专利名称：一类人工靶向融合蛋白和蛋白偶联物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及制药及分子诊断领域，具体而言，本发明涉及一类半衰期和靶向性可进行人工改造而不影响其稳定性和功能部分的非抗体类靶向结合分子，及其衍生的融合蛋白或蛋白偶联物，乃至以上蛋白的制备方法和应用。
背景介绍非抗体类祀向结合分子(non-antibodyscaffold ；antibody mimetics)是新一代靶向药物的发展方向。与抗体类似，非抗体类靶向结合分子能够实现高度的特异性和亲和力，具备高度的热稳定性，但体积只有抗体的1/5-1/10甚至更小，而且能够避免抗体药物产业化中的几个关键性制约因素，如(I)生产成本高；(2)穿透性差，修饰困难；(3)局限于部分疾病靶点；(4)关键性技术(如人源化、生产、筛选文库等)已被垄断，知识产权附加费 高昂。非抗体类靶向结合分子能够在成本低廉的大肠杆菌和酵母细胞进行生产，容易修饰，而且理论上能够结合绝大多数疾病靶点，包括化学分子、多肽和各种构型的蛋白靶点。非抗体类靶向结合分子的产业化刚起步，知识产权争端少。以上这些特点，使非抗体类靶向结合分子的药物产业化具备广阔的发展空间。从1997年到现在，约60个非抗体类靶向结合分子原型蛋白被发现，至少38个品种处于临床前研究，超过10个品种进入临床阶段(6个品种处于2期)，2009年10月，有I个上市药物(Ecallantide,美国Dyax公司)。预计第一批非抗体类祀向结合分子药物的上市将于2015年前出现。目前该领域的代表性核心专利如下锚蛋白重复蛋白(EP1332209);C-型凝集素(US2004132094，EP1341912);金黄色葡萄球菌A结构域蛋白(US5831012，EP0739353);转铁蛋白(US2004023334，EP1427750);载脂蛋白(US7250297，EP1017814)；纤维连接蛋白(US6818418，EP1266025) ；Kunitz结构域型蛋白酶抑制剂(US2004209243，EP1587907);伽马晶状体(US2007111287，EP1200583);半胱氨酸结或打结素(US7186524，EP1328628);硫氧还蛋白 A (US6004746, EP0773952);核酸配基(US5475096，EP0786469)；定向进化获得的靶向特异性蛋白酶(US2004146938，EP1608947);多聚物分子印迹产生的人造抗体(US2004157209，EP1292637)。例如，1995年由瑞典科学家Bj5rn Nilsson申请的专利US5831012和EP0739353，介绍并保护的是自然界细菌受体结构域的表面暴露氨基酸发生突变产生的新型蛋白；没有发生连续的基本结构和稳定性丢失获得的蛋白；从包含了一系列新型蛋白的蛋白文库中筛选获得的蛋白；以及人造细菌受体结构的制备方法。这项专利相关的产物是Affibody公司
的非抗体类革巴向结合分子蛋白-金黄色葡萄球菌A结构域蛋白(Affibodies),它们是一
种蛋白质结合配体，类似于抗体，却有着抗体所没有的优点分子较小-只有抗体的4%，但其结合位点与抗体的相似；非常稳定的，容易制造，储存而且耐高温；非特异性结合率非常低；与抗体相较，非常廉宜；能以几克/升的浓度批量生产。又例如，2004年由美国Dyax公司的科学家Ladner Robert C和Nixon Andrew申请的专利US2004209243和EP1587907，介绍并保护的是Kunitz结构域文库，载体，噬菌体，宿主细胞以及展示Kunitz结构域的方法。2009年10月，该公司的第一个非抗体类祀向结合分子药物ecallantide上市，用于治疗在遗传性血管水肿(HAE)患者中可能发生的突发性、致命性体液増加，这也是世界上的第一个非抗体类靶向结合分子药物。
发明内容
