品，以30单位的限制性内切酶Pst I，于37°C酶切gDNA样品3小时。(3)酶切完成的gDNA样品用异丙醇沉淀后，以I X连接缓冲液，10单位连接酶及50 ng Pst I接头于16°C连接45分钟，总反应体系为30 μ L。(4) Pst I接头序列如下5 ’ -GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGACTG-3’
3，-CATGTATAACAGCAATCTTGCGCATTATGCTGAGTGATATCCCTCTG-5，
(5)以序列表中的N29序列为模板，可以设计完成一组巢式PCR弓丨物组合，其详细序列如下
TlPlA 引物5’ -GTTAGCAAACCAGGTATAAGTTATC-3’
T1P2B 引物5’ -TAGCACCGTTATAACTTATACCTAC-3’
(6)PCR预扩增的引物为Ns 9序列的TlPlA引物及接头特定引物Cl，预扩增的总反应体系20 μ L，其中引物各4 pmol，l单位LA Taq DNA聚合酶，O. 2 mM dNTPs及IXPCR缓冲液。预扩增的反应程序为72°C 3 min;94°C预变性5 min ； 94°C变性30 s，58°C退火30s，72°C延伸60 s ;共进行22轮循环。 (7)接头特定引物Cl的序列如下
5’ -GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA -3’
(8)预扩增反应结束后，将预扩增产物稀释20倍，取2 UL为热扩增的模板，同位素标记的PCR总反应体系为20 μ，其中以I. 5 mM 1%(12，1父？0 缓冲液，1单位1^ Taq聚合酶，4 pmol T1P2B 引物，4 pmol 接头引物 C2，O. 2 mM dATP, dGTP 和 dTTP, O. 01 mM dCTP, Iμ L of [ a -33P-dCTP] (10 mCi/mL, Amersham)。热扩增反应程序为 94°C预变性 5 min ；94°C变性30 s，68°C退火30 s，72°C延伸60 s ;随后每轮的退火温度比上一轮低1°C，共计12轮后在退火温度56°C时进行20个循环。(9)接头特定引物C2的序列如下
5，-CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3，
(10)巢式PCR反应结束后，产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影。附图I给出了收集的24个烟草栽培样品的DNA多态性指纹，通过DNA指纹的多态性分布就可以区分和鉴定不同的烟草栽培样品。实施例2
(I)选择一个烟草品系(K326)为起始材料,为保持其遗传背景一致,仅取一个单株的一个幼嫩的叶片进行组织培养。(2)具体程序是将该叶片八等分后，每一个部分叶片单独进行组培成苗。(3)以上烟草K326幼嫩叶片经过3个月的组织培养后，在每一瓶中取单株组培苗抽提基因组gDNA，保存于一 20°C冰箱，用于后续的烟草MITE元件遗传稳定性的分析实验。(4)以序列表中的N2 :13序列为模板，可以设计完成一组巢式PCR引物组合，其详细序列如下
T9P1A 引物5’ - GTGTCAACCGACACTCCTTCGTAGG -3’
T9P2A 引物5，- TGACACCCCTTGACTTCTTGGTGAG -3，
(5)首先以T9P1A引物进行第一轮PCR扩增，PCR扩增的总反应体系20 μ L，其中单引物4 pmol，l单位LA Taq DNA聚合酶，O. 2 mM dNTPs及IXPCR缓冲液。扩增的反应程序为72°C 3 min ;94°C预变性 5 min ； 94°C变性 30 s，58°C退火 30 s，72°C延伸 60 s ;共进行22轮循环。(6)第一轮PCR扩增反应结束后，将扩增产物稀释20倍，取2 μ L为热扩增的模板，PCR总反应体系为20 μ，其中以I. 5 mM MgC12，I XPCR缓冲液，I单位LA Taq聚合酶，4 pmol T9P2A引物，O. 2 mM dNTPs。热扩增反应程序为94°C预变性5 min;94°C变性30 s,68°C退火30 s，72°C延伸60 s ;随后每轮的退火温度比上一轮低I°C，共计12轮后在退火温度56 °C时进行25个循环。
