专利名称：可靶向激活traf6信号通路的融合蛋白及其重组载体与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白的构建，特别涉及一种可靶向激活TRAF6信号通路的融合蛋白及其重组载体与应用。
背景技术：
肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TNF receptor-associated factor6, TRAF6)是细胞内的一个信号传导分子，它具有广泛而且极其重要的生理功能。TRAF6对于牙齿形成、淋巴结形成、破骨细胞形成是必不可少的；TRAF6能指导胸腺髓质微细构造的形成从而控制机体的中枢免疫耐受；TRAF6是调节性T淋巴细胞产生的关键因子；TRAF6在固有免疫和获得性免疫反应中发挥着重要作用；TRAF6对于二级淋巴器官B细胞滤泡的形成和维持是必 不可少的；TRAF6还是炎性反应中的重要信号传导分子等等。以上研究预示TRAF6是上述疾病治疗中的一个极其重要的靶标分子。通常情况下，选择TRAF6对上述疾病进行治疗时首选利用相应配体激活TRAF6上游受体，然而，TRAF6可传导来自细胞表面的多个受体的信号，这些受体表达在多种细胞上，当利用受体的配体激活TRAF6信号通路时，常常会引起许多的副作用，有的甚至是致死性的。因此，需要对TRAF6进行改造，使其既保留TRAF6的功能，又要克服其引起副作用的缺陷。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种可靶向激活TRAF6信号通路的融合蛋白。本发明的另一目的在于提供含有编码上述融合蛋白的核苷酸序列的重组载体。本发明的再一目的在于提供上述重组载体的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种可靶向激活TRAF6信号通路的融合蛋白，其氨基酸序列如下所示MSLLNCENSCGSSQSSSDCCAAMAASCSAAVKDDSVSGSASTGNLSSSFMEEIQGYDVEFDPPLESKYECPICLMALREAVQTPCGHRFCKACIIKSIRDAGHKCPVDNEILLENQLFPDNFAKREIL SLTVKCPNKGCLQKMELRHLEDHQVHCEFALVNCPQCQRPFQKCQVNTHIIEDCPRRQVSCVNCAVSMAYEEKEIHDQSCPLANIICEYCGTILIREQMPNHYDLDCPTAPIPCTFSVFGCHEKMQRNHLARHLQENTQLHMRLLAQAVHNVNLALRPCDAASPSRGCRPEDPNYEETIKQLESRLVRQDHQIRELTAKMETQSMYVGELKRTIRTLEDKVAEMEAQQCNGIMSNSYDSSSIKVLKGLDAVRKRPGMYIGDTDDGTGLHHMVFEVVDNAIDEALAGHCKEIIVTIHADNSVSVQDDGRGIPTGIHPEEGVSAAEVIMTVLHAGGKFDDNSYKVSGGLHGVGVSVVNALSQKLELVIQREGKIHRQIYEHGVPQAPLAVTGETEKTGTMVRFWPSLETFTNVTEFEYEILAKRLRELSFLNSGVSIRLRDKRDGKEDHFHYEGYPYDVPDYAI ；编码所述的可靶向激活TRAF6信号通路的融合蛋白的核苷酸序列如下所示
ATGAGTCTCTTAAACTGTGAGAACAGCTGCGGGTCCAGCCAGTCGTCCAGTGACTGCTGCGCTGCCATGGCCGCCTCCTGCAGCGCTGCAGTGAAAGATGACAGCGTGAGTGGCTCTGCCAGCACCGGGAACCTCTCCAGCTCCTTCATGGAGGAGATCCAGGGCTACGATGTGGAGTTTGACCCACCTCTGGAGAGCAAGTATGAGTGTCCCATCTGCTTGATGGCTTTACGGGAAGCAGTGCAAACACCATGTGGCCACAGGTTCTGCAAAGCCTGCATCATCAAATCCATAAGGGATGCAGGGCACAAGTGCCCAGTTGACAATGAAATACTGCTGGAAAATCAACTGTTTCCCGACAATTTTGCAAAGCGAGAGATTCTTTCCCTGACGGTAAAGTGCCCAAATAAAGGCTGTTTGCAAAAGATGGAACTGAGACATCTCGAGGATCATCAAGTACATTGTGAATTTGCTCTAGTGAATTGTCCCCAGTGCCAACGTCCTTTCCAGAAGTGCCAGGTTAATACACACATTATTGAGGATTGTCCCAGGAGGCAGGTTTCTTGTGTAAACTGTGCTGTGTCCATGGCATATGAAGAGAAAGAGATCCATGATCAAAGCTGTCCTCTGGCAAATATCATCTGTGAATACTGTGGTACAATCCTCATCAGAGAACAGATGCCTAATCATTATGATCTGGACTGCCCAACAGCTCCAATCCCTTGCACATTCAGTGTTTTTGGCTGTCATGAAAAGATGCAGAGGAATCACTTGGCACGACACTTGCAAGAGAATACCCAGTTGCACATGAGACTGTTGGCCCAGGCTGTTCATAATGTTAACCTTGCTTTGCGTCCGTGCGATGCCGCCTCTCCATCCCGGGGATGTCGTCCAGAGGACCCAAATTATGAGGAAACTATCAAACAGTTGGAGAGTCGCCTAGTAAGACAGGACCATCAGATCCGGGAGCTGACTGCCAAAATGGAAACTCAGAGTATGTACGTGGGCGAGCTCAAACGGACCATTCGGACCCTGGAGGACAAGGTTGCCGAAATGGAAGCACAGCAGTGTAACGAATTCATGTCGAACTCTTATGACTCCTCCAGTATCAAAGTCCTGAAAGGGCTGGATGCGGTGCGTAAGCGCC CGGGTATGTATATCGGCGACACGGATGACGGCACCGGTCTGCACCACATGGTATTCGAGGTGGTAGATAACGCTATCGACGAAGCGCTCGCGGGTCACTGTAAAGAAATTATCGTCACCATTCACGCCGATAACTCTGTCTCTGTACAGGATGACGGGCGCGGCATTCCGACCGGTATTCACCCGGAAGAGGGCGTATCGGCGGCGGAAGTGATCATGACCGTTCTGCACGCAGGCGGTAAATTTGACGATAACTCCTATAAAGTGTCCGGCGGTCTGCACGGCGTTGGTGTTTCGGTAGTAAACGCCCTGTCGCAAAAACTGGAGCTGGTTATCCAGCGCGAGGGTAAAATTCACCGTCAGATCTACGAACACGGTGTACCGCAGGCCCCGCTGGCGGTTACCGGCGAGACTGAAAAAACCGGCACCATGGTGCGTTTCTGGCCCAGCCTCGAAACCTTCACCAATGTGACCGAGTTCGAATATGAAATTCTGGCGAAACGTCTGCGTGAGTTGTCGTTCCTCAACTCCGGCGTTTCCATTCGTCTGCGCGACAAGCGCGACGGCAAAGAAGACCACTTCCACTATGAAGGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTAA ；一种重组载体，含有上述核苷酸序列的基因；所述的重组载体优选为将上述核苷酸序列的基因克隆至慢病毒载体得到；所述的慢病毒载体优选为CSII-EF-RfA-IRES2-Venus ；所述的重组载体优选为CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-T6RZ-GH重组质粒，其通过如下方法制备得到(I)以结核杆菌DNA为模板，以FP和RP为引物，PCR反应获得Gyrase B基因；FP ATCGGAATTCATGTCGAACTCTTATGACTCCTCC ；RP ATCCACTAGTTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGCCTTCATAGTGGAAGTGGTCTTC ；(2)通过EcoR I酶和Spe I酶分别双酶切pENTR_2B载体和步骤(I)得到的Gyrase B基因，酶切后纯化，得到双酶切的pENTR_2B载体和双酶切的GyraseB基因；再将双酶切的PENTR-2B载体和双酶切的Gyrase B基因连接，得到重组载体pENTR-2B_GyraseB-HA ;用EcoR I酶单酶切重组载体pENTR-2B-GyraseB-HA，去磷酸化，得到单酶切后的pENTR-2B-Gyrase