专利名称：用于细胞内靶向增殖和蛋白质合成的聚阴离子多价大分子的制作方法
技术领域：
总的来说，本发明涉及使用聚阴离子多价大分子对参与活化细胞的增殖和蛋白质合成的细胞内分子进行靶向的方法和组合物。具体来说，将与多元醇相连的多个硫酸盐基团特异性靶向增殖和活化细胞的细胞质和细胞核。本发明还包含新的聚阴离子大分子化合物和制剂。发明背景和相关技术描述在最近几十年间，在提高诊断和治疗药物的效能方面已经取得了许多进步。主要的成就是在急性病中做出的。目前，可以高效地治疗急性病例如感染性疾病、急性血栓形成或急性血压调节异常。大多数用于急性病的药物治疗对健康组织和器官没有严重影响。由于药物治疗的时间短，因此健康组织和器官能够从不想要的药物效应中充分恢复。与持续时间短的急性病药物治疗通常伴随着短时间药物暴露，与此相反，慢性病的治疗必然伴有人体长期持续地暴露于所应用的药物。然而，长期持续暴露于药物，往往对健康组织和器官有害。 在最近几十年间，为了避免对健康组织和器官的不想要的严重药物效应，采取了两种不同策略。一方面，药物研究集中在有希望进行疾病特异性的靶向机制表达的新的药物靶点。就增殖和活化细胞中信号传导机制的发现而言，已鉴定到大量新的靶点。然而，除了少数例外情况之外，对大多数新发现的药物靶点的治疗性攻击没有改进治疗结果。另一方面，已投入大量努力来提高临床确立的治疗药物的生物可利用度。为了提高生物可利用度，药物研究集中于治疗性或诊断性效应分子的化学修饰或药物制剂。过去三十年来，靶向效应子结合物的用途已被确立。具体来说，将能够诱导诊断或治疗效应的分子与具有靶向性质的载体分子相连。由于免疫球蛋白的高结合亲和性，蛋白质抗体或抗体片段常常被用作靶向递送的载体分子。对于肿瘤疾病的治疗来说，抗体可以将毒素或化疗剂携带到肿瘤。由于抗体-效应子结合物与肿瘤的某些靶分子的强烈结合，在肿瘤环境中获得了效应子的明显更高的浓度。同时，在一系列实验和临床肿瘤中，已证明抗体-效应子结合物是有效的。靶向递送效应分子的另一个优点是降低了不想要的效应分子效应。详细来说，没有与具有靶向性质的载体相连的药物分子中的大部分没有到达疾病位点，而是仅仅被施加到人体中以便在血液中获得所需的药物浓度。因此，最大部分所施加的药物从血液循环中消除，而没有到达疾病位点。例如，可以被认作慢性病的恶性实体肿瘤在诊断和治疗时具有I至10克的大小，因此占人体的O. 01至O. 001%。该比率说明了通过将应用的药物导向所述疾病，可以显著优化药物治疗，因此能够减少所用的剂量。然而，尽管在急性病治疗中取得了显著进展，但大多数治疗不能实现慢性病的治愈。与急性病相反，大多数慢性病只有在与疾病相关的信号传导和基因转录能够被选择性靶向时才可以被治疗。为了实现这个目标，治疗药物必须充分透过细胞膜并在疾病的靶细胞内积累。由于基因转录和蛋白质合成的关键靶分子的遍在性表达，未来的治疗药物必须表现出在疾病位点处的选择性摄入。未来的治疗药物的后一种特征是极为重要的，因为结合并抑制疾病过程之外的基因转录和蛋白质合成的关键调控子可能对人体有害。来自于科学研究的结果为超过500种因子在基因转录和蛋白质合成中的作用提供了证据。然而，在不同因子中，NF-K B和AP-I是关键的，并且已被确立为治疗祀点(Letoha等，Mol. Pharmacol. 69:2027，2006 ;Sliva 等，Curr Cancer Drug Targets. 4:327，2004)。这两种基因转录的调控子在细胞的活化和增殖中发挥核心作用，并且是不同的信号传导级联的下游信号。NF- κ B和AP-I两者都位于细胞的细胞质和核中。对于NF- κ B和AP-I的治疗性靶向来说，药物必须满足两个重要的先决条件。首先，治疗药物必须以足够的量透过细胞膜并在细胞质内积累。其次，治疗药物必须能够辨别健康器官或组织中的细胞与疾病过程中的细胞。后一方面是极为重要的，因为NF- κ B和AP-I在人体的每个细胞中表达，这两种疾病靶点的抑制可能明显对敏感的人体功能有害。NF-κΒ (核因子-活化B细胞的κ轻链增强子)是一种控制DNA转录的蛋白质复合物。NF-κ B存在于几乎所有动物细胞类型中，并参与对刺激因素例如应激、细胞因子、自由基、紫外辐射、氧化型LDL、和细菌或病毒抗原的细胞应答。NF-κ B在调控对感染的免疫应答中发挥关键作用。相反，已将NF-κ B的不正确调控与癌症、炎性和自体免疫疾病、脓毒性休克、病毒感染和非正常免疫发育相关联。NF- κ B还牵涉突触可塑性和记忆的过程(Baud 等，Nat Drug Discov. 8:33，2009)。
NF-κ B被真核细胞广泛用作控制细胞增殖和细胞存活的基因的调控子。因此，许多不同类型的人类肿瘤具有错误调控的NF- κ B :也就是说，NF- κ B具有组成型活性。活性NF-kB启动保持细胞增殖并使细胞免于原本将通过凋亡导致其死亡的状态的基因进行表达。NF-κ B的缺陷引起对凋亡的易感性增加，导致细胞死亡增加。因为NF-κ B控制参与炎症的许多基因，因此在许多炎性疾病例如炎症性肠病、关节炎、败血症、胃炎、哮喘等中发现NF- κ B具有长期活性，并不令人吃惊。许多被宣传具有抗癌和抗炎活性的天然产物(包括抗氧化剂)，也已被显不抑制 NF-κ B (Kaur 等，Curr Cancer Drug Targets 7:355,2007)。活化蛋白I (AP-I)是一种转录因子，其是异源二聚体蛋白，由属于c-Fos、c_Jun、ATF和JDP家族的蛋白质构成。它对各种刺激因素包括细胞因子、生长因子、应激以及细菌和病毒感染作出响应而调控基因表达。AP-I进而控制许多细胞过程，包括分化、增殖和凋亡(Vesely 等，Mutat Res. 682:7，2009)。NF-K B和AP-I的活化引起参与肿瘤生长、凋亡、炎症、自体免疫疾病和纤维化的大量信号传导分子的编码基因的转录。细胞因子例如白介素-I、白介素-6、TNF_a或生长因子如TGF-β，代表了 NF-κ B和AP-I活化的最重要的下游信号。具体来说，转化生长因子β (TGF-β )是高度多效性的细胞因子，其控制细胞功能的许多方面，包括细胞增殖、分化、迁移、凋亡、粘附、血管发生、免疫监视、和存活，因此代表了治疗药物的重要靶点(Jakowlew, Cancer Metastasis Rev 2006;25:435-57)。TGF-β 由许多细胞类型产生，总是存在于血浆中(以其潜伏形式)并渗透所有器官，与基质组分结合并产生这种免疫抑制分子的储库。无论如何，它在许多病理条件下过量产生。这包括肺纤维化、肾小球硬化症、肾间质纤维化、肝硬化、克罗恩病、心肌症、硬皮病和慢性移植物抗宿主疾病(Prud’ homme等，Lab Invest 2007;87:1077-91)。在肿瘤疾病中，TGF-β抑制早期病变的发展，但是这种效应后来丧失并且癌细胞产生TGF-β，这种TGF-β然后促进肿瘤转移。该细胞因子也有助于肿瘤基质的形成、血管发生和免疫抑制(Jakowlew, Cancer Metastasis Rev2006;25:435-57)。有鉴于此，正在对抑制TGF-β活性的几种方法进行研究，包括中和抗体、可溶性受体、受体激酶拮抗剂药物和反义试剂。靶向TGF-β的新疗法的益处正在热切研究中(Prud，homme, Lab Invest 2007; 87:1077-91 ) 对于治疗性干预来说，考虑到了其中病理过程以免疫系统的细胞与非细胞组分的缺陷和不受调控的相互作用为特征的所有自体免疫疾病，例如乳糜泻、I型糖尿病(IDDM)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(Sjogren's syndrome)> Churg-Strauss综合征、多发性硬化症(MS)、桥本氏(hashimoto’ s)甲状腺炎、格雷夫氏(Graves’ )病、特发性血小板减少性紫癜、阿狄森氏(Addisons)病、贫血症、关节强直性脊椎炎、骨关节炎、白塞氏(Behcets)综合征、口腔溃疡、慢性疲劳、慢性阻塞性肺病(C0PD)、克罗恩(Crohns)病、库兴氏(Cushins)病、疱疹样皮炎、皮肌炎、湿疹、纤维肌痛、脱发、肝炎、甲状腺机能减退、扁平苔癣、美尼尔氏(Meniere’s)病、肌无力、莱特尔氏(Reiters)综合征、肉样瘤病、硬皮病、败血症、干燥综合征、太阳中毒、SIRS (系统性炎性反应综合征)和眼色素层炎(Masters等， Annu Rev Immunol2009;27:621-68)。