用于向动物或人体无创输送活性蛋白质的制剂的制作方法

用于向动物或人体无创输送活性蛋白质的制剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种含至少一个活性肽、用于预防或治疗动物或人类疾病的制剂。所述活性肽在输送至动物或人体前和后，已在系统中表达，以有助于保持对所述肽的预防或治疗作用至关重要的性质，直至所述肽将其活性传递到所述动物或人体内的效应部位为止。本发明与口服或黏膜疫苗或生物药物制剂尤为相关。制剂的活性肽在细胞或动物体内重组表达。在本发明的一个优选实施方案中，制剂的活性多聚脯氨酸已在昆虫细胞或昆虫幼虫中重组表达。
【专利说明】用于向动物或人体无创输送活性蛋白质的制剂

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种由药物活性剂，例如但不限于免疫原性剂（如疫苗），构成的制 齐IJ。所述制剂利用融合肽在宿主细胞或机体中的异源表达制备而成。融合肽序列促使活性 剂组装成稳定的纳米结构，使有效量的药物活性剂能输送并到达动物或人体的效应物，而 不发生改变。在本发明的优选实施方案中，该制剂通过对用于所述融合肽的异源表达的鳞 翅目幼虫进行均质化处理制备而成，用于经口输送到动物体内。

【背景技术】
[0002] 诱导产生的粘模免疫在抗病原体的保护中非常重要，后者通常通过黏膜表面侵 入。将疫苗输送到粘模表面能最有效地诱导黏膜免疫的产生。黏膜免疫系统明显的联结性 质使疫苗能够输送到任何黏膜表面，诱导其他部位的潜在免疫（HOLMGREM，J等人黏膜免疫 和疫苗，《自然医学》，2005年，第4卷，第S45-53页）。口服是一种非常简单且低成本的将 疫苗输送到肠道黏膜表层的方法。但是，利用该途径给药的疫苗在胃肠道中易受到蛋白酶 解作用。因此，蛋白质亚单元疫苗的剂量水平可能会很高，而且抗原可能需要蛋白酶解保护 才能使口服输送有效（STREATFIELD等人，使用重组植物生产的口服疫苗的黏膜免疫接种， 《方法》，2006年，第38卷，第2期，第150-157页）。
[0003] 因而，目前尚未证实口服输送菌苗或亚单元疫苗是否有效，因为抗原在传递到肠 道黏膜免疫响应细胞前一般会被胃改性。虽然已对大量的方法做过检验以期提供一种能通 过胃的口服输送载体，但大多数方法都无法发展为商业规模。
[0004] 有人提出用聚合物纳米粒子/微粒作为常规药物黏膜给药的一种解决方案，虽然 目前正对一些用于黏膜疫苗输送的聚合物输送系统进行评估，但是商业上尚未开发这些材 料用于疫苗输送。以聚合物为基础的方法设计成能保护肠道中的抗原，将抗原靶向肠道相 关淋巴组织，或通过生物粘着增加抗原在肠道中的停留时间（VYAS，S.P.等人，纳米粒子/ 微粒在黏膜疫苗输送中的影响因子，《疫苗专家评论》，2007年，第6卷，第3期，第401-18 页）。但在这些方法成为切合实际的现实前，必须克服很多难关。其中，使用有机溶剂和材 料制备颗粒会对接种疫苗的机体或环境构成威胁（EP 2105129 A(HAREL))。此外，颗粒的制 备常常使生产成本增加至无法接受的水平，尤其是在兽医领域。
[0005] 由于口服蛋白质亚单元疫苗在胃肠道中必定面临蛋白酶解，因此蛋白质亚单元疫 苗的剂量水平可能会很高，而且抗原可能需要蛋白酶解保护才能使口服输送有效。如果使 用经典的以细胞培养为基础的重组表达平台，获得较高含量的抗原不仅困难，而且成本昂 贵。另一方面，一旦有效量的未改变抗原到达肠道粘膜，抗原必须靶向专门引发免疫反应的 黏膜细胞（JEPS0N，M.A.等人，凝集素介导的M细胞靶向：黏膜疫苗接种和药物输送的策略， 《先进药物输送评论》，2004年，第56卷，第4期，第511-25页）。