B-HA ；(3)以小鼠脾脏cDNA为模板，FP2和RP2为引物，PCR反应扩增得到包含TRAF6基因的RING区域、ZINC区域和Coiled-coil区域的DNA片段；用EcoRI酶单酶切包含TRAF6基因的RING区域、ZINC区域和Coiled-coil区域的DNA片段，得到单酶切后的包含TRAF6基因的RING区域、ZINC区域和Coiled-coil区域的DNA片段；FP2 ATCGGAATTCATGAGTCTCTTAAACTGTGAG ；RP2 ATCCGAATTCGTTACACTGCTGTGCTTCCATTTC ；(4)将步骤(2)得到的单酶切后的pENTR-2B_Gyrase B-HA和步骤(3)得到的单酶切后的包含TRAF6基因的RING区域、ZINC区域和Coiled-coil区域的DNA片段连接，得到重组载体 PENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GH ；(5)通过 Gateway 技术将位于重组载体 pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC_GH 上的T6RZ-GH双链DNA片段转移至慢病毒载体CSII-EF-RfA-IRES2-Venus上，得到重组质粒CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-T6RZ-GH ；
步骤(I)和(2)中所述的PCR反应的条件优选为94 V 2min ；94 V 15sec、55°C 15sec、68°C 30sec，30 个循环；72°C IOmin ；步骤(5)所述的Gateway技术的反应体系优选为
pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GHI OOng
CSII-EF-RfA-IRES2-Venus150ng
LR cionase II enzyme mixI μ I
TE (IOrnM Tris-HC! , ImMEDTA, pH 俏为 8) 补伞:9μ.1;反应条件优选为25°C下反应6小时，加1μ I蛋白酶K (浓度为2 μ g/μ I )，37°C反应10分钟；所述的重组载体在TRAF6功能研究中的应用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)本发明提供的融合蛋白为利用一段gyrase B序列代替小鼠TRAF6的C末端得至IJ。该融合蛋白在细胞内表达后，能接受小分子药物香豆霉素的持续刺激，靶向激活TRAF6依存的信号通路，从而可避免利用受体的配体激活TRAF6信号通路进行疾病治疗时引起的副作用。(2)本发明构建了一个重组小鼠TRAF6质粒，可表达上述融合蛋白，载体骨架为慢病毒质粒，利用慢病毒转染，既适合于体内研究也适合于体外研究，既可用于分裂细胞也可用于非分裂细胞，既能用于短暂研究也能用于长期观察；转染效率能通过细胞的绿色荧光确定。因此，重组小鼠TRAF6基因慢病毒质粒对于TRAF6的功能研究以及TRAF6引起的疾病治疗研究都具有极其重要的价值。重组小鼠TRAF6慢病毒质粒有着非常大的商业价值。香豆霉素刺激导入重组小鼠TRAF6慢病毒质粒后的细胞，I K Ba的磷酸化效果与IL-I刺激的未导入重组小鼠TRAF6慢病毒质粒后的细胞相同。
图I是蛋白质印迹技术检测TRAF6融合蛋白在NIH3T3细胞中的表达结果图。图2是蛋白质印迹技术检测不同浓度香豆霉素靶向刺激的TRAF6特异性依存的I K Ba的磷酸化表达，IL-I刺激的I K B a的磷酸化作为阳性对照。
图3是浓度为O. 05 μ M的香豆霉素不同时间内靶向刺激的TRAF6特异性依存的I K Ba的磷酸化表达，微管蛋白作为内参。图4是浓度为O. 05 μ M的香豆霉素不同时间内刺激的未导入任何质粒的3Τ3细胞后的I K Ba的磷酸化表达，微管蛋白作为内参。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步 详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I(I)重组载体 pENTR_2B-Gyrase B-HA 的制备①通过PCR反应获得Gyrase B基因，引物(均为5’ _3’，华大基因公司合成)如下所示FP ATCGGAATTCATGTCGAACTCTTATGACTCCTCC ；RP ATCCACTAGTTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTA GCCTTCATAGTGGAAGTGGTCTTC。按照以下体系配合PCR反应液