在人类癌症中，TGF-β通过NF-κ B或API的活化而产生，并通过在早期肿瘤发生期间降低TGF-β信号传导和在晚期进展性疾病中增加TGF-β信号传导两方面来促进肿瘤发生。有证据表明，TGF-β调控肿瘤细胞的细胞周期活性，引起对肿瘤细胞增殖的控制。尽管正常细胞和已分化肿瘤细胞的生长被TGF-β阻断，但未分化肿瘤细胞的生长受到刺激。TGF-β在未分化肿瘤细胞中的刺激作用是由突变的信号传导途径造成的。尽管TGF-β对原发肿瘤细胞的生长有影响，但通过刺激肿瘤细胞外渗，TGF-β是肿瘤转移的最有力调控子之一。对肿瘤血管发生的影响是TGF-β刺激肿瘤生长和转移的另一种机制(Tian等Future Oncol 2009;5:259-71)。已发现在许多肿瘤中TGF-β的水平升高，例如急性成淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、星形细胞瘤、基底细胞癌、皮肤癌(非黑素瘤)、胆管癌、膀胱癌、骨癌、纤维组织细胞瘤、脑肿瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤、类癌瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增殖性障碍、结肠癌、皮肤T-细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿、胚胎性瘤、食管癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、生殖细胞瘤、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金氏(Hodgkin)淋巴瘤、胰岛细胞瘤、肾(肾细胞)癌、喉癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、骨髓增生异常综合征、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、前列腺癌、良性前列腺增生、直肠癌、肉瘤、胃癌、甲状腺癌、阴道癌(Jones等，Expert OpinTher Targets 2009;13:227-34)。TGF-β的关键性作用在心血管系统的疾病中也得到确证。与肿瘤中TGF-β诱导的机制非常类似，在心血管疾病中TGF-β合成的主要刺激因素也是NF-κ B的活化(Frangogiannis, Pharmacol Res 2008;58:88)。TGF- β 已牵涉许多心血管病，例如中风再灌注、局部缺血、心脏病发作、心肌炎、心内膜炎、心肌机能不全(Goumans等，TrendsCardiovasc2008; 18:293-8)0 TGF-β在新生内膜的发生和与血管成形术相关的收缩性重塑中具有重要作用。在动脉粥样硬化中，它的作用尚未完全阐明，但是它控制免疫系统的能力对病变发生具有深远影响，特别是通过影响所产生的病变的类型。TGF-β也能诱导动脉发生并显著影响血管发生过程，具有促血管发生和抗血管发生两种效应(Galinka等，AnnuRev Immunol 2009;27:165-97)。它也是各种心血管纤维化病、包括脉管系统、心脏和肾脏中的心血管纤维化病的发生的主要贡献者。也已显示，TGF-β在纤维化的发生和发展中发挥重要作用。纤维化是在器官或组织中作为补救性或反应性过程而形成或发生过量的纤维状结缔组织，与作为器官或组织正常组分的纤维组织的形成相反。其实例是胰脏和肺脏的囊性纤维化、可作为肌肉注射的并发症出现的注射纤维化、心内膜心肌纤维化、肺脏的特发性肺纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、进行性大块纤维化、煤工尘肺的并发症、肾源性系统纤维化(Pohlers 等，Biochim Biophys Acta, 2009，1792，746-756)。目前可用的抗TGF-β治疗药物具有几种缺点。现有的用于治疗自体免疫疾病的药物的显著缺点是它们的治疗窗小。重复施用常常引起不良药物作用和严重器官损伤。心毒性、肾毒性和肝炎是用于治疗自体免疫疾病的临床可用药物的常见副作用(Cohen, International Journal of Clinical Practice 2007; 1922-1930)。在临床背景中，大多数现有药物被间断施用，以避免不可逆的毒性。然而，间断性治疗计划增加了疾病发展的风险。由于这些原因，对用于TGF-β相关疾病治疗的更有效和耐受良好的药物，存在着显著需求。已知可以通过几种引起受体信号传导抑制的方法来抑制TGF-β。然而，这些方法受到体内效能有限和缺少耐受性的限制。阻断TGF-β的反义寡核苷酸的合成已有描述(Flanders, Clinical Medicine &Research 2003，1，13-20)。反义寡核苷酸能够减少TGF-β蛋白的合成。然而，这种方法常常引起TGF-β合成的不完全抑制。反义寡核苷酸的另一个缺点是积累在疾病位点处的药物量少。TGF-β受体的小分子抑制剂(SMI)也是已知的(Hjelmeland 等，Mol Cancer Ther 2004;3:737-745)。这些分子经常可口服利用，但是缺少足够的耐受性和安全性。TGF-β受体的已知SMI的毒副作用是由于缺少特异性。已知的化合物不仅抑制TGF-β受体的信号传导，而且抑制具有结构相似性的许多其他受体。结合TGF-β或阻断TGF-β与其受体结合的抗体也是已知的。这些分子显示出在疾病位点处充分积累，并长时间阻断信号传导(Saunier等，Curr Cancer Drug Targets2006; 6:565-78 )。然而，抗体具有几个缺点，这限制了它们的治疗性应用。首先，干扰TGF- β的抗体，由于免疫系统被带有免疫系统组分结合位点的该抗体中的部分所激活，可能行使不想要的副作用。这种免疫系统的激活可能引起治疗的毒性。另一个缺点可能是中和抗体的产生。中和抗体的出现经常在多次施用后被观察到。在中和抗体的情况下，治疗的效能降低。由于已知疗法的局限，因此需要与活化的NF-K B和AP-I和TGF-β合成升高相关的疾病的新治疗方法。新治疗方法的终极目标是高效能和良好的耐受性。因此，本发明的目的是提供化合物和化合物类别，其易于合成并适用于治疗与活化的NF-κ B或AP-I和细胞因子例如TGF-β的合成升高相关的疾病。根据本发明，意外发现聚阴离子多价大分子代表一类新的治疗分子，其将效应分子选择性递送到增殖和活化细胞的细胞质和细胞核中。本发明提出了基于大量硫酸盐基团在树枝状支化大分子载体上的多价组装的聚阴离子大分子在诊断或治疗性效应分子的细胞内递送中的用途。更具体来说，本发明包含使用共价连接诊断或治疗性效应分子的具有超支化结构的硫酸化多元醇作为药物，来治疗与活化的NF- κ B或AP-I和TGF- β合成升高相关的疾病。发明概述本发明的主题是
一种药物组合物，其包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子。