本发明的ー个目的是提供ー类新型的人工改造后可与靶抗原特异性结合的、基于人源蛋白的非抗体类靶向结合分子(下文中称人源蛋白基结合分子)。本发明的另ー个目的是提供了将该类结合分子与一个或多个功能分子(如化学小分子药物、多肽药物、蛋白药物、显影标记)连接的方法。根据该类结合分子的靶抗原的不同，所得融合蛋白或蛋白偶联物可以用于延长功能分子在体内的半衰期或提高功能分子的靶向性，其效果受到结合分子与靶抗原的结合强度影响。本发明还提供了针对靶抗原筛选人源蛋白基结合分子的方法，以及制备人源蛋白基结合分子的方法。此外，本发明还提供了包含人源蛋白基结合分子的组合物，以及此类组合物在多种治疗和诊断应用中的用途。从而一方面，本发明提供了一类人源蛋白基结合分子，相比于野生型序列(SEQ IDNO: I)的特定区域，有至少ー个氨基酸被改变以产生与特定靶标结合的外源序列。该外源 序列可以来自例如抗体CDR区、T细胞受体的全部或部分、具有特定空间构象的非线性多肽(例如能够形成双硫键的多肽)序列，也可以来自随机突变。相应地，本发明还提供了从文库中筛选具有外源序列的结合分子的方法。另ー方面，本发明还提供了ー种包含上述人源蛋白基结合分子的融合蛋白。所述融合蛋白有由以下通式I表示[(功能分子)-(连接肽)]n -(人源蛋白基结合分子)_[(连接肽)_ (功能分子)]m。其中，m和n为正整数且不同时等于O。相应地，本发明还提供了编码上述融合蛋白的核酸序列，包含该核酸序列的重组载体，以及包含该重组载体的宿主细胞。本发明提供了上述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤(1)构建所述融合蛋白的核酸序列；(2)构建包括(I)的核酸序列的表达载体；(3)将步骤(2)的表达载体用于转染或转化宿主细胞，并使所述核酸序列在宿主细胞中表达。(4)纯化步骤(3)所表达的蛋白，并去除多余序列。另ー方面，本发明还提供了ー种包含上述人源蛋白基结合分子的蛋白偶联物。其中的人源蛋白基结合分子与野生型人源蛋白结构域(例如SEQ ID N0:1)相比还包含至少ー个修饰的氨基酸残基用于共价偶联特定功能分子。本发明提供了上述蛋白偶联物的制备方法，包括以下步骤(1)构建所述人源蛋白基结合分子的核酸序列；(2)构建包括(I)的核酸序列的表达载体；(3)将步骤(2)的表达载体用于转染或转化宿主细胞，并使所述核酸序列在宿主细胞中表达。(4)纯化步骤(3)所表达的蛋白，并去除多余序列。(5)通过化学方法共价偶联步骤(4)所得蛋白与相应的功能分子。另ー方面，本发明提供了上述融合蛋白或蛋白偶联物、核酸序列、重组载体或宿主细胞在制备治疗慢性病、自身免疫性疾病、癌症、感染性疾病等相关疾病的药物中的应用。再一方面，本发明提供了ー种药物组合物。该药物组合物包含上述融合蛋白或蛋白偶联物，以及ー种或多种药学上可接受的辅料。优选地，所述药物组合物为液体注射剂或冻干注射剂。
「00111适宜革巴标人源蛋白基结合分子的适宜靶标包括但不限于具有长半衰期的蛋白(例如血清白蛋白，转铁蛋白)，抗体Fe受体,细胞受体,细胞受体配体等。革巴标可參与人类疾病，如自身免疫病、癌症、感染性疾病等。适宜的靶标还包括赋予附加功能特性的分子，如细胞毒性、成像、诱导多聚化、内吞效应等。人源蛋白基结合分子的产生人源蛋白基结合分子的序列，相比于野生型序列(SEQ ID NO: I)的12-38区间位点，有至少ー个氨基酸被改变，可由例如随机诱变、模糊突变或精确突变ー个或多个野生型序列中的残基而生成单个分子或多样性的分子文库。后者的核酸序列可由本领域公认的方法构建，包括但不限于基于PCR或酶介导的基因工程法，从头开始的DNA合成法，盒式诱变。任何抗体或T细胞受体可变区的CDR或抗原结合片断、非线性多肽均适合作为外源序列，直接插入或取代野生型序列(SEQ ID NO: I)的12-38区间位点间的全部或部分残基， 以生成新的人源蛋白基结合分子。鉴定生成分子的筛选方法对于上述方法生成的大容量、多祥性分子文库，可采用多种筛选測定法来鉴定人源蛋白基分子对于期望靶标的结合能力。例如，在细胞、病毒或噬菌体表面展示人源蛋白基结合分子，并利用固定化的靶标对其进行选择。适宜的筛选方法描述在美国专利No. 7063943, 6699658，7063943和5866344中。此类表面展示可能要求创建本发明人源蛋白基结合分子和正常存在于细胞、病毒或噬菌体外表面上的适宜蛋白质之间的融合蛋白。适宜制备此类融合物的蛋白质在本领域公知。筛选方法可以包括ー个或多个体外或体内亲和カ成熟步骤。可采用任何亲和カ成熟方法，引起本发明人源蛋白基结合分子中的氨基酸变化，提高其与期望靶标的结合能力。这些方法在美国专利No. 7195880; 6951725;7078197; 7022479; 5922545; 5830721; 5605793; 5830650; 6194550; 6699658;7063943; 5866344和专利写作条约公开W006023144中有所描述。融合蛋白中的连接肽及蛋白功能分子的选择本发明的人源蛋白基结合分子可与蛋白功能分子通过基因工程方法形成融合蛋白。连接肽的序列包括但不限于GGGGS，GS, PSTSTST，EIDKPSQ及其多聚体。