结核杆菌 DNA (购自 Invitrogen)200ng
IOx高保真PCR缓冲液5μ1
IOmM dNTP 浞介液Ιμ
SOmM硫酸镁2μ1
ΙΟμΜ FP2μ1 ΙΟμΜΚΡ2μ1 Platinum Taq 高保真 DNA 聚合酶(购自 Invitrogen) 0·2μ1
灭菌蒸馏水至50μ1。按照下列程序进行PCR反应起始变性94 V 2min ；变性94 V 15sec、复性550C 15sec、延伸 68°C 30sec，30 个循环；72°C IOmin0②在步骤①得到的PCR产物中加入2. 5倍体积冰冻的无水乙醇(同时加入O. I倍、PH5. 6的3M醋酸钠)沉淀，该沉淀物按以下反应体系配合PCR沉淀物
IOxH酶切缓冲液2μ1
EcoR I (:购〔I TAKARA)Ιμ (购自 TAKARA)Ιμ
灭菌蒸馏水至20μ1;以上反应体系37°C处理2小时，电泳，回收Gyrase B基因片段。按照以下体系配合酶切反应体系
pENTR-2B 载体(购自 Invitrogen)Ipg
IOxH酶切缓冲液2μ1
EcoR I (购自 TAKARA)I μ
净el (购自 TAKARA)Ιμ
灭菌蒸馏水至20μ1;以上反应体系37°C处理2小时，电泳，回收目的片段。将酶切后的pENTR-2B载体与酶切后的Gyrase B基因片段进行连接，得到重组载体 pENTR-2B-Gyrase B-HA (以下简称 pENTR_2B_GH)。连接体系如下双链DNA 片段 lOOng、pENTR-2B 载体 20ng、DNA LigationKitVer. 2. O (购自TAKARA公司)5 μ 1，双蒸水补至10 μ I。16°C连接12小时，接着用1μ I连接液转化大肠杆菌感受态细胞DH5a (购自TAKARA公司)，培养于依据分子克隆配方配制的LB固体培养基，其中含有50 μ g/ml的卡那霉素进行选择。生长出来的克隆即为阳性克隆，挑取阳性克隆培养于依据分子克隆配方配制的含有卡那霉素的LB液体培养基中，抽提，得到重组载体，通过测序，确定得到含有Gyrase B基因序列(如下所示)和通过引物RP加入的HA序列的重组质粒pENTR_2B_GH。 ATGTCGAACTCTTATGACTCCTCCAGTATCAAAGTCCTGAAAGGGCTGGATGCGGTGCGTAAGCGCCCGGGTATGTATATCGGCGACACGGATGACGGCACCGGTCTGCACCACATGGTATTCGAGGTGGTAGATAACGCTATCGACGAAGCGCTCGCGGGTCACTGTAAAGAAATTATCGTCACCATTCACGCCGATAACTCTGTCTCTGTACAGGATGACGGGCGCGGCATTCCGACCGGTATTCACCCGGAAGAGGGCGTATCGGCGGCGGAAGTGATCATGACCGTTCTGCACGCAGGCGGTAAATTTGACGATAACTCCTATAAAGTGTCCGGCGGTCTGCACGGCGTTGGTGTTTCGGTAGTAAACGCCCTGTCGCAAAAACTGGAGCTGGTTATCCAGCGCGAGGGTAAAATTCACCGTCAGATCTACGAACACGGTGTACCGCAGGCCCCGCTGGCGGTTACCGGCGAGACTGAAAAAACCGGCACCATGGTGCGTTTCTGGCCCAGCCTCGAAACCTTCACCAATGTGACCGAGTTCGAATATGAAATTCTGGCGAAACGTCTGCGTGAGTTGTCGTTCCTCAACTCCGGCGTTTCCATTCGTCTGCGCGACAAGCGCGACGGCAAAGAAGACCACTTCCACTATGAAGGC。(2)重组载体 pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GH 的制备①通过PCR反应获得包含TRAF6基因的RING区域、ZINC区域和Coiled-coil区域的DNA片段，引物(均为5’ _3’，华大基因公司合成)如下所示FP2 ATCGGAATTCATGAGTCTCTTAAACTGTGAGRP2 :ATCCGAATTCGTTACACTGCTGTGCTTCCATTTC。按照以下体系配合PCR反应液cDNA模板(按照常规方法由3μ g来自C57BL/6J小鼠(购自广东省医学实验动物中心)脾脏的RNA合成)2μ1IOx高保真PCR缓冲液5μ1