在优选实施方案中，药物组合物具有式P (0S03_M+)n(L-G-E)m，其中P是多元醇大分子，所述多元醇大分子中数量为η的羟基被硫酸盐基团OSO3IT取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E是治疗性或诊断性效应分子，L是P与E之间的连接物或间隔基团，G是用于在L与E之间进行共价连接的反应性基团，m是1-100的数目。在更优选的实施方案中，药物组合物通过将所述硫酸化聚甘油和治疗性或诊断性效应分子细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF-κ B和/或AP-I和/或抑制TGF-β合成，来治疗疾病。一种结合物，其包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子。在优选实施方案中，结合物具有式P(0S03_M+)n(L-G-E)m，其中P是多元醇大分子，所述多元醇大分子中数量为η的羟基被硫酸盐基团OSO3-M+取代，M是阴离子性硫酸根基团 的阳离子性无机或有机反离子，E是治疗性或诊断性效应分子，L是P与E之间的连接物或间隔基团，G是用于在L与E之间进行共价连接的反应性基团，m是1-100的数目。在更优选实施方案中，结合物具有式P (0S03_M+)n(L-G-E)m，其中数量为η的羟基被硫酸盐基团OSO3IT取代，η是大于10的数目。在更加优选的实施方案中，其中效应分子占结合物的小于50重量％，并且结合物在水中的溶解度在100mg/mL以上。在更加优选的实施方案中，结合物包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF- κ B和/或AP-I和/或抑制TGF- β合成，来治疗疾病。在更加优选的实施方案中，结合物包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子，用于治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病。在更加优选的实施方案中，结合物包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子，其通过所述硫酸化聚甘油和治疗性或诊断性效应分子细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF-κ B和/或AP-I和/或抑制TGF- β合成，来治疗疾病，其中以每次给药lmg/kg至1000mg/kg的剂量执行多次治疗。在更加优选的实施方案中，结合物包含a)聚合的聚甘油P，其由多官能起始分子上具有式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元构成，所述多官能起始分子是具有I至1，000个OH基团的多羟基化合物，其中R是H或其他甘油单元，所述核心具有O至67%的支化度和500至1，000，000g/mol的平均分子量，b)所述甘油单元的多个OH基团被-OSO3H 或-OSCVM+取代，其中-OSO3H或_0S03_M+基团的优选数目大于10，并且获得30至100%的硫酸化度X，其中M+是阳离子性无机或有机反离子，c)所述硫酸化聚甘油由此产生的平均分子量为1，000至5，000, 000g/mol,d)带有官能团G的连接物单元L，其连接于至少一个OH基团直至最多100-X%的OH基团，其中所述官能团能够与其他治疗性或诊断性效应分子结合，其中X是硫酸化度，e)诊断性和/或治疗性效应分子，其共价连接于一个直至最大可能数量的所述官能团，所述诊断性效应分子选自荧光染料或用于放射活性或顺磁性金属的螯合剂，所述治疗性效应分子选自细胞抑制剂、抗血管生成药物、光敏化剂、siRNA。在更加优选的实施方案中，结合物具有式P (OSO3IT)n(L-G-E)m，其中L是支链或直链C1J-烷基，所述烷基中一个或多个不连续的亚甲基可以被选自O、S、NH、C(O)NH, C(O),so2、so、芳基、乙烯或乙炔的基团代替，并且其中G选自-oh、-oso3h、-oso3_、-nh2、-n3、-cooh、-sh、-so3'-c = Co一种具有通式P(OSCVlT)n(L-G)ni的硫酸化聚甘油，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中并通过在所述细胞中抑制NF-κ B和/或AP-I和/或抑制TGF-β合成来治疗疾病，其中P表示聚甘油，所述聚甘油中数量为η的羟基被硫酸盐基团OSO3-M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，m是1-100的数目，L是连接物，G是用于与效应分子共价连接的反应性基团，其中L是支链或直链C1,-烷基，所述烷基中一个或多个不连续的亚甲基可以被选自O、S、NH、C(O)NH, C(O)、SO2, S0、芳基、乙烯或乙炔的基团代替，并且其中 G 选自-OH、-OSO3H' -OSO3' -NH2、-N3> -C00H、_SH、-SO3' -C = C。 在更优选的实施方案中，硫酸化聚甘油通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF- κ B和/或AP-I和/或抑制TGF- β合成，来治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病。在更加优选的实施方案中，硫酸化聚甘油通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF- κ B和/或AP-I和/或抑制TGF- β合成，来治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病，其中以每次给药lmg/kg至1000mg/kg的剂量执行多次治疗。硫酸化聚甘油用于将治疗性或诊断性效应分子递送到对象的活化或增殖细胞内的用途，所述硫酸化聚甘油按照以下形式包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子的结合物和在优选实施方案中，式P(OSO3If)n(L-G-E)ni的结合物，其中P是多元醇大分子，所述多元醇大分子中数量为η的羟基被硫酸盐基团OSO3-M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E是治疗性或诊断性效应分子，L是P与E之间的连接物或间隔基团，G是用于在L与E之间进行共价连接的反应性基团，m是1-100的数目和在更优选的实施方案中，式P(0S03_M+)n(L-G-E)m的结合物，其中数量为η的羟基被硫酸盐基团OSO3IT取代，η是大于10的数目。硫酸化聚甘油用于将治疗性或诊断性效应分子递送到对象的活化或增殖细胞内的用途，，所述硫酸化聚甘油按照以下形式通式P(OSO3IT)n(L-G)m的硫酸化聚甘油，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中并通过在所述细胞中抑制NF- κ B和/或AP-I和/或抑制TGF- β合成来治疗疾病，其中P表示聚甘油，所述聚甘油中数量为η的羟基被硫酸盐基团OSO3-M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，m是1-100的数目，L是连接物，G是用于与效应分子共价连接的反应性基团，其中L是支链或直链CV2tl-烷基，所述烷基中一个或多个不连续的亚甲基可以被选自O、S、NH、C (O) NH、C (O)、SO2, S0、芳基、乙烯或乙炔的基团代替，并且其中 G 选自-OH、-OSO3H, -OSO3' -NH2, -N3> -C00H、_SH、-SO3' -C = C和在更优选的实施方案中，通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中并通过在所述细胞中抑制NF-κ B和/或AP-I和/或抑制TGF-β合成来治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病的硫酸化聚甘油。