蛋白功能分子、连接肽与人源蛋白基结合分子可以在同一载体上编码并作为单个蛋白质在宿主细胞中表达。蛋白功能分子可以是拥有期望生物学活性的蛋白质或多肽。例如，此类蛋白质可以包括酶活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒蛋白、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、白喉毒素等；蛋白质例如肿瘤坏死因子、胰高血糖样素I、干扰素等；或细胞因子，如白介素、粒细胞集落刺激因子等。人源蛋白基结合分子和融合蛋白的制备方法本发明人源蛋白基结合分子和融合蛋白一般通过重组表达产生。编码所述分子的核酸插入到表达载体中。编码所述分子的DNA区段在表达载体中有效连接以确保其表达的控制序列。表达控制序列包括但不限于启动子、信号序列、增强子元件和转录终止序列。一旦载体已经掺入到适当的宿主中，就将宿主維持在适合于高水平表达所述核酸序列、收集和纯化该人源蛋白蛋白基结合分子的条件下。这些表达载体通常作为游离体或宿主染色体DNA的一部分而在宿主中复制。通常表达载体含有选择标记(例如，氨苄青霉素抗性、四环素抗性等)，以便检测表达了含有期望DNA序列的那些宿主细胞。宿主包括但不限于大肠杆菌，酵母菌等。
本发明人源蛋白基结合分子和融合蛋白一经表达，则可按照本领域的标准方法纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、HPLC纯化、凝胶电泳等。对于制药用途，优选基本上纯的、至少约90-95%纯度的产物。蛋白偶联物的共价偶联方法、功能分子及连接子本发明的人源蛋白基结合分子可利用本领域已知的方法与功能分子进行共价偶联。偶联剂的实例包括蛋白质A、碳化ニ亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-こ酰基硫代こ酸酯(SATA)等等。优选的偶联剂是N-琥珀酰亚胺基-S-こ酰基硫代こ酸酯(SATA)和4_(N_马来酰亚胺基甲基)环己烷-I-羧酸磺基琥珀酰亚胺酷(sulfo-SMCC)。功能分子除前述蛋白类功能分子之外，还包括标签分子(例如生物素分子)或化学品(例如化疗药物)。后者包括但不限于细胞毒性剂，即，任何对细胞有害的物质。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、多柔比星、长春碱及他们的衍生物等。连接子的实例包括但不限于腙、硫醚、酷、ニ硫化物和含肽连接子。例如，连接子可以选择为易被溶酶体内的低PH断裂、或易被蛋白酶(例如优先地 在肿瘤组织中表达的蛋白酶)断裂的连接子。功能分子还可包括放射性同位素。制备放射性免疫缀合物的方法在本领域已经确立。本发明的组合物本发明的融合蛋白和蛋白偶联物具有体内治疗用途，可以与ー种或几种药学上可接受的辅料共同制成药物组合物。这些辅料包括水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水、渗透压调节剂等等。该药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下等注射途径给药，优选的剂型为冻干或溶液注射剂。所述的水溶性填充剂辅料包括但不限于甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚こニ醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等ー种或几种的组合。所述的pH调节剂包括但不限于枸櫞酸、磷酸、盐酸、氢氧化钾或钠或铵、碳酸钠或钾或铵盐、碳酸氢钠或钾或铵盐等生理可接受的有机或无机酸和碱及盐等ー种或几种的组合。所述的稳定剂包括但不限于EDTA_2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢ニ钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚こニ醇、十二烷基硫酸钠、三羟甲基胺基甲烷等一种或几种的组合。所述的渗透压调节剂包括但不限于氯化钠、氯化钾等ー种或多种的组合。本发明的药物组合物还可以在组合治疗中给药，即与其它药剂组合。例如，组合治疗可包括本发明的组合物连同至少ー种或多种其它治疗剂，例如抗炎药、抗癌药和化疗药物。与现有技术相比，本发明至少具有以下优点(I)本发明的融合蛋白或蛋白偶联物能够按照所述方法进行卓有成效的、有目的性的人工改造，不会对自身结构稳定性带来不良影响，。(2)本发明的融合蛋白或蛋白偶联物能够避免活性降低乃至丧失等不良影响。(3)本发明的融合蛋白或蛋白偶联物优选来源于人的天然序列，減少了融合蛋白在人体内潜在的免疫原性。