i0m!Vi dNTP 浞介液Ιμ
SOmM硫酸镁2μ1
ΙΟμΜ FP22μΙ
ΙΟμΜ RP22μ1
Platinum Taq 高保真 DNA 聚合酶(购自 Invitrogen)0.2μ1
灭菌蒸馏水至50μ1。按照下列程序进行PCR反应起始变性94 V 2min ；变性94 V 15sec、复性 550C 15sec、延伸 68°C 30sec，35 个循环；72°C IOmin0②在步骤①得到的PCR产物中加入2. 5倍体积冰冻的无水乙醇(同时加入O. I倍、PH5. 6的3M醋酸钠)沉淀，该沉淀物按以下反应体系配合
PCR沉淀物
IOxH酶切缓冲液2μ1
EcoR I (购自 TAKARA)I μ
灭菌蒸馏水至20_以上反应体系37°C处理2小时，电泳，回收目的基因TRAF6基因片段。按照以下体系配合酶切反应体系
pENTR~2B~GH 质粒1μ§
IOxH酶切缓冲液2μ1
EcoR I (购自 TAKARA)Iμ
灭菌蒸馏水至20μ1。以上反应体系37°C处理2小时，加入碱性磷酸酶CIAP (购自TAKARA)，37°C处理30min,电泳，回收载体片段。将酶切后的pENTR-2B-GH载体与酶切后的TRAF6基因片段进行连接，得到重组载体 pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GH (以下简称 pENTR-2B-T6RZ_GH)。连接体系如下双链DNA 片段 lOOng、pENTR_2B_GH 载体 20ng、DNALigation KitVer. 2. 0 (购自TAKARA公司)5 μ 1，双蒸水补至10 μ I ；16°C连接12小时，接着用1μ I连接液转化大肠杆菌感受态细胞DH5a (购自TAKARA公司)，培养于依据分子克隆配方配制的LB固体培养基，其中含有50 μ g/ml的卡那霉素进行选择。生长出来的克隆即为阳性克隆，挑取阳性克隆培养于依据分子克隆配方配制的含有卡那霉素的LB液体培养基中，抽提，得到重组载体，通过测序，确定得到含有TRAF6 RING区域(如下所示)、TRAF6 ZINC区域(如下所示)、Gyrase B序列和HA序列的重组质粒 pENTR-2B-T6RZ-GH。TRAF6 位于 Gyrase B 序列的 5’ 端。
小鼠TRAF6的RING序列和ZINC序列(1074bp)，如下所示ATGAGTCTCTTAAACTGTGAGAACAGCTGCGGGTCCAGCCAGTCGTCCAGTGACTGCTGCGCTGCCATGGCCGCCTCCTGCAGCGCTGCAGTGAAAGATGACAGCGTGAGTGGCTCTGCCAGCACCGGGAACCTCTCCAGCTCCTTCATGGAGGAGATCCAGGGCTACGATGTGGAGTTTGACCCACCTCTGGAGAGCAAGTATGAGTGTCCCATCTGCTTGATGGCTTTACGGGAAGCAGTGCAAACACCATGTGGCCACAGGTTCTGCAAAGCCTGCATCATCAAATCCATAAGGGATGCAGGGCACAAGTGCCCAGTTGACAATGAAATACTGCTGGAAAATCAACTGTTTCCCGACAATTTTGCAAAGCGAGAGATTCTTTCCCTGACGGTAAAGTGCCCAAATAAAGGCTGTTTGCAAAAGATGGAACTGAGACATCTCGAGGATCATCAAGTACATTGTGAATTTGCTCTAGTGAATTGTCCCCAGTGCCAACGTCCTTTCCAGAAGTGCCAGGTTAATACACACATTATTGAGGATTGTCCCAGGAGGCAGGTTTCTTGTGTAAACTGTGCTGTGTCCATGGCATATGAAGAGAAAGAGATCCATGATCAAAGCTGTCCTCTGGCAAATATCATCTGTGAATACTGTGGTACAATCCTCATCAGAGAACAGATGCCTAATCATTATGATCTGGACTGCCCAACAGCTCCAATCCCTTGCACATTCAGTGTTTTTGGCTGTCATGAAAAGATGCAGAGGAATCACTTGGCACGACACTTGCAAGAGAATACCCAGTTGCACATGAGACTGTTGGCCCAGGCTGTTCATAATGTTAACCTTGCTTTGCGTCCGTGCGATGCCGCCTCTCCATCCCGGGGATGTCGTCCAGAGGACCCAAATTATGAGGAAACTATCAAACAGTTGGAGAGTCGCCTAGTAAGACAGGACCATCAGATCCGGGAGCTGACTGCCAAAATGGAAACTCAGAGTATGTACGTGGGCGAGCTCAAACGGACCATTCGGACCCTGGAGGACAAG GTTGCCGAAATGGAAGCACAGCAGTGTAAC。