在更加优选的实施方案中，涉及硫酸化聚甘油的用途，其中所述治疗性或诊断性效应分子被共价连接到所述硫酸化聚甘油。硫酸化聚甘油的无水制剂，其按照如下形式包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分 子的结合物。硫酸化聚甘油的无水制剂，其按照如下形式通式P(OSO3IT)n(L-G)m的硫酸化聚甘油，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中并通过在所述细胞中抑制NF- κ B和/或AP-I和/或抑制TGF- β合成来治疗疾病，其中P表示聚甘油，所述聚甘油中数量为η的羟基被硫酸盐基团OSO3-M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，m是1-100的数目，L是连接物，G是用于与效应分子共价连接的反应性基团，其中L是支链或直链CV2tl-烷基，所述烷基中一个或多个不连续的亚甲基可以被选自O、S、NH、C (O) NH、C (O)、SO2, S0、芳基、乙烯或乙炔的基团代替，并且其中 G 选自-OH、-OSO3H, -OSO3' -NH2, -N3> -C00H、_SH、-SO3' -C = C。在更加优选的实施方案中，无水制剂通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF- κ B和/或AP-I和/或抑制TGF- β合成，来治疗疾病。在更加优选的实施方案中，无水制剂用于治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病。在更加优选的实施方案中,无水制剂以每次给药lmg/kg至1000mg/kg的剂量执行
多次治疗。在更加优选的实施方案中，无水制剂包含含有缓冲盐和/或选自蔗糖、甘露糖、海藻糖的至少一种低温防护剂的冷冻干燥物。附图简述图I是具有树枝状聚甘油骨架的大分子聚阴离子聚硫酸的示例性化学结构的示意图。起始分子是TMP。该式显示了树枝状、超支化、硫酸化聚甘油的主要结构实体。各种衍生物的合成描述在实施例I和2中。图2是具有聚(酰胺基胺)树枝状化合物骨架(Biocon jug. Chem. 20:693, 2009)的大分子聚阴离子聚硫酸的示例性化学结构的示意图。树枝状化合物的硫酸化与聚甘油同样地执行。该式显示了具有90%平均硫酸化的化合物。图3是具有Boltorn聚酯树枝状化合物骨架(Bioconjug. Chem. 14:817, 2003)的大分子聚阴离子聚硫酸的示例性化学结构的示意图。树枝状化合物的硫酸化与聚甘油同样地执行。该式显示了具有83%平均硫酸化的化合物。图4显示了具有实施例2的连接物的硫酸化聚甘油。所述实施例包括具有硫酸化甘油的代表性结构亚单元和连有连接物的亚单元的大分子硫酸化聚甘油骨架(球泡)的示意图。图5显示了硫酸化聚甘油与实施例3的属于花青染料类型的诊断性效应分子的结合物。所述实施例包括具有硫酸化甘油的代表性结构亚单元和连有连接物和效应分子的亚单元的大分子硫酸化聚甘油骨架(球泡)的示意图。图6显示了硫酸化聚甘油与实施例4的属于螯合剂类型的用于放射标记的诊断性效应分子(放射诊断和放射疗法)的结合物、以及与实施例5的用于MRI的金属络合物的结合物。实施例包括具有硫酸化甘油的代表性结构亚单元和连有连接物和效应分子的亚单元的大分子硫酸化聚甘油骨架(球泡)的示意图。图7显示了硫酸化聚甘油与实施例6的属于光敏化剂、细胞抑制剂(苯丁酸氮芥和紫杉醇)和siRNA类型的治疗性效应分子的结合物。所述实施例包括具有硫酸化甘油的代表性结构亚单元和连有连接物和效应分子的亚单元的大分子硫酸化聚甘油骨架(球泡)的示意图。图8显示了在细胞化学染色(使用DAPI的核染色)中，体外温育I小时的A549人类肺癌细胞对不同分子量的荧光三甘油或聚甘油结合物(ICC染料)的细胞摄取(实施例7)。图9显示了在细胞化学染色(使用DAPI的核染色)中，体外温育4小时的A549人类肺癌细胞对ICC-三甘油结合物和硫酸化大分子肝素和硫酸化聚甘油(实施例3c)的细胞摄取。只有硫酸化聚甘油(SPG)集中在细胞内(实施例8)。
图10通过流式细胞测量分析(FACS)显示出单核细胞能够以非常高的量摄入硫酸化聚甘油(实施例3c的化合物)，而淋巴细胞仅显示出少量摄取(实施例9)。图11证实了硫酸化聚甘油诱导TGF-β -I从CASKI细胞释放的统计学显著的抑制。将细胞处理48小时，并通过ELISA检测培养上清液中的TGF-β -I (实施例10)。图12显示出通过SPR/Biacore测量到硫酸化聚甘油(SPG)、带有连接物的硫酸化聚甘油(SPGL)和带有效应分子的结合物以高亲和性与细胞内转录因子NF-κ B结合。结合亲和性随硫酸化程度和分子量的增加而增加，其由IC5tl值的降低所显示。连接物和效应分子不妨碍结合亲和性(实施例11)。图13强调了硫酸化聚甘油诱导肺A549肿瘤细胞生长(图13A)和代谢活性(图13B)的统计学显著和生物学相关的抑制。将A549细胞与硫酸化聚甘油一起培养7天，并检测细胞数量和代谢活性。显示了培养7天后肿瘤细胞数量(A)和MTT试验(B)的结果(MW±SD)(实施例 12)。图14显示了用硫酸化聚甘油或PBS (对照)治疗的裸鼠(A549肺癌模型)的肿瘤体积的时间过程。在治疗45天后，日剂量为30mg/kg体重的硫酸化聚甘油(化合物P3)抑制肿瘤生长，显示出强治疗效果(实施例13)。图15证实了用硫酸化聚甘油每日皮下治疗患有胶原蛋白诱导的关节炎的大鼠和健康对照的效果。在用硫酸化聚甘油以30mg/kg的日剂量治疗后，临床评分值、滑膜中的肥大细胞数量和炎性浸润受到影响，表明了显著的治疗结果(实施例14)。图16显示了患有胶原蛋白诱导的类风湿性关节炎的麻醉大鼠的荧光图像，其中硫酸化聚甘油与花青染料的结合物(化合物P26/E2，实施例3b)快速和大量摄取，并且患关节炎的关节中的荧光对比度(10分钟)随着疾病活性而增加(从低至高，评分值为I至3)。箭头指示具有高荧光对比度的患关节炎的关节(实施例17)。、
图17显示了在皮肤炎症(接触性超敏反应)的小鼠模型中，硫酸化聚甘油与用64Cu放射性标记的DOTA的结合物(化合物P17/E13，实施例4a)的PET图像。麻醉小鼠的图像在发炎的耳组织中显示出高对比度。箭头指示发炎区域(实施例18)。图18证实了硫酸化聚甘油与紫杉醇(泰素)的结合物(实施例6b的化合物)与没有结合的紫杉醇(泰素)相比，增加了肺肿瘤细胞A549的细胞生长和代谢活性的抑制。显示了在培养48小时后的肿瘤细胞数量(图18A)和MTT试验(图18B)的结果(丽土SD，n=4)(实施例19)。图19显示了在与结合有VEGF-siRNA的硫酸化聚甘油(SPG)(实施例6e)或单独的VEGF-siRNA温育后，A549肺癌细胞系中的VEGF生产。在48h条件细 胞培养基中通过ELISA测量VEGF蛋白。每个柱是来自于三次独立实验的三个测量值的平均值土SEM (实施例 20)。图20显示了本发明的ICG (图20a)、ICG类似物(图20b)的化学结构，以及用作诊断效应分子的优选衍生物的结构(图20c-d)。图21显示了在O. 9%NaCl中，硫酸化聚甘油与花青染料的结合物(化合物P17/E1，实施例3c)的荧光由于聚集而降低。发明详述本发明的目的是提供用于治疗肿瘤疾病、炎症、自体免疫疾病和纤维化的药物，所述药物的特征在于治疗有效性高和耐受性良好。本发明的聚阴离子多价大分子特别是由于其令人吃惊的高效能和即使在施用高剂量后的良好耐受性，适用于将效应分子递送到增殖和活化细胞的细胞质和细胞核中，以诊断和治疗肿瘤疾病、炎症、自体免疫疾病和纤维化。