图I显示了本发明的用于噬菌体文库筛选人源蛋白基结合分子的克隆载体。图2显示了一个人源蛋白基结合分子的纯化结果。泳道1，经过固定金属离子亲和色谱(IMAC)纯化后的蛋白；泳道2，上清蛋白结合Ni-NTA后的流出液；泳道3，诱导表达，破菌后的上清蛋白；泳道4，诱导表达，破菌后的总蛋白。图3显示了一个人源蛋白基结合分子的ELISA亲和力检测结果。图4显示了一个人源蛋白基结合分子与Exendin-4的融合蛋白的经过酶切以及两步固定金属离子亲和色谱(IMAC)后的纯化效果。左图显示了融合蛋白的表达情况以及第一步IMAC纯化后的结果。泳道1，破菌后总蛋白，泳道2，破菌离心后上清中的蛋白，泳道3，第一步IMAC纯化后的Trx-融合蛋白。中图显示了肠激酶的酶切效果。泳道4，肠激酶浓度I下的酶切效率，泳道5，肠激酶浓度2下的酶切效率。右图显示了经过第二步IMAC后的纯化效果。泳道6，酶切纯化后的目标融合蛋白。 图5显示了一个人源蛋白基结合分子与Exendin-4的融合蛋白的活性检测结果。图6显示了一个人源蛋白基结合分子与裂解肽的融合蛋白的靶向肿瘤杀伤效果。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述，给出的实例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。实施例I:获得针对人血■清白蛋白的人源蛋白基结合分子将SEQ ID NO: I序列与含有噬菌体衣壳蛋白P3 C末端的核酸序列的质粒相融合(图 I ;参考文献Koide A, Bailey Cff, Huang X, Koide S. The fibronectin type IIIdomain as a scaffold for novel binding proteins. J Mol Biol. 1998;284:1141 -1151；Koide A, Gilbreth RN, Esaki K, Tereshko V, Koide S. High-affinitysingle-domain binding proteins with a binary-code interface. Proc Natl Acad SciUSA. 2007; 104:6632 - 6637.)，采用Kunkel突变方法进行区域随机化。Kunkel突变的具体步骤可参考Krojer, T., Garrido-Franco, M., Huber, R. , Ehrmann, M., & Clausen,T. (2002) Nature 416, 455-459 ；Ferrer, M. , Maiolo, J. , Kratz, P. , Jackowski,J. , Murphy, D. , Delagrave, S. , & Inglese, J. (2005) Protein Eng Des Sel 18,165-173 ；Garcia, K. C. , Degano, M. , Stanfield, R. L., Brunmark, A. , Jackson, M.R. , Peterson, P. A. , Teyton, L. , & Wilson, I. A. (1996) Science 274, 209-219。随机突变区域可选择野生型人源蛋白序列的12-38区域(SEQ ID NO: I黑色粗体下划线)。随机突变方案可以选择突变全部残基(如石；j=6-30 ；SEQ ID N0:2)或具备两个半胱氨酸键的突变(如；j=4-10, i+j+k <30 ；SEQ ID NO:3)或者具备一定选择性(如XiCX2GPX4CXk ；SEQ ID NO:4)等。其中X是任一天然氨基酸残基类型。