[0006] 通过研究能生产大量重组蛋白的低成本生产系统，人们开发出一些新的技术平 台。以鳞翅目幼虫为基础的杆状病毒表达系统是一种低成本、高水平的表达系统。该技术的 一个有趣方面得到不同实验的证实，即表明疫苗或生物药物在鳞翅目幼虫的粗提取物中经 口向小鼠给药会导致黏膜以不同的水平进行吸收，使该活性化合物产生系统性活性（GONG， Z.，通过口服蚕中生产的霍乱毒素 B亚单元-胰岛素 B-链融合蛋白疫苗抑制患非肥胖型糖 尿病（NOD)小鼠的糖尿病，《疫苗》，2007年，第25卷，第8期，第1444-51页，XIA0，H.L.等 人。来自蚕幼虫的重组骨保护素的口服活性测定，《分子生物技术》，2007年，第35卷，第8 期，第179-84页）
[0007] 杆状病毒表达技术广泛用于生产供人和兽使用的、以病毒样颗粒（VLP)为基础的 重组疫苗或糖基化病毒抗原。其中一些产品在市场上已有销售。例如GSK ΜΟΝΙΕ,Α.等人商 业化的人乳头状瘤病毒疫苗Cervarix? (卉研康：用于预防与人乳头状瘤病毒（HPV) 16, 18型有关的子宫颈癌的疫苗，《生物学》，2008年，第2卷，第1期，第97-105页）或英特威 (默沙东动物保健）公司销售的预防猪圆环病毒2型的保护性疫苗-Circumvent PCV⑩:和 Porcilis PCY⑩（GRAU-R0MA，L.等人，猪圆环病毒疫苗2型引起的疾病的传染病学、诊断和 控制，《兽医学杂志》，2011年，第187卷，第1期，第23-32页）。
[0008] 不同的作者已说明，利用杆状病毒表达技术生产的VLP是能高效地将异源细胞毒 素 T淋巴细胞表位输送到MHC-I途径的载体，因为它们能够在无外源性佐剂存在的情况下 诱导强有力的免疫反应。虽然这些免疫刺激性质最初完全归因于VLP的颗粒结构，但现在 已证实这些颗粒的辅助作用取决于活性杆状病毒的存在与否（HERVAS-STUBBS，S.等人，昆 虫杆状病毒通过诱导产生I型干扰素大大增强了适应性免疫应答，《免疫学杂志》，2007年， 第178卷，第4期，第2361-69页），这些颗粒伴随生产过程产生，使杆状病毒表达的抗原成 为独特的疫苗候选产品。
[0009] 本发明旨在解决目前阻碍疫苗或生物药物开发和销售的技术、环境和经济问题。


【发明内容】

[0010] 在本发明中，活性剂通过融合肽的重组表达获得。通过表达，活性物质在宿主细 胞、培养基或宿主机体的体内积累，附着在脂质膜上或以稳定粒子的形式聚集。活性剂是一 种由两个序列联结在一起构成的融合肽，其中一个序列为目标产物，另一个序列促进目标 产物向脂质膜融合或促进目标产物积聚成稳定的粒子。目标产物可从（但不限于）能在动 物或人体中诱导免疫反应抵抗病原体的免疫原性肽或蛋白中选择。此外，目标产物还可从 (但不限于）对动物或人类疾病有治疗作用的肽和蛋白中选择。
[0011] 根据本发明的一个方面，活性剂为表达融合序列的肽，一般而言这些序列能促进 活性剂附着在脂滴或脂质膜。宿主细胞或宿主机体经过处理恢复所述活性剂时，附着在脂 质膜上能促进活性剂自然地封装在脂质体中。下文中对用于将活性剂附着在脂质膜上的序 列进行进一步说明。
[0012] 根据本发明的另一方面，活性剂为表达融合序列的肽，这些序列能促进所述活性 剂聚集成稳定的蛋白颗粒。这些结构的颗粒性质能防止活性剂被蛋白酶的降解，从而增强 活性剂的稳定性，并能通过黏膜免疫响应细胞帮助识别活性剂。下文中将对用于诱发活性 剂聚集成蛋白颗粒的序列进行进一步说明。
[0013] 根据本发明的另一方面，利用活性剂融合到脂质膜或聚集成蛋白颗粒的特性，开 发活性剂的具体纯化方法。
[0014] 根据本发明的一个优选实施方案，利用杆状病毒表达载体技术在昆虫幼虫中表达 融合肽（KATO, T.等人，作为生命科学中平台技术的蚕表达系统，《应用微生物学与生物技 术》，2010年，第85卷，第3期，第1459-70页；C0X，M.M.等人，昆虫细胞中生产的重组蛋白 疫苗，《疫苗》，2012年，第30卷，第10期，第1759-66页）。
[0015] 本发明提供一种利用上述融合肽的异源表达获得自然封装的生物活性肽制剂的 方法。所述方法包括： 1. 在允许异源肽表达的条件下培养宿主细胞或宿主机体，所述异源肽表达在于将目标 产物融合到能促进附着在脂质膜上或聚集成稳定的蛋白颗粒的序列上； 2. 收获所述宿主细胞或宿主机体,或从宿主细胞培养基中或从所述机体的体内取样； 并（若需要） 3. 制备澄清匀浆或粗提物；并（若需要） 4. 提高匀浆或粗提物中所述异源肽的纯度水平；并（若需要），添加使最终制剂理化性 质改性的物质。
[0016] 根据本发明的一个优选实施方案，所述制剂通过对用至少一种重组杆状病毒感染 来表达融合肽的昆虫幼虫进行均质化处理制备而成。在均质化昆虫幼虫中利用杆状病毒表 达载体技术积累融合肽，提供了一种用于口服或粘膜输送的疫苗或生物药物、具有成本效 益的天然制剂。
[0017] 根据本发明的另一方面，利用融合肽异源表达获得的制剂用于动物或人的口服或 黏膜疫苗接种。根据本发明的一个优选方案，接种疫苗的动物从鱼、甲壳类动物、鸟或牛中 选择。根据一个更为优选的实施方案，用该制剂喂动物。
[0018] 在本发明的另一方面，使用通过融合肽的异源表达获得的制剂，将药物活性剂在 肠道内输送到动物或人体内。根据本发明的一个优选方案，用该制剂来喂人，用于将活性剂 输送到肠黏膜。根据一个更为优选的实施方案，活性剂为用于治疗溶酶体贮积症的溶酶体 酶。
[0019] 根据本发明的一个更具体的方面，融合肽为糖肽。若糖肽在优选昆虫宿主中重组 表达，则众所周知糖肽具有较高水平的暴露的末端甘露糖残基。明确地说，甘露糖受体存在 于像肠黏膜的巨噬细胞或特化细胞的免疫响应细胞中，而这些残基则与甘露糖受体相互作 用。这些相互作用能帮助本发明中自然封装的活性剂靶向肠黏膜的效应细胞。
[0020] 通过以下详细说明，本发明的其他方面和优点将会更加明显。

【具体实施方式】
[0021] 根据本发明的一个方面，活性剂是表达融合序列的肽，且这些序列一般而言能促 进活性剂附着在脂滴或脂质膜。大多数真核细胞合成中性脂质并将其包裹在细胞溶质的脂 滴中。在脊椎动物中，富含三酰甘油的脂肪细胞脂滴为身体提供一个重要的能量储存库，而 其他多种细胞富含胆固醇酯的小滴则为局部膜合成和修复提供材料。这些脂滴包被在围脂 滴蛋白家族（PAT家族）五个成员中的一个或多个成员的表面：脂肪分化相关蛋白、TIP47、 OXPAT/MLDP、S3-12和围脂滴蛋白（BRASAEMBLE，D. L.等人，主体评论系列：脂肪细胞生物 学）。脂滴结构蛋白的围脂滴蛋白家族：脂滴的稳定化和脂解的控制，《脂质研究杂志》，2007 年，第48卷，第12期，第2547-59页。
[0022] PAT家族最初通过同源性鉴定为围脂滴蛋白氨基末端中高度保守的含100个氨基 酸的结构域，即"PAT结构域"（图1)。
[0023] 根据本发明的一个优选实施方案，促进融合肽附着在脂质膜上的序列源于PAT家 族的蛋白质或其同源物（BICKEL，P.E.等人，PAT蛋白，调节细胞脂质贮存的脂滴蛋白的原 始家族，《生物化学与生物物理学学报》，2007年，第1791卷，第6期，第419-40页）。根据 本发明的更为优选的实施方案，所述序列源于昆虫表达PAT蛋白或其同源物。