一条系统研究过的细胞途径是具有高分子量的大分子的胞吞作用。胞吞作用是细胞通过将分子(例如大分子)与它们的细胞膜一起吞入，借以从细胞外部吸收所述分子的过程。它是被身体的所有细胞利用的通用机制，因为对细胞重要的大多数物质和底物是大的极性分子，不能通过疏水的质膜或细胞膜。胞吞作用过程在健康细胞和参与疾病过程的细胞两者中都存在(Liu 等，PLOS Biology 2009; 7:1000204)。特别是当大分子结构的大分子或基于粒子的实体(有机或无机纳米粒子)到达细胞膜时，涉及到胞吞作用机制。因此，通过使用大分子载体分子，已实现了靶向性质提高的药物的设计。具体来说，已经合成了品种广泛的聚合实体或树枝状化合物(ori等,Adv DrugDeliv Rev. 57:609，2005 ；Haag 等，Angew. Chem. Int. Ed. 45:1198, 2006)。对于分子的靶向性质来说，大分子的化学修饰已被广泛接受。大量证据表明，置于大分子上的阳离子结构能够使大分子通过胞吞作用跨过细胞膜。就此而言，阳离子大分子被用于诊断和治疗效应子的细胞内递送(Paleos等,Curr Top Med Chem. 8:1204，2008)。然而，由于人类生物体中每个细胞运用胞吞作用机制的普遍能力，阳离子大分子被每个细胞摄入。因此，药物递送涉及具有阳离子元件的组分和结构(例如W02009142893)。这引起药物治疗的许多不想要的效应和毒性，以及药物在不希望的身体区室中的沉积。阳离子肽穿膜肽(Penetratin)被鉴定为NF-κ B 的细胞内抑制剂(Letoha 等，Mol. Pharmacol. 69:2027，2006)。已知由于完整细胞的细胞膜的负电荷引起排斥并阻止细胞膜渗透，因此大多数阴离子结构不被细胞摄取。已经描述了品种广泛的具有聚阴离子状态的大分子实体。其中包括天然存在的化合物例如蛋白聚糖、脂质双层表面、微管和多核苷酸例如DNA或RNA。它们在基因转录和蛋白质合成中发挥中心作用。其他化合物是人造的聚合大分子或树枝状化合物例如聚氨基酸、聚羧酸盐和合成的寡核苷酸。由于完整细胞的细胞膜的负电荷，因此可以预期聚阴离子大分子与细胞膜的静电相互作用可能引起排斥并阻止细胞膜渗透。因此，不知道聚阴离子大分子是否可用于将效应分子递送到增殖和活化细胞的细胞质和细胞核中。事实上，由于单独作为药物效应子给药的RNA或siRNA不能充分集中在细胞中，因此已经做出大量努力以借助阳离子性或特殊载体分子将RNA或siRNA递送至细胞内区室(Jeong等，Bioconjug. Chem. 20:5，2009)。原则上，已知有许多大分子化合物已被用作药物递送载体。这些大分子可以在它们的聚合或树枝状骨架的化学结构类型、阴离子头部电荷的附着、分子量和从完全线性至超支化结构范围内的支化程度方面有差异。聚合骨架的化学性质可以源自于聚合反应以引起多分散分子量分布、或被适度合成以提供具有限定的结构和分子量的树枝状化合物。经过充分研究的实例是聚酰胺基胺(PAMAM)、聚赖氨酸(PU、聚乙烯亚胺(PEI)，它们都被合成为直链或支链结构的多分散聚合物、或限定化学结构的树枝状化合物。对于本技术领域的专业人员来说，已知大分子实体例如PAMAM、PEI、PL等的细胞摄取的普遍潜在机制是基于如上讨论的胞吞途径。关于大分子药物递送的其他信息可以在下列文献 中发现Saovapakhiran 等，Bioconjug. Chem. 20:693，2009 ；Seib 等，J. Contr. Release117:291, 2007 ；Nori 等，Adv Drug Deliv Rev. 57:609, 2005 ；Haag 等，Angew. Chem. Int.Ed. 45:1198，2006。令人吃惊的是，已发现硫酸化多元醇化合物类型的树枝状聚阴离子大分子通过特异性机制集中于细胞内。相同分子量但是不具有硫酸盐基团的多元醇不能集中在人类A549肺癌细胞中。具体来说，将具有5kDa至208kDa范围内的分子量不同但不具有硫酸盐基团、因此仅具有多元醇骨架上的游离羟基的超支化树枝状聚甘油用荧光羰花青染料(ICC)标记，以比较性测量在人类A549肺癌细胞中的细胞内摄入。本发明人惊讶地发现，如果不带有多个硫酸盐基团，只有分子量为120kDa及以上的大分子才能通过胞吞作用被人类A549肺癌细胞摄入。此外，分子量最高20kDa并且不具有硫酸盐基团的超支化树枝状聚甘油不能通过胞吞作用跨过细胞膜(实施例7，图2)，而分子量最高20kDa的硫酸化聚甘油被集中在细胞内。由于硫酸化的树枝状聚甘油被摄入到细胞内，这清楚地显示出硫酸化的树枝状聚甘油与非硫酸化的树枝状聚甘油相比的优势。还已发现，当装配在大分子载体上的硫酸盐基团的数量低于某个值时，低聚硫酸盐不显示出细胞内集中，并且对NF-κ B不具有适度的结合亲和性。与花青染料结合的基于甘油的支化硫酸化树枝状化合物(第一代具有4个硫酸盐，第二代具有8个硫酸盐，第三代具有16个硫酸盐)，在所有情况下都显示出对NF-κ B的结合亲和性为IC5(I>1000(本发明的实施例11)。可以得出结论，大量硫酸盐基团在聚合或树枝状载体骨架上的多价装配，是导致令人吃惊地鉴定到的细胞内集中以及转录因子NF-κ B各AP-I的结合的性质的关键允许因素，并且对硫酸盐基团的最少数量有要求。因此，优选的是表现出数量超过10个硫酸盐基团、更优选超过15个硫酸盐基团、更加优选超过20个硫酸盐基团、最优选超过25个硫酸盐基团的硫酸化聚甘油和硫酸化聚甘油结合物。因此，新的创造性性质是当阴离子电荷以多个装配在大分子中时，阴离子电荷能够起到进入细胞内部的特异性载体和效应子的功能，用于增殖和蛋白质合成的细胞内靶向。更具体来说，将阴离子性硫酸根基团共价连接到大分子载体分子上，引起上述令人吃惊地鉴定到的细胞内集中以及转录因子NF-κ B和AP-I的结合以及TGF-β合成的抑制的性质。根据本发明，令人吃惊地发现，分子大小低于通过胞吞作用过程集中于细胞内部的大分子性质(正如对不具有硫酸盐基团的聚甘油所显示的，其需要高得多的分子量才能集中于细胞中；参见上文)的硫酸化聚甘油，通过不涉及胞吞作用的特异性机制被特异性运输到细胞内。详细来说，关于使用分子量低于20kDa的硫酸化聚甘油的运输机制的研究，为目前尚不了解的用于有机阴离子大分子的内流泵提供了证据。所述内流泵特异性存在于增殖和活化细胞中。在生理pH范围内利用聚阴离子特征的聚合物或树枝状化合物可以是磺酸盐、硫酸盐、膦酸盐、磷酸盐、羧酸盐。向大分子中以合成导入这些基团是多种多样的；一种合理的方式是将多元醇的羟基转变成硫酸盐以提供聚硫酸盐。反应条件决定转化程度(详情参见下文)。硫酸化聚甘油首先由Tiirk等作为一类新的聚阴离子大分子描述(BioconjugateChemistry 15，2004，162-167)。WO 2008/015015描述了发现抑制凝血的不同物质。从该现 有技术公布中，没有关于细胞内集中和选择性结合于NF-κ B和AP-I以及抑制TGF-β释放的提示。基于与二磺酸化萘偶联的聚酰胺基胺(PAMAM)或聚赖氨酸骨架的聚阴离子树枝状化合物，已知作为杀微生物药物候选物用于预防HIV (McCarthy等，Molecular Pharmaceutics 2005, 2, 312-318 ；ffitvrouw 等，MolecularPharmacol. 2000, 58, 1100-1108)。所述化合物靶向病毒粒子细胞膜上的受体。从这些数据不能推导出能够在人类细胞系中实现细胞内靶向。在高于ED5tl浓度2500倍的浓度下，观察到细胞渗透，其表明细胞渗入的非特异性机制。此外，意外地发现聚阴离子多元醇适合于将诊断和治疗性效应分子递送到靶细胞中，因此可用作治疗药物的载体。W093018793描述了用于递送到内皮细胞的聚阴离子药物结合物的制备。在W093018793中概述的实施例涉及用于内皮细胞靶向递送的肝素药物结合物的制备。提供了肝素药物结合物结合到内皮细胞膜上的证据。