YDAFLGTffKLYDSKNFDDYMKSLGYGFATRQVASMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKWDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO:I)VDAFLGTffKLV J TTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKffDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 2)VDAFLGTffKLV X1CXjCXk TTIIEKNGDI LTLKTHSTFKNTE I SFKLGVEFDETTADDRKVKS IVTLDGGKLVHLQKffDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 3)VDAFLGTffKLV A,(X (,!'X4CXk TTIIEKNGDI LTLKTHSTFKNTE I SFKLGVEFDETTADDRKVKS IVTLDGGKLVHLQKffDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 4)将该文库通过电转化方法转化至大肠杆菌细胞ss320中进行表达。以人血清白蛋白为靶点，从以上所建文库进行筛选。人血清白蛋白通过化学修饰的方法加上BI0TIN，以带有 Streptavidin 修饰的磁珠(Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles,Promega)来进行筛选。四轮筛选分别使用的人血清白蛋白的浓度为100，20, 4 and I nM.每轮筛选由kingfisher磁珠仪自动化进行。每轮筛选，将靶蛋白与文库孵育15分钟，然后经过三轮TBS洗漆。富集的卩遼菌体经过4轮panning,挑选单菌落进行phage ELISA.阳性克隆送测序，以得到基因序列，并转化至适合蛋白表达的质粒中。另一方面，亦可用已知与多种属血清白蛋白有一定结合能力的非线性多肽(SEQID NO: 5; Dennis et al. J. Biol. Chem.)直接替换野生型人源蛋白序列(SEQ ID NO: I)的12-38区域(下划线)，生成新序列(SEQ ID NO: 6)EVRSFCTDWPAEKSCKPLRG (SEQ ID NO:5) VDAFLGTWKLVEVRSFCTDWPAEKSCKPLRGTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKWDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 6)实施例2:人源蛋白基结合分子的表达、纯化将含有便于纯化的聚组氨酸标签、便于后续ELISA检验的FLAG标签、Tev蛋白酶酶切位点的序列以及SEQ ID NO: 6序列，克隆入表达质粒。待表达的融合蛋白序列为(SEQID NO: 7)MGHHHHHHHHHHSSDYKDDDDKGENLYFQGSVDAFLGTWKLVDSKNFDDYMKSLGVGFATRQVASMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKffDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 7)将冻存菌株置于冰上冰浴融化,使用接种环,划板活化菌株于含30 iig/ml卡那霉素的LB琼脂培养基上，37 ° C孵育过夜。挑选活化的单克隆细菌于30 ml含30 U g/ml卡那霉素的LB培养基中，置于37 ° C摇床中200 rpm振摇培养过夜。按照2%的接种量，将隔夜培养的细菌培养物接种到I升的含有30 u g/ml卡那霉素的LB培养基中，37 ° C200 rpm振摇，直到600 nm光密度(0D600)达到0. 5。将培养物置于冰上降温至28 ° C，加入诱导剂异丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度I mM。将加入IPTG后的细菌培养物置于28 ° C的摇床中，200 rpm振摇培养细菌6小时，以诱导人源蛋白基结合分子在大肠杆菌中的胞内表达。以6000xg转速离心10分钟收获大肠杆菌细胞，加入20 ml裂解缓冲液(50 mM磷酸钠，0.5 M氯化钠，20 mM咪唑，pH7. 4)，随后加入溶菌酶和蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)分别至终浓度0.2 mg/ml和I禮。冰上孵育一小时，悬液间歇超声破碎2分钟。15000xg离心蛋白悬液I小时，收集上清，并以0. 45 um微孔滤膜过滤。以10倍柱体积的上样缓冲液(50 mM磷酸钠，0. 5 M氯化钠，20 mM咪唑，pH7. 