[0024] 昆虫表达PAT蛋白分成两个不同的亚科（LSD-1和LSD-2 ;脂质储存小滴蛋白-1 和-2)(图1)。有新证据表明，像哺乳动物家族成员一样，昆虫PAT也能在PKA引发的脂解 作用中起到至关重要的作用，并能促进中性脂质的储存。此外，还与哺乳动物PAT具有很多 共性：定位在脂滴，受磷酸化调节（PKA为其中一种引起磷酸化的激酶），与脂肪酶的ATGL/ Brmnmer家族共同协作（GR0NKE，S.等人，脂肪的储存受果蝇PAT结构域蛋白控制，《当代生 物学》，2003年，第13卷，第7期，第603-6页）。
[0025] 人们认为，PAT蛋白通过数个嵌在核心中的疏水结构域定位在脂滴上（图1)，该 核心充满中性脂质，而中心的高度带电酸性结构域远离脂滴的表面形成环状结构。带两亲 性β折叠片特性的序列可浅浅地嵌入小滴的表面磷脂中（GARCIA，A.等人，需要中心结构 域将围脂滴蛋白A靶向和定位到脂滴上，《生物化学杂志》，2003年，第278卷，第1期，第 625-35 页）。
[0026] 根据本发明的一个优选实施方案，用于促进融合肽附着在脂质膜上的序列包括家 蚕的LSDl蛋白的脂滴靶向螺旋（序列识别号：1)。
[0027] 根据本发明的另一实施方案，促进融合肽附着在脂质膜上的序列源于人小窝蛋白 家族或其同源物（GLENNEY，J.R.等人，小窝蛋白（一种在劳斯肉瘤病毒转化的成纤维细胞 中酪氨酸上磷酸化的细胞膜穴样内陷质膜的蛋白成分）的序列和表达，《美国国家科学院院 刊》，1992年，第89卷，第21期，第10517-21页）。
[0028] 细胞膜穴样内陷是质膜上一些较小的凹陷部分，且被认为在信号传导、胆固醇输 送和内吞作用中起到重要作用。小窝蛋白是上述功能所必需的且构成细胞膜穴样内陷的结 构骨架（FUJM0T0，T.等人，小窝蛋白-2靶向脂滴，细胞中一种新的"膜结构域"，《细胞生物 学杂志》，2001年，第152卷，第5期，第1079-85页）。小窝蛋白-2,尤其是其β-异形体， 靶向脂滴的表面。小窝蛋白-2的中心疏水结构域（87-119个残基）以及N-末端（70-86 个残基）和C-末端（120-150个残基）的疏水结构域对脂滴中的定位都是必需的。N-和 C-末端似乎分别与膜结合和排出内质网有关，这意味着小窝蛋白_2合成为膜蛋白运送至 脂滴。
[0029] 根据本发明的一个具体方面，融合肽包含人小窝蛋白_2的β_异形体的N-和 C-末端和疏水中心结构域（序列识别号：2)。根据本发明的另一方面，融合肽包含人小窝 蛋白-2的β -异形体的N-末端、疏水中心结构域和C-末端处的内质网驻留信号（序列识 别号：3)。
[0030] 根据本发明的另一实施方案，促进融合肽附着在脂质膜上的序列源于原始广泛存 在蛋白-I(AUPl)蛋白家族或其同源物。
[0031] 内质网蛋白的质量控制涉及错误折叠蛋白质的识别与结合，使错误折叠蛋白穿过 内质网膜进行位置转换以及泛素介导靶向至蛋白酶体进行降解。AUPl物理结合哺乳动物 HRD1/SEI1L复合体，AUPl-消耗会损害错误折叠内质网蛋白的降解。AUPl在内质网质量控 制中的其中一个功能是，补充可溶E2-泛素结合酶UBE2G2。AUPl的CUE结构域对多聚泛素 化进行调节并对AUPl与HRDl复合体和位置转换底物的相互作用起决定性作用（图2)。
[0032] AUPl定位到内质网和脂滴上。AUPl表达水平影响细胞脂滴的丰度，因此它代表了 使脂滴调节活性与内质网质量控制相联系的最重要的蛋白（KLEMM，E.J.等人，原始广泛存 在蛋白-I(AUPl)在脂滴积累和内质网蛋白质量控制中的双重作用，《生物化学杂志》，2011 年，第286卷，第43期，第37602-14页）。AUPl包含靠近插入膜内的N-末端（图2)的疏 水区，因此细胞质中有两个末端（SPANDL，J.等人，原始广泛存在蛋白-I(AUPl)定位在脂滴 上并通过其G2结合区与E2泛素结合酶G2 (Ube2g2)结合，《生物化学杂志》，2011年，第286 卷，第7期，第5599-5606页）。