(3 )通过Gateway技术将位于重组载体pENTR-2B-T6RZ_GH上的T6RZ-GH双链DNA片段转移至慢病毒载体CSII-EF-RfA-IRES2-Venus (日本理化学研究，www. brc.riken. jp/lab/cfm/)上，得到重组质粒 CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-T6RZ-GH (以下简称为LV-T6RZ-GH)。同样的方法将位于重组质粒pENTR-2B-GH上的GH双链DNA片段转移至慢病毒载体 CSII-EF-RfA-IRES2-Venus 上，得到 CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-GH 重组质粒(以下简称为 LV-GH)。具体操作过程如下
pENTR-2B-T6RZ-GH (或荇 pENTR-2B-GH)IOOng
CSIi-EF-RfA-丨 RES2-Venus150ng
LR clonase II enzyme mix (购「I Invitrogen 公！ ij)I μ
TE (IOmM Tris-HCK ImMEDTA, ρΗ{[ 为 8 ) 补个:9μ1。25°C下反应6小时，加1μ I蛋白酶K (浓度为2μ g/μ 1)，37°C反应10分钟以清除多余的LR clonase II enzyme。接着取I μ I上述反应液转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞(购自TAKARA公司)，于30°C在含有100 μ g/ml氨苄青霉素的LB固体培养基中培养22 24小时，生长出来的克隆即为阳性克隆。挑取阳性克隆，培养于含有100 μ g/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，30°C下培养20小时，纯化质粒。通过Kpn I酶切质粒检测，获得了正确的重组质粒，经测序，TRAF6RING-ZINC-GH的序列如SEQ ID NO. 2所示，将此重组质粒定义为LV-T6RZ-GH (或者LV-GH)慢病毒质粒。用Qiagen公司的质粒大量提取试剂盒提取该重组质粒。(4 ) LV-T6RZ-GH重组质粒的表达检测。
A、用钙-磷质粒导入法，将LV-T6RZ-GH、pCMV-VSV-G-RSV-Rev (购自日本理化学研究所，http://www. brc. riken. jp/lab/cfm)以及pCAG-HIVgp (购自日本理化学研究所)按照质量比5:2:2的比例导入到人胚肾293T细胞(购自ATCC)中，为实验组；以LV-GH、pCMV-VSV-G-RSV-Rev以及pCAG-HIVgp按照质量比5:2:2的比例导入到人胚肾293T细胞，为对照组；搜集细胞培养的上清液即得到含有LV-T6RZ-GH (或者LV-GH)慢病毒质粒的病毒。B、用含有LV-T6RZ-GH质粒的病毒感染小鼠NIH3T3细胞(购自ATCC)。感染步骤如下将5X104fNIH3T3细胞与I X 106iu病毒液混悬于DMEM培养基中，按200 μ I混合液/孔的用量配制，每200 μ I混合液还包含体积百分比10%的胎牛血清(FBS)、100iu/ml的青霉素和链霉素，混匀后放于48well的平板培养皿中，37°C下培养I. 5hr，加入500 μ I培养液(DMEM+10%FBS+100iu/ml青霉素+ 100iu/ml链霉素)，继续培养24hr，传代培养，用含有LV-GH质粒的病毒感染NIH3T3细胞作为对照。培养10天后(长期观察)，荧光显 微镜下利用血细胞计数器检测质粒的导入率(质粒导入后，细胞表达Venus)，均为90%以上。