4)预平衡预装在一次性柱中的3 ml的Ni-NTA树脂，将经过过滤的蛋白溶液缓慢上柱结合，收集流出液重新上柱于Ni-NTA树脂。上样结束后，使用上样缓冲液缓慢洗涤Ni-NTA柱直至无蛋白脱出。使用洗脱缓冲液(50 mM磷酸钠，0.5 M氯化钠，0.5 M咪唑，pH7. 4)洗脱结合蛋白，每2 ml收集I管洗脱液。测定各管280 nm光密度(0D280)，汇集高分光度的各管蛋白溶液，4 ° C透析脱盐置换于PBS缓冲液中。结果如图2所示，显示纯化样品的分子量与蛋白的预期质量一致，纯度在90%以上。实施例3:人源蛋白基结合分子的结合力测试在本实施例中，人源蛋白基结合分子(SEQ ID NO: 6)针对其目标靶点(血清白蛋白)的结合能力，经由一种间接酶联免疫吸附试验方法进行结合力测试。实验方案简述如下96孔ELISA板(Nunc Maxisorb)的每孔用100 u I 5 u g/ml血清白蛋白的碳酸氢钠缓冲液(40 mM NaHC03，pH 9.5)包被，附上封口膜，于4 ° C孵育过夜。同时每孔配以纯碳酸氢钠缓冲液(40 mM NaHC03, pH 9.5)包被ELISA孔作为空白对照。第二天，倒去包被缓冲液，分别使用纯水和PBS洗涤一次。每孔加入300 u I的1% Ficoll 400(溶于PBS中)，置于潮湿密闭容器中室温封闭2小时。倒去封闭液，PBS洗涤I次后，加入100 u I预先用PBST (PBS+0. 1%吐温20)稀释的具有血清白蛋白结合功能的人源蛋白基结合分子，震动室温孵育I小时。随后除去蛋白溶液，用PBST缓冲液洗涤3次，加入1000倍稀释于PBST的 FLAG M2 monoclonal antibody (SigmaAldrich),室温振摇 I 小时。除去抗体，用 PBST 洗涤3次，加入1000倍稀释于PBST的用以显色的Rabbit Anti-mouse IgG/HRP缀合物(生研(上海)生物科技有限公司)，室温振摇I小时。除去抗体缀合物，PBST洗涤5次后，PBS洗漆 2 次。加入 100 U I 的底物溶液(I-Step Turbo TMB-ELISA, Pierce Biotechnology),反应显色5分钟，加入100 u I 2M硫酸终止反应。使用ELISA读数器测量450nm的OD值。如图3所示，所得结合分子对于多种属的血清白蛋白均具有显著的靶向结合能力。实施例4 :功能分子为Exendin-4的融合蛋白的设计、制备和活性本实例描述了人源蛋白基结合分子的野生型模板(SEQ ID NO: I)与蛋白功能分子Exendin-4 (SEQ ID NO: 8)所生成的融合蛋白(SEQ ID NO: 9)。将融合蛋白(SEQ IDNO: 9)的核酸序列亚克隆到pET-32a(+)多克隆位点中，与Thioredoxin (Trx)共表达生成Trx-融合蛋白(SEQ ID NO: 10),以增加Exendin-4-野生型人源蛋白基结合分子的可溶表达。HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSG (SEQ ID NO: 8)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGTGGSGGGSVDAFLGTWKLVDSKNFDDYMKSLGVGFATRQVASMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKffDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 9)MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFffAEffCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKHGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSGTGGSGGGSVDAFLGTWKLVDSKNFDDYMKSLGVGFATRQVASMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKffDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 10)除了在细菌培养过程中使用氨苄西林替换实施例2中使用的卡那霉素外，Trx-Exendin-4-野生型人源蛋白基结合分子的表达和固定金属离子亲和色谱纯化与实施例2相同。