(7) PCR反应结束后，产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离。附图2给出这组烟草组培苗的DNA多态性指纹，通过对比DNA指纹的多态性，就可以鉴定Ns 13序列在烟草基因组是否发生转座事件。
权利要求
1.一种烟草基因组分子标记探针与序列集合群，其特征在于包括序列表中所列出的No 9 No 25任一序列的全部或者部分序列。
2.—种权利要求I所述的烟草基因组分子标记探针与序列集合群的获得方法，包括序列群获得、独立序列获得、未知序列筛选、新序列筛选、新序列鉴别，其特征在于(具体包括) A、序列群获得搜索和聚集目前公开的烟草基因组原始序列，建立一个烟草基因组序列数据库，以MITE-Hunter软件扫描该数据库，挖掘出； B、独立序列获得侯选系列利用MITE二级结构的预测技术，归类MITE候选序列，并去除冗余序列，获得独立的MITE候选序列集合； C、未知序列筛选；以这些候选MITE序列为模板，同源搜索目前所有的MITE序列数据库，除去已知获已报道的MITE序列，并筛选出未知类型的MITE候选序列； D、新序列筛选以TD技术鉴定和分析每一类候选MITE序列在不同烟草品系的拷贝数和多态性，筛选出明确的MITE新序列集合； E、新序列鉴别利用筛选完成的MITE新序列集合，分别设计Southern杂交探针、MP引物和TD引物，以Southern杂交、IMP和TD方法逐一评价以上这些MITE新序列的应用价值，并最终确认一种高分辨各类烟草品种方法的烟草基因组分子标记的探针与序列集合群。
3.如权利要求2所述的获得方法及其优化的PCR反应体系。
4.一种如权利要求I所述的烟草基因组分子标记的探针与序列集合群的用于烟草分子标记辅助育种，也就是烟草新品种的选择和培育。
5.一种如权利要求I所述的烟草基因组分子标记的探针与序列集合群的用于烟草遗传图谱的构建和烟草DNA指纹的鉴别。
6.一种如权利要求I所述的烟草基因组分子标记的探针与序列集合群的用于在烟草基因组中定位重要的功能基因并克隆。
7.—种如权利要求I所述的烟草基因组分子标记的探针与序列集合群的用于烟草重要农艺性状的早期鉴别和筛选。
8.—种如权利要求I所述的烟草基因组分子标记的探针与序列集合群的用于不同烟草品系的亲缘关系鉴别，在混杂的烟草样品中鉴别其品系构成、烟草栽培品系与其野生种的区分。
9.一种如权利要求I所述的烟草基因组分子标记的探针与序列集合群的用于烟草产品的真伪鉴定，鉴别烟草制品中的原料构成。
全文摘要
本发明公开了一种烟草基因组分子标记探针与序列集合群及获得方法与应用，该探针和引物集合具有全部或者部分№9~25所示的任何一种核苷酸序列。本发明所提供的这些新的探针和引物序列集合，是来源于本专利发明人所分离鉴定的一系列新的微型反向重复转座元件。所述的探针与引物依次通过序列群、独立序列获得，新序列筛选与鉴别获得，并可应用于下列领域1、烟草分子标记辅助育种，应用于传统烟草新品种的选择和培育，加快其进程；2、烟草遗传图谱的构建和烟草DNA指纹的鉴别；3、在烟草基因组中重要的功能基因定位和克隆；4、烟草重要农艺性状的早期鉴别和筛选；5、不同烟草品种或品系材料的亲缘关系鉴别；6、烟草产品(包括卷烟)的真伪鉴定。
文档编号C12N15/10GK102757956SQ20121024898
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月18日 优先权日2012年7月18日
发明者刘勇, 张家瑞, 李文正, 王丙武, 邵岩, 顾华国 申请人:云南省烟草农业科学研究院