[0033] 根据本发明的一个优选实施方案，用于促进融合肽附着在脂质膜上的序列包括西 方蜜蜂AUPl蛋白的脂滴靶向疏水区（序列识别号：4)。
[0034] 昆虫的脂肪体在功能上与哺乳动物的肝脏类似，包含合成、储存和转运糖原、脂质 和蛋白质的单细胞类型。脂肪体是一个相对较大的器官，分布在昆虫整个身体中，优先分布 在体被下面以及肠道和生殖器官的周围。脂肪体的基本单元是脂肪细胞，特点是存在大量 脂滴（ARRESE，E. L.等人，昆虫脂肪体：能量、新陈代谢和调节，《昆虫学年评》，2010年，第55 期，第207-25页）。
[0035] 根据本发明的另一实施方案，当所述目标产物联结上述任一脂质膜靶向序列时， 目标产物在昆虫脂肪体脂肪细胞中积累。
[0036] 前面已经对脂肪体的细胞内脂质小泡的纯化方法进行了说明。根据本发明的另一 实施方案，昆虫脂肪体内积累的目标产物通过采用所述细胞内小泡的纯化方法进行纯化， 其中所述方法可以，但不限于，以密度梯度纯化法为基础。
[0037] 根据本发明的另一实施方案，还定义了促进可定义为两亲性螺旋构象的、能自组 装的以及具有将定向组织传递到超分子结构的序列。所述序列（见序列识别号：5)能进行 自组装。"Lee、LEE，K.K.等人，磷酸化丝氨酸和苏氨酸二肽中位点选择性分子内氢键相互 作用，《化学物理杂志B》，2008年，第112卷，第51期，第16782-87页"定义了类似的多聚脯 氨酸序列。由于能聚集形成超分子纳米结构，事实上Lee等人定义的分子能形成空心球。
[0038] 令人意外的是，活性多肽融合到该专利中定义的多聚脯氨酸序列上时，融合产物 形成有组织的纳米结构。
[0039] 该特殊发明的另一实施方案使用密度分离技术分离/浓缩纳米结构；另外，由于 序列中有组氨酸残基，序列本身适合通过固定化金属亲和技术进行纯化，在形成多聚聚脯 氨酸时，会推动这些组氨酸残基彼此靠近。

【专利附图】

【附图说明】
[0040] 图1为脂滴蛋白PAT家族十个成员的结构。所示的前七个（围脂滴蛋白A至S3-12) 来自哺乳动物，后三个来自非哺乳动物物种（分别为苍蝇和真菌）。这些蛋白质在其N-末 端都有一个序列高度相似、约有100个氨基酸的区域（PAT结构域）。信息摘自Bickel等人 的文献。
[0041] 图2为AUPl蛋白家族的结构域结构，AUPl具有410个氨基酸且在多细胞机体中 高度保守。该图（人AUPl)显示四个保守结构域。N-末端发夹形跨膜结构域为本发明中用 于将抗原靶向脂滴的结构域。 具体实施例
[0042] 例 1
[0043] 虹鳟鱼口服疫苗接种预防IHNV
[0044] 用以下材料感染不同组的粉纹夜蛾幼虫：（a)表达传染性造血器官坏死病毒 (IHNV)糖蛋白G和核蛋白N的重组杆状病毒；(b)表达融合到家蚕1蛋白的脂滴靶向序列 上、在于IHNV糖蛋白G和核蛋白N序列的重组杆状病毒；（c)表达融合到多聚脯氨酸序列 上、在于IHNV糖蛋白G和核蛋白N序列的重组杆状病毒；并（d)带空载体的对照杆状病毒。
[0045] 感染和冷藏80小时后收获被感染的幼虫。将I. 5g经均质化处理的幼虫和3g鱼 油混合制备口服疫苗。用该含有混合物覆盖在IOOg的虹鳟鱼幼体标准商品饲料表面。将 平均体重为0. 12g的三十条虹鳟鱼鱼苗装入I. 5L聚丙烯水箱中作研究用。在每次实验中， 用按如上所述用不同组的被感染幼虫制备的口服疫苗和一个用未感染幼虫覆盖饲料表面 制备的对照组喂食这些鱼，对其接种疫苗。