固定金属离子亲和色谱纯化后的Trx-Exendin-4-野生型人源蛋白基结合分子，透析于透析缓冲液(20 mM Tris, 50 mM氯化钠，pH8. 0)中。4 ° C透析过夜后，向Trx-Exendin-4-野生型人源蛋白基结合分子的透析缓冲液中添加入氯化I丐至终浓度2 mM。加入合适比例的重组肠激酶(Enterokinase, GenScript),室温反应8小时，融合蛋白被切割成Trx以及带有纯化标签的Exendin-4-野生型人源蛋白基结合分子(SEQ ID NO: 9)两部分。以10倍柱体积的透析缓冲液(20 mM Tris，50 mM氯化钠，pH8. 0)预平衡预装在一次性柱中的3 ml的Ni-NTA树脂，将酶切后的蛋白溶液缓慢上柱结合，收集的流出液即所需的N端暴露的Exendin-4-野生型人源蛋白基结合分子融合蛋白(SEQ ID NO: 10)。图4显示了融合蛋白(SEQ ID NO: 10)经过酶切以及两步固定金属离子亲和色谱(IMAC)后的纯化效果。通过如下实验判断融合蛋白所保留的功能分子活性(详见以GLP-I受体为靶点的药物筛选细胞模型的建立和应用。环奕、申竹芳《药学学报》2009，44(3):309-313)。实验步骤简述如下^fNIT-I细胞瞬时转染报告基因质粒Peakl2RIP-CRE6X GFP后，使用不同浓度(lXlO-'lXKT1。、1X10'1X10'I X10_7、1X10_6 M)的融合蛋白刺激。为避免由于细胞状态、检测加样及读数时间延误造成的不同实验批次造成的实验误差，引入内参基因合并靶基因的双报告基因检测方法，荧光检测结果为靶基因荧光读数值/内参基因荧光读数值。阳性药对照为艾赛纳肽注射液(礼来公司)。活性检测结果如图5所示 结果显示，融合蛋白样品活性随浓度增加而增强，具有显著的量效关系。其中一个指标为半数有效浓度(EC50)，另一个指标为在激动剂达到I. 5倍激活效能时对应的浓度(EC1.5)。以上结果显示，融合蛋白样品与阳性药的量效曲线接近平行，活性相仿，证明人源蛋白基结合分子模板与功能分子(Exendin-4)融合后，没有对功能分子的原有活性造成显著降低。该实施例的结果揭示了两条具有可操作性的工艺路线，用以得到具有理想靶向性或半衰期的、具备足够生物学活性的融合蛋白药物前体(1)将该人源蛋白基结合分子模板单独设计和筛选后，再与Exendin-4形成融合蛋白，或者(2 )将人源蛋白基结合分子模板与Exendin-4首先融合，再对融合蛋白整个进行重新设计和筛选。实施例5 :具有靶向PSMA抗肿瘤活性的融合蛋白PSMA (前列腺特异性膜抗原)是近年得到广泛研究和临床验证的前列腺癌重要药物靶点之一。PSMA是一个跨膜蛋白，其氨基端位于细胞膜内，胞内段含有19个氨基酸，跨膜段含有24个氨基酸，胞外段含有707个氨基酸。PSMA特异性地表达于前列腺上皮细胞表面，而在大多数组织中不表达。PSMA在前列腺癌组织中的表达量大约为正常前列腺组织中的10倍以上，大脑组织中的100倍，肝和肾组织中的500-1000倍。其表达强度在前列腺癌细胞、特别是晚期及转移性前列腺癌中明显升高。结合PSMA靶点本身不会引起癌症细胞死亡。当前一般采用抗体药物偶联技术，将强毒素与靶向结合PSMA的单抗偶联，借助PSMA的内化将所携带的强毒素进一步聚集到细胞核周围，实现靶向杀伤。抗体偶联物的生产工艺是世界性难题。在本实施例中，我们提供了两个具有PSMA靶向结合能力的两个人源蛋白基结合分子，替代单克隆抗体的靶向作用VDAFLGTWKLVDSKNSTLVPHTRSMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKWDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 11)VDAFLGTffKLVDSKNSQKHHNYLSMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKWDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKE (SEQ ID NO: 12)将以上蛋白序列与蛋白标签(第一划线处)、连接肽和裂解肽(第二划线处)融合，得到如下两个融合蛋白