没有提供关于肝素药物结合物适合于将药物递送到内皮细胞的细胞质的信息。与W093018793 —致，本发明人发现，肝素不能以适宜的浓度跨过细胞膜，并且不能将诊断效应子递送到细胞内。肝素的分子量在7kDa至30kDa范围内，低于胞吞性细胞内摄取所需的大小。此外，本发明的实验结果由此证实了肝素不能集中于细胞内(本发明的实施例8)。更具体来说，对于本发明来说，治疗性效应子是能够直接或间接诱导针对靶细胞的抑制或毒性效应的分子。与增殖和活化不可缺少的某个细胞内靶点结合的治疗性效应子代表直接效应子。本发明人惊讶地发现，属于硫酸化聚甘油类型的聚阴离子多元醇，由于与NF-κ B和AP-I强烈结合而表现出强且持续时间长的细胞内积累(实施例8)。相反，不具有硫酸盐基团的多元醇在温育停止后快速从细胞的细胞质中消除(实施例7)。概括来说，本发明人惊讶地发现，聚阴离子多元醇以高亲和性结合于细胞内靶分子，由此防止快速消除。这种意外发现的性质证实了与基于多元醇的载体骨架相连的多个硫酸盐基团表现出直接治疗效应，因此根据本发明，硫酸盐基团是直接效应子。本发明人证实这些针对NF-κ B的效应子非常有效地抑制TGF-β的合成(实施例10)。由于TGF-β是自体免疫疾病、败血症、SIRS、纤维化、癌症和心血管疾病中的主要介导物，因此能够观察到最终的治疗效果。
基于上面鉴定和描述的性质，发现硫酸化多元醇最适合用于将其他诊断和治疗性效应分子递送到细胞内。这些对本发明来说的间接治疗效应子是能够不依赖于NF- κ B和AP-I的活性抑制而诱导对靶细胞的其他抑制或毒性效应的分子。因此，聚阴离子多元醇的特别性质是将治疗和诊断性效应子递送到细胞内，其显示出与单独的相应治疗和诊断性分子相比，在细胞内的积累和摄入持续时间更长。治疗和诊断性分子与属于聚甘油类型的硫酸化多元醇共价结合，由此在硫酸化聚甘油与治疗和诊断性效应子之间产生结合物。因此，有鉴于上面概述的发现，本发明包含使用聚阴离子大分子来靶向参与活化细胞的增殖和蛋白质合成的细胞内分子。在具体情况中，与多元醇相连的多个硫酸盐基团被特异性靶向增殖和活化细胞的细胞质和细胞核。已发现，所述靶向与胞吞作用的已知细胞摄取机制和已知发生在每种细胞类型中的大分子摄取具有本质上的不同。本发明证实了 聚阴离子大分子在低于胞吞作用途径的分子量下是有效的，并且对于活化和增殖细胞是选择性的(实施例8和实施例9)。专业技术人员理解，活化细胞是代谢活性提高的细胞。活化细胞可以通过MTT测定法来鉴定。此外，细胞活化可以通过在不同细胞类型例如分离的外周血单核细胞或造血细胞系的上清液中检测不同的炎性细胞因子来证实。因此，根据本发明，活化细胞包括免疫系统的细胞或肿瘤细胞。免疫系统的细胞可以是例如单核细胞、巨噬细胞或淋巴细胞。在上述发现的基础上，本发明包括具有下列通式的化合物的用途P (0S03_M+)n(L-G-E)m，其中P=其中多个羟基被硫酸盐基团OSO3If取代的大分子，硫酸根基团的数量优选为n>10，M=阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E=治疗性或诊断性效应分子，L=P与E之间的连接物或间隔基团，G是用于在L与E之间连接的反应性基团，m=0-100。在优选实施方案中，本发明包括通式P (OSO3IT)n(L-G-E)m的化合物的用途，其中P=其中多个羟基被硫酸盐基团OSO3IT取代的多元醇，硫酸根基团的数量优选为n>10，M=阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E=治疗性或诊断性效应分子，L=P与E之间的连接物或间隔基团，G=用于在L与E之间连接的反应性基团，m=0-100o在更优选的实施方案中，本发明包括通式P (OSO3IT)n(L-G-E) m的化合物的用途，其中P=其中多个羟基被硫酸盐基团OSO3-M+取代的聚甘油，硫酸根基团的数量优选为n>10，M= 阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E=治疗性或诊断性效应分子，L=P与E之间的连接物或间隔基团，G=用于在L与E之间连接的反应性基团，m=0-100o共价连接了治疗性或诊断性效应分子的聚阴离子多元醇是新的，并且以前未被描述过。因此，本发明包括具有下列通式的化合物P (0S03_M+)n(L-G-E)m，其中P=其中多个羟基被硫酸盐基团OSO3IT取代的多元醇，硫酸根基团的数量优选为n>10，M=阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E=治疗性或诊断性效应分子，L=P与E之间的连接物或间隔基团，G=用于在L与E之间连接的反应性基团，m=l-100。具有共价连接的连接物单元以与治疗性或诊断性效应分子共价结合的聚阴离子多元醇是新的，并且以前未被描述过。因此，本发明包括具有下列通式的化合物P (0S03_M+)n(L-G-E)m，其中P=其中多个羟基被硫酸盐基团OSO3IT取代的多元醇，硫酸根基团的数量优选为n>10，M=阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E=治疗性或诊断性效应分子，L- = P与E之间的连接物或间隔基团，G=用于在L与E之间连接的反应性基团，m=l-100。在更优选的实施方案中，本发明包括通式P(0S03_M+)n(L-G-E)m的化合物，其中P=其中多个羟基被硫酸盐基团OSO3-M+取代的聚甘油，硫酸根基团的数量优选为n>10，M=阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E=治疗性或诊断性效应分子，L=P与E之间的连接物或间隔基团，G=用于在L与E之间连接的反应性基团，m=l-10。具有共价连接的连接物单元以与治疗性或诊断性效应分 子共价结合的硫酸化聚甘油是新的，并且以前未被描述过。因此，本发明包括具有下列通式的化合物P(0S03_M+)n(L-G-E)m，其中P=其中多个羟基被硫酸盐基团OSO3IT取代的聚甘油，硫酸根基团的数量优选为n>10，M=阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，L=用于P与E之间共价连接的连接物或间隔基团，G=用于在L与E之间连接的反应性基团，
m=l-100o硫酸根基团的可能数量取决于大分子的分子量。作为具体实施方案，大分子基于聚甘油，所述聚甘油由甘油单元的重复单元构成，每个单元能够在大分子中提供一个OH基团。例如，根据理论单分散分子计算，10，000g/mol的聚甘油核心能够提供135个OH基团，2，000g/mol的聚甘油核心能够提供27个OH基团(参见下面进一步的解释)。在实施方案的更详细描述中，本发明的化合物是硫酸化聚甘油，其包含a)聚合的聚甘油核心，其由多官能起始分子上的具有式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元构成，所述多官能起始分子是具有I至1，000个OH基团、优选I至4个OH基团的多羟基化合物，其中R是H或其他甘油单元，所述核心具有O至67%、优选20至67%、更优选高于 60% 的支化度，以及 500 至 1，000, 000g/mol、优选 2，000 至 20，000g/mol、更优选 4，000至15，000g/mol、最优选7，000至10，000g/mol的平均分子量，b)所述甘油单元的多个OH基团被-OSO3H或-0S03_M+取代，使得-OSO3H或_0S03_M+基团的数量大于16，并且获得30至100%的硫酸化度X，其中M+是阳离子性无机或有机反离子，c)由此产生的所述硫酸化聚甘油的平均分子量为1，000至5，000，000g/mol，优选为 4，000 至 50，000g/mol，更优选为 6，000 至 30，000，最优选为 10，000 至 20，000g/mol。