[0046] 利用以下方法测定接种疫苗的鱼的免疫响应：(a)对遗传基因的表达和适应性 免疫应答进行实时定量PCR(聚合酶链反应）分析（免疫球蛋白、IFN-Y1、IFN-Y2、gig2、 mhc2b、mhcl、mxb和mxc) ;(b)酶联免疫吸附测定法，即用接种疫苗的鱼血清涂抹培养皿，捕 获经纯化的IHNV-G和-N蛋白，然后用特异性第二抗体检测。接种疫苗后两个月内，接种疫 苗的动物产生抵抗IHNV的抗体，出现特异性免疫应答。
【权利要求】
1. 一种用由宿主细胞或机体制备的部分纯化匀浆或样品制成的、将药物活性剂输送 到动物或人体内的制剂，其中，至少已表达一个异源肽，所述肽由两个联结在一起的序列构 成，其中一个序列为目标产物，另一个序列促进目标产物组装成稳定的纳米结构，因为后一 个序列从能促进目标产物融合到脂质膜上的序列中选择或从能促进目标产物基于双亲性 螺旋构象相互作用自组装成蛋白颗粒的序列中选择。
2. 根据权利要求1所述的制剂，其中促进目标产物融合到脂质膜上的序列为脂滴靶向 序列。
3. 根据权利要求2所述的制剂，其中脂滴靶向序列从以下选择：围脂滴蛋白家族中的 蛋白，包括脂肪分化相关蛋白、TIP47、OXPAT/MLDP、S3-12、围脂滴蛋白、LSD1、LSD2、ADRP、 MPL1或其同源性超过42 %的同源物；人小窝蛋白-2或其同源性超过80 %的同源物；AUP1 蛋白家族的蛋白或其同源性超过80%的同源物；序列识别号：1、序列识别号：2、序列识别 号：3和序列识别号：4的氨基酸序列中任一序列或其同源物。
4. 根据权利要求1所述的制剂，其中促进目标产物组装成蛋白颗粒的序列为多聚脯氨 酸序列。
5. 根据权利要求4所述的制剂，其中多聚脯氨酸序列为序列识别号：5的氨基酸序列。
6. 根据权利要求1所述的制剂，其中目标产物从能在动物或人体中诱导免疫反应抵抗 病原体的免疫原性肽或蛋白中选择。
7. 根据权利要求1所述的制剂，其中目标产物选自能引起对动物或人类疾病预防或治 疗作用的生物活性肽或糖肽。
8. 根据权利要求1至7所述的制剂的制备方法，包括：在允许权利要求1至7中任一 所述的融合肽的异源表达的条件下培养宿主细胞或宿主机体；收获所述宿主细胞或宿主机 体，或从宿主细胞培养基中或从所述机体的体内取样；若需要，制备澄清匀浆或粗提物；若 需要，提高匀浆或粗提物中所述异源肽的纯度水平；若需要，添加使最终制剂理化性质改性 的物质。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述制剂用昆虫细胞、昆虫幼虫或昆虫蛹制备。
10. 根据权利要求8所述的方法，其中异源肽的表达通过用重组杆状病毒感染宿主细 胞或机体实现。
11. 根据权利要求9或10所述的方法，其中融合肽仅仅包含目标产物。
12. 根据权利要求10或11所述的方法，其中宿主机体为以下其中一种物种的昆虫幼 虫：粉纹夜蛾、草地夜蛾、甜菜夜蛾、银纹夜蛾、疆夜蛾、大黄夜蛾、深褐黑夜蛾、四叉莜夜蛾、 鲁夜蛾、地老虎和黄地老虎。
13. -种在动物或人体中诱发免疫应答的方法，包括向动物或人施给根据权利要求8 至12中任一项所述制备的制剂。
14. 一种将药物活性剂输送到动物或人体内的方法，包括向动物或人施給根据权利要 求8至12中任一项所述制备的制剂。
15. -种通过密度分离技术或使用序列识别号：5定义的序列分离或浓缩本发明的产 物的方法。
【文档编号】A61K39/00GK104244970SQ201280071404
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2012年3月22日 优先权日:2012年3月22日
【发明者】维克多·因凡特, 荷塞·胡安·因凡特, 凯文·O·康纳, 大卫·康坦 申请人:生物有机研究与服务有限公司