MGHHHHHHHHHHSSDYKDDDDKGENLYFQGSVDAFLGTffKLVDSKNSTLVPHTRSMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKWDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKEKPISLTASGGKLAKLAKKLAKLAKHHHHH (SEQ ID NO: 13)MGHHHHHHHHHHSSDYKDDDDKGENLYFQGSVDAFLGTffKLVDSKNSQKHHNYLSMTKPTTIIEKNGDILTLKTHSTFKNTEISFKLGVEFDETTADDRKVKSIVTLDGGKLVHLQKWDGQETTLVRELIDGKLILTLTHGTAVCTRTYEKEKPLSLISSGGKLAKLAKKLAKLAKHHHHH (SEQ ID NO: 14)将上述两个蛋白序列在大肠杆菌中表达、纯化，在高表达PSMA的LNCaP细胞株和低表达PSMA的PC3细胞株中进行细胞毒性试验，以验证其PSMA靶向性。方法简述如下收集对数期的LNCaP (高表达PSMA蛋白)、PC3细胞(低表达PSMA蛋白)，调整细胞悬液浓度， 每孔加入lOOul，铺板使待测细胞调密度1000- 10000 /孔。在5%C02，37°C条件下孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)。分别加入5微摩、15微摩的待测药物Hl (SEQ ID NO:
13)、H2 (SEQ ID NO 14)，以及阳性对照(10mg/ml、15mg/ml 的顺钼)，每孔 lOOul，设 3-5个复孔。5%C02，37°C孵育24或72小时。每孔加入IOul MTT溶液(5mg/ml，即0. 5%MTT),继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入IOOul 二甲基亚砜，置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD 490nm处测量各孔的吸光值，并得到与对照孔(细胞、PBS、培养液、MTT、二甲基亚砜)的吸光值相比的比值。由图6可见，在24小时后，两个药物对于两种细胞株的杀伤效率(5微摩、15微摩)类似顺钼，其PSMA靶向值(0. 29-0. 58)也与顺钼(0. 39-0. 44)类似，未体现出PSMA靶向性杀伤效果。在72小时后，两个药物对于两种细胞株的杀伤效率体现出明显区别在5微摩的浓度下，其PSMA靶向性为I. 61-1. 73，在15微摩的浓度下，其PSMA靶向值为3. 51-8. 08，均显著高于顺钼(I. 05-1. 13)。特别地，在15微摩的浓度下，两个药物对于LNCaP的杀伤率为64%-68%，接近顺钼杀伤率(76-83%)，而对于PC3的杀伤率仅为8_20%，远低于顺钼杀伤率(67%-79%)，体现出远优于化疗药物的安全性。
权利要求
1.包含野生型序列SEQID NO: I的至少70%序列的蛋白，其对应于SEQ ID NO: I的12-38区域的部分，有至少ー个氨基酸与SEQ ID NO: I不同，以产生与特定靶标相结合的结合分子。
2.权利要求I的结合分子，其中非来源于SEQID NO: I序列的部分包含抗体或T细胞受体的互补决定区(CDR)或非线性多肽的全部或部分。
3.权利要求I的结合分子，其中特定靶标是血清白蛋白。
4.权利要求I的结合分子，其中特定靶标是前列腺特异性膜受体(PSMA)。
5.前述权利要求中任一项的结合分子，包含与SEQID NO: I相比至少ー个修饰的氨基酸残基，用来连接功能分子。
6.权利要求5中的结合分子，其中修饰的氨基酸残基包括半胱氨酸或非天然氨基酸残 基的添加或取代。
7.前述权利要求中任一项的结合分子与另一分子的融合蛋白或蛋白偶联物。
8.组合物，包含前述权利要求中任一项的结合分子、融合蛋白、蛋白偶联物及载体。
9.多祥化核酸文库，其编码要求前述任一项的结合分子、融合蛋白、蛋白偶联物及载体。
全文摘要
本发明公开了一种新型的蛋白模板用于生成非抗体类靶向结合分子。所述蛋白模板及其衍生的靶向结合分子可与多肽、蛋白或化学功能分子形成融合蛋白或蛋白偶联物。由此，后者可具备可调节的靶向性或半衰期性质，同时保留结构稳定性和功能分子原有的活性，在制药及分子诊断领域有广泛应用前景。
文档编号C07K14/47GK102775487SQ20121018648
公开日2012年11月14日 申请日期2012年6月7日 优先权日2012年6月7日
发明者卢水秀, 史孟君, 吴昕, 张伟, 王瑞, 黄金 申请人:北京华金瑞清生物医药技术有限公司