收集这些细胞，通过标准的蛋白质印迹技术(步骤见Developmental stage-dependentcollaboration between the TRAF6 and lymphotoxin pathways forB-cell follicleorganization in secondary lymphoid organs. J Immunol. 2007,179(10):6799-6807),利用TRAF6抗体(购自SantaCruz公司)和HA抗体(购自SantaCruz公司)检测NIH3T3细胞中T6RZ-GH的表达情况，结果如图I所示。该结果说明LV-T6RZ-GH重组质粒成功导入小鼠NIH3T3细胞并表达TRAF6融合蛋白。C、分别用最终浓度为0. 01μΜ、0. 1μΜ、1μΜ、5μΜ、10μΜ的香豆霉素(coumermycin Al,购自Sigma公司)刺激导入LV-T6RZ-GH质粒的NIH3T3细胞15min和30min ;用最终浓度为0. 05 μ M的coumermycin Al刺激导入LV-GH质粒的NIH3T3细胞15min、30min、60min ;用IL-I刺激(购自PEPR0TECH公司)未导入任何质粒的NIH3T3细胞15min,通过标准的蛋白质印迹技术,利用ρ-Ι-kB α抗体(购自CellSignaling公司)检测可知这些浓度的coumermycin Al均可刺激导入LV-T6RZ-GH质粒的NIH3T3细胞中的I_kB α的磷酸化，而使用低浓度的coumermycin Al刺激效果更好,与IL-I刺激的阳性对照相同，而coumermycin Al不能刺激导入LV-GH质粒的NIH3T3细胞中的I_kB α的磷酸化(如图2所示)。D、通过标准的蛋白质印迹技术检测，内参为微管蛋白a-tubulin(购自SantaCruz公司)。进一步使用最终浓度为0.05μ M的coumermycin Al刺激导入LV-T6RZ-GH质粒的NIH3T3细胞15min、30min、60min，均可诱导细胞中I_kB α的磷酸化；而用最终浓度为0. 05 μ M 的 coumermycin Al 刺激导入 LV-GH 质粒的 NIH3T3 细胞 15min、30min、60min 却不能诱导I-kBa的磷酸化(如图3所示)。这些结果表明coumermycinAl可祀向激活TRAF6依存的信号通路。E、利用香豆霉素处理未作任何处理的NIH3T3细胞(与本实验中导入LV-GH或者LV-T6RZ-GH的NIH3T3相同来源，表达TRAF6)，没有ΙκΒα的磷酸化发生(如图4所示);同样的，将TRAF6表达质粒导入293Τ细胞，利用香豆霉素处理，也没有I κ Ba的磷酸化发生(结果没有显示)。这些结果进一步说明利用coumermycin Al刺激导入LV-T6RZ-GH质粒的NIH3T3细胞诱导的I-kB a的磷酸化是coumermycin Al靶向激活的TRAF6特异性依存的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 ·
权利要求
1.一种可靶向激活TRAF6信号通路的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ IDNO. I所示。
2.根据权利要求I所述的可靶向激活TRAF6信号通路的融合蛋白，其特征在于编码所述的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.—种重组载体，其特征在于含有编码如权利要求I所述的可靶向激活TRAF6信号通路的融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于所述的重组载体为将SEQIDNO. 2所示的基因克隆至慢病毒载体得到。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述的慢病毒载体为CSII-EF-RfA-IRES2-Venus。