根据本发明，“支化度”是指通过聚合过程中甘油单元的两个可用OH基团都与两个其他单体分子(在阴离子聚合的情况下是缩水甘油)的反应获得的支化的程度。支化度为O表示完全直链的聚甘油，没有甘油单元附着于甘油单元的两个OH基团上。67% (2/3)的支化度是对于高支化聚甘油来说理论上可获得的最大值，意味着甘油单元的所有OH基团都已与两个其他甘油单元反应。根据本发明，使用20至67%支化的聚合的聚甘油核心。优选使用高度支化的结构，优选具有30至67%、更优选50至67%的支化度，特别优选具有高于60%的支化度。聚合的聚甘油核心通过在缩水甘油的开环聚合期间分别使用(多)官能起始分子或引发剂来生产。起始分子或引发剂分别是具有I至1，000、优选I至100、更优选I至10、最优选I至4个OH基团的多羟基化合物。起始分子具有通式R-(OH)x，其中R可以是在阴离子聚合条件下稳定的任何分子，X是I至1，000、优选I至100、更优选I至10、最优选I至4。优选，所使用的引发剂是三或四官能引发剂，例如1，1，I-三羟基甲基丙烷(TMP)或1，1，I-三羟基甲基乙烷(TME)作为优选的三官能引发剂，或季戊四醇(PE)作为优选的四官能引发剂。起始分子或引发剂分别能够携带其他官能团，例如特别是SH基团、NH2基团。在具体实施方案中，起始分子含有OH基团和/或其他异质官能团(例如用适合的保护基团衍生的SH、NH2)。另一种起始分子可以是具有3个以上、优选10个以上、更优选20个以上OH基团的小的聚合的聚甘油。其他适合的引发剂、异质官能团和保护基团，对于本技术领域的专业人员来说是已知的。根据本发明，术语“聚甘油核心”是指在多官能起始分子上通过聚合过程产生的具有式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元构成的聚合分子。因此，核心只包含游离羟基和C、H、O元素。核心的分子量可以通过例如质谱术(MALDI)测定。核心经历进一步衍生化或官能化，产生本发明的化合物。这些官能化包括使用本技术领域的专业人员已知的适合试剂进行硫酸化，或包括连接物分子的共价连接。优选，使用SO3和吡啶的复合物作为硫酸化试剂。该试剂将-OH基团转变成-OSO3H或-0S03_Na+基团。所述硫酸化试剂优选以对应于所需硫酸化度的浓度使用。这意味着硫酸化试剂以相对于待转化的聚合的聚甘油核心的OH基团等摩尔或更高摩尔当量的浓度使用。因此，可以通过SO3与聚甘油的OH基团的比率来调整 所得到的官能化，即硫酸化。根据本发明，“硫酸化度”是指聚合的聚甘油核心的甘油单元的官能化(硫酸化)OH基团相对于总OH基团数的百分数。官能化得自于甘油单元的一个或多个OH基团被-OSO3H或-0S03_M+基团的取代，或得自于带有-OSO3H或-0S03_M+基团的低聚间隔基团在甘油单元的一个或多个OH基团处的连接。阳离子性反离子M+选自无机碱金属钠、钾、锂、钙或有机阳离子化合物葡甲胺、赖氨酸、甘氨酸或其混合物。优选的是产生-0S03_Na+基团的钠。对于多元醇、特别是聚甘油来说，本发明提供的数据表明，聚合物的分子量参数以及羟基的硫酸化度，对于提高与细胞内靶的结合亲和性来说是重要的。意外地发现，硫酸化度的增加和分子量的增加两者都增加与NF- κ B的结合亲和性。这种增加是出乎意料的，并且是所述分子的新性质的强力指示。因此，优选的硫酸化聚甘油是核心分子量高于3，OOOg/mol、更优选高于6，000g/mol、更加优选高于10，000g/mol的聚甘油。优选的硫酸化度高于38%，更优选高于50%，更加优选高于76%，更优选高于86%，最加优选高于90%。优选的值和100%的最大可实现程度被理解为是基于通过硫的元素分析得到的测量值的±5%的通用标准误差。取决于引发剂和聚合条件的选择，聚合的聚甘油核心达到一定支化度和可任意调整的平均分子量，所述分子量不是确定的分子量，而是覆盖一定分子量范围的分布。这种所谓的多分散性可以由多分散性指数(PDI)来描述。PDI被定义为Mw/Mn，其中Mw是重均分子量，Mn是数均分子量。高硫酸化聚甘油的优选多分散性指数低于2. 3，更优选低于I. 8，最优选低于I. 5。用于描述聚甘油核心的平均分子量是数均分子量Mn。如上所述,硫酸化反应对本技术领域的专业人员来说是已知的。硫酸化优选通过使用三氧化硫复合物(吡啶-SO3、三甲胺-SO3、三乙胺-SO3、二甲基甲酰胺-SO3)来实现。硫酸化在分离的聚甘油上执行，或在聚合反应后通过向聚合反应器直接加入硫酸化试剂在一个步骤中执行。这种用于获得本发明的硫酸化聚甘油的一步程序是新的，并且以前未被描述。通过改进硫酸化条件，将硫酸化度提高到超过现有技术水平。硫酸化试剂的I. 2倍过量与在至少18小时的反应时间内将反应温度维持在高于80°C、优选高于90°C相组合，适合于获得高于85%的硫酸化度。令人吃惊的是，没有检测到分解和副产物。意外地发现，对硫酸化聚甘油所演示的附着于大分子的附加连接物单元，不妨碍本发明的作用方式和化合物的使用。在实施例11中显示了用连接物进行修饰导致与没有连接物的硫酸化聚甘油相比，与NF- K B的结合亲和性具有相同的IC5tl值。使用连接物修饰的合成方法，然后进行硫酸化和去保护步骤，以产生具有反应性官能团的衍生物，这显示出可以获得与诊断和/或治疗性效应分子的有效的共价结合。W02008/015015宣称了带有信号传导分子的聚甘油硫酸盐，然而没有讲授通过合理的连接物修饰获得这样的结合物的详细合成信息，并且没有示例所述结合物。W02008/015015没有提供关于信号传导分子的化学详情以及如何使用的技术解决方案。此外，没有提供也不清楚使支持所使用的术语“荷载”或“结合于”的合成化学类型。连接物单元L是附着于至少一个OH基团的带有官能团的烷基，官能团G有能够与其他治疗性或诊断性效应分子E结合的潜力。根据本发明，连接物连接于至少一个OH基团，由此形成醚、羧酸酯、磺酸酯、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、脲、硫脲、三唑键。本发明的带有附加连接物的聚甘油硫酸盐是新的，并且以前未被描述过。因此，在实施方案的更详细描述中，本发明的化合物是具有连接物的硫酸化聚甘油 P (OSO3IT)n (L-G)m，其包含a)聚合的聚甘油P，其由多官能起始分子上的具有式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元构成，所述多官能起始分子是具有I至1，000个OH基团、优选I至4个OH基团的多羟基化合物，其中R是H或其他甘油单元，所述核心具有O至67%、优选20至67%、更优选高于60% 的支化度，以及 500 至 1，000, 000g/mol、优选 2，000 至 20，000g/mol、更优选 4，000 至15，000g/mol、最优选7，000至10，000g/mol的平均分子量，b)所述甘油单元的多个OH基团被-OSO3H 或-OSCVM+取代，其中-OSO3H或_0S03_M+基团的优选数量大于10，并且获得30至100%的硫酸化度X，其中M+是阳离子性无机或有机反离子，c)所述硫酸化聚甘油由此产生的平均分子量为1，000至5，000，000g/mol，优选为4，000 至 50，000g/mol，更优选为 6，000 至 30，000，最优选为 10，000 至 20，000g/mol,d)带有官能团G的连接物单元L，其连接于至少一个OH基团直至最多100-X%的OH基团，其中所述官能团有能够与其他治疗性或诊断性效应分子结合的潜力，其中X是硫
酸化度。优选的是式(I)、(II)或(III)的硫酸化聚甘油
权利要求
1.药物组合物，其包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的的治疗性或诊断性效应分子。
2.权利要求I的药物组合物，其为式P(OSO3IT)n(L-G-E)m,P是多元醇大分子，其中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3-M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E是治疗性或诊断性效应分子，L是P与E之间的连接物或间隔基团，G是用于在L与E之间进行共价连接的反应性基团，和m是1-100的数目。
3.权利要求I或2的药物组合物，其通过所述硫酸化聚甘油和治疗性或诊断性效应分子细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF- K B和/或AP-I和/或抑制TGF- ^合成，来治疗疾病。
4.结合物，其包含硫酸化聚甘油和与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子。
5.权利要求4的结合物，其为式P(OSO3IT)n(L-G-E)m,P是多元醇大分子，其中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3-M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，E是治疗性或诊断性效应分子，L是P与E之间的连接物或间隔基团，G是用于在L与E之间进行共价连接的反应性基团，和m是1-100的数目。
6.权利要求4或5的结合物，其为式P(OSO3IT)n(L-G-E)m，其中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3IT取代，且n是大于10的数目。
7.权利要求4至6的结合物，其中所述效应分子占所述结合物的小于50重量％，并且所述结合物在水中的溶解度在100mg/mL以上。
8.权利要求4至7的结合物，其包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子以通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中并通过在所述细胞中抑制NF- K B和/或AP-I和/或抑制TGF- ^合成来治疗疾病。
9.权利要求4至8的结合物，其包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子以治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病。
10.权利要求4至9的结合物，其包含硫酸化聚甘油以及与所述硫酸化聚甘油共价结合的治疗性或诊断性效应分子以按照权利要求3或4来治疗疾病，其中以每次给药lmg/kg至1000mg/kg的剂量进行多次治疗。
11.权利要求4至10的结合物，其包含 a)聚合的聚甘油P，其由在多官能起始分子上的式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重复单元构成，所述多官能起始分子是具有I至1，000个OH基团的多羟基化合物，其中R是H或其他甘油单元，核心具有0至67%的支化度、500至1，000, 000g/mol的平均分子量， b)所述甘油单元的多个OH基团被-OSO3H或-0S03_M+取代，其中-OSO3H或_0S03_M+基团的优选数目大于10，并且获得30至100%的硫酸化度X，其中M+是阳离子性无机或有机反离子， c)由此产生的硫酸化聚甘油的平均分子量为1，000至5，000，000g/mol, d)带有官能团G的连接物单元L，其连接于至少一个OH基团直至最多100-X%的OH基团，官能团能够与其他治疗性或诊断性效应分子结合，其中X是硫酸化度， e)诊断性和/或治疗性效应分子，其共价连接于一个直至最大可能数量的所述官能团，诊断性效应分子选自荧光染料或用于放射活性或顺磁性金属的螯合剂，并且治疗性效应分子选自细胞抑制剂、抗血管生成药物、光敏化剂、siRNA。
12.权利要求5至11的结合物，其为式P(OSO3IT)n(L-G-E)m，其中L是支链或直链C1^20-烷基，所述烷基中一个或多个不连续的亚甲基可以被选自O、S、NH、C (0) NH、C (0)、SO2,SO、芳基、乙烯或乙炔的基团代替，并且其中G选自-oh、-oso3h、-oso3_、-nh2、-n3、-cooh、-sh、~S03、_C 三 Co
13.—种通式P(OSO3IT)n(L-G)m的硫酸化聚甘油，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中并通过在所述细胞中抑制NF-k B和/或AP-I和/或抑制TGF-P合成来治疗疾病，其中P表示聚甘油，所述聚甘油中数量为n的羟基被硫酸盐基团OSO3-M+取代，M是阴离子性硫酸根基团的阳离子性无机或有机反离子，m是1-100的数目，L是连接物，G是用于与效应分子共价连接的反应性基团，其中L是支链或直链C1,-烷基，所述烷基中一个或多个不连续的亚甲基可以被选自O、S、NH、C (0) NH、C (0)、SO2, S0、芳基、乙烯或乙炔的基团代替，并且其中 G 选自-OH、-OSO3H' -OSO3' -NH2、-N3> -C00H、_SH、-SO3' -C = C。
14.权利要求13的硫酸化聚甘油，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF- K B和/或AP-I和/或抑制TGF- ^合成，来治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病。
15.权利要求13的硫酸化聚甘油，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中并通过在所述细胞中抑制NF-k B和/或AP-I和/或抑制TGF-P合成来治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病，其中以每次给药lmg/kg至1000mg/kg的剂量进行多次治疗。
16.权利要求4、5和6的硫酸化聚甘油用于将治疗性或诊断性效应分子递送到对象的活化或增殖细胞内的用途。
17.权利要求13和14的硫酸化聚甘油用于将治疗性或诊断性效应分子递送到对象的活化或增殖细胞内的用途。
18.权利要求16和17的硫酸化聚甘油的用途，其中所述治疗性或诊断性效应分子与所述硫酸化聚甘油共价连接。
19.权利要求4的硫酸化聚甘油的无水制剂。
20.权利要求13的硫酸化聚甘油的无水制剂。
21.权利要求19和20的无水制剂，其通过细胞内摄入到活化细胞或增殖细胞中，并通过在所述细胞中抑制NF- K B和/或AP-I和/或抑制TGF- ^合成，来治疗疾病。
22.权利要求19和20的无水制剂，其用于治疗选自癌症、炎症、自体免疫疾病和纤维化的疾病。
23.权利要求19和20的无水制剂,其中以每次给药lmg/kg至1000mg/kg的剂量进行多次治疗。
24.权利要求19和20的无水制剂，其包含含有缓冲盐和/或选自蔗糖、甘露糖、海藻糖的至少一种低温防护剂的冷冻干燥物。
全文摘要
本发明涉及使用聚阴离子多价大分子对参与活化细胞的增殖和蛋白质合成的细胞内分子进行靶向的方法和组合物。具体来说，将与多元醇相连的多个硫酸盐基团特异性靶向增殖和活化细胞的细胞质和细胞核。本发明还包含新的聚阴离子大分子化合物和制剂。
文档编号A61K47/48GK102781478SQ201180008313
公开日2012年11月14日 申请日期2011年1月31日 优先权日2010年2月3日
发明者凯·理查, 弗洛里安·保勒斯, 皮娅·维克尔, 米歇尔·席尔内, 莱内尔·哈格, 马里·维恩哈特 申请人:米韦林有限公司