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于所述的重组载体为CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-T6RZ-GH重组质粒，其通过如下方法制备得到 (1)以结核杆菌DNA为模板，以FP和RP为引物，PCR反应获得GyraseB基因；FP ATCGGAATTCATGTCGAACTCTTATGACTCCTCC ；RP ATCCACTAGTTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTA GCCTTCATAGTGGAAGTGGTCTTC ； (2)通过EcoRI酶和Spe I酶分别双酶切pENTR_2B载体和步骤(I)得到的GyraseB基因，酶切后纯化，得到双酶切的PENTR-2B载体和双酶切的GyraseB基因；再将双酶切的PENTR-2B载体和双酶切的Gyrase B基因连接，得到重组载体pENTR-2B_GyraseB-HA ;用EcoR I酶单酶切重组载体pENTR-2B-GyraseB-HA，去磷酸化，得到单酶切后的pENTR-2B-Gyrase B-HA ； (3)以小鼠脾脏cDNA为模板，FP2和RP2为引物，PCR反应扩增得到包含TRAF6基因的RING区域、ZINC区域和Coiled-coiI区域的DNA片段；用EcoRI酶单酶切包含TRAF6基因的RING区域、ZINC区域和Coiled-coil区域的DNA片段，得到单酶切后的包含TRAF6基因的RING区域、ZINC区域和Coiled-coil区域的DNA片段；FP2 ATCGGAATTCATGAGTCTCTTAAACTGTGAGRP2 ATCCGAATTCGTTACACTGCTGTGCTTCCATTTC ； (4)将步骤(2)得到的单酶切后的pENTR-2B-GyraSeB-HA和步骤(3)得到的单酶切后的包含TRAF6基因的RING区域、ZINC区域和Coiled-coil区域的DNA片段连接，得到重组载体 pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GH ； (5 )通过 Gateway 技术将位于重组载体 pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC_GH 上的 T6RZ-GH 双链DNA片段转移至慢病毒载体CSII-EF-RfA-IRES2-Venus上，得到重组质粒CSII-EF-RfA-IRES2-Venus-T6RZ-GH。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于 步骤(I)和(2)中所述的PCR反应的条件为94°C 2min ；94°C 15sec、55°C 15sec、68°C 30sec，30 个循环；72°C IOmin0
8.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于 步骤(5)所述的Gateway技术的反应体系为pENTR-2B-TRAF6RING-ZINC-GHIOOng CSII-EF-R FA-IR ES2-Venus150ngLR clona.se Ii enzyme mixI ‘u..lTE补至 9jil: 其中，TE 的组成为 IOmM Tris-HCl、ImMEDTA，pH 值为 8 ； 反应条件为25°C下反应6小时，加Iiil浓度为2iig/iil的蛋白酶K，37°C反应10分钟。
9.权利要求3 8任一项所述的重组载体在TRAF6功能研究中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种可靶向激活TRAF6信号通路的融合蛋白及其重组载体与应用。该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，为利用一段gyrase B序列代替小鼠TRAF6的C末端得到；编码该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。该融合蛋白导入细胞后，能接受小分子药物香豆霉素的持续刺激，靶向激活TRAF6依存的信号通路，从而可避免利用受体的配体激活TRAF6信号通路进行疾病治疗时引起的副作用。一种重组载体，含有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。该重组载体对于TRAF6的功能研究以及TRAF6引起的疾病治疗研究都具有极其重要的价值。
文档编号C12N15/867GK102807622SQ20121025034
公开日2012年12月5日 申请日期2012年7月18日 优先权日2012年7月18日
发明者秦俊文, 谢琪璇, 蔡冬青, 秋山泰身, 井上纯一郎, 禹艳红, 齐绪峰, 武征 申请人:暨南大学