调节免疫反应的组合物和方法

调节免疫反应的组合物和方法【专利摘要】本发明涉及刺激MHCI介导的免疫反应的组合物和方法，其包含在树突状细胞中刺激MHCI内溶酶体交叉呈递。刺激MHCI内溶酶体交叉呈递可包含在树突状细胞中过度表达CD74和/或将抗原靶向所述MHCI内溶酶体交叉呈递路径。还提供了包含抗原或其片段和CD74内溶酶体靶向序列的融合蛋白质。【专利说明】调节免疫反应的组合物和方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及免疫调节领域，具体地说，涉及调节MHCI介导的免疫反应的组合物和方法。【
背景技术：
】[0002]在初次免疫反应期间，树突状细胞为启动适应性免疫反应的主要抗原呈递细胞(APC)。树突状细胞吸收含有抗原蛋白质的死细胞和细胞残渣并加工这些外源衍生的抗原以用于呈递在MHCI上。这一过程称为MHCI交叉呈递。这一过程为对抗病毒、肿瘤、自抗原和同种异体移植物的CD8+T细胞介导的反应所必需。[0003]CD74是树突状细胞内部工作的细胞机构的重要部分用于调节哺乳动物初次免疫反应。树突状细胞具有能够使其感应并接着响应外来威胁的专用途径。到目前为止，尚无人能够拼凑出使主要组织相容性I类(MHCI)能够发现并‘碰撞’外来侵入物引起免疫系统对病原体的必要呈递和识别的线路。【
发明内容】[0004]本发明的一个目标是提供调节免疫反应的组合物和方法。根据本发明的一个方面，提供了一种刺激MHCI介导的免疫反应的方法，其包含在树突状细胞中刺激MHCI内溶酶体交叉呈递。刺激MHCI内溶酶体交叉呈递可包含在树突状细胞中过度表达⑶74和/或将抗原靶向MHCI内溶酶体交叉呈递路径。[0005]根据本发明的另一方面，提供了一种融合蛋白质，其包含抗原或其片段和CD74内溶酶体靶向序列。还提供了表达所述融合蛋白质的核酸分子、载体和细胞。[0006]根据本发明的另一方面，提供了一种隔室，其用于⑶74依赖性MHCI交叉呈递路径。这种隔室可能是内溶酶体。[0007]根据本发明的另一方面，提供了一种组织蛋白酶裂解肽和所述肽的多联体，其用于刺激初次免疫反应。【专利附图】【附图说明】[0008]图1.CC174+小鼠产生较弱的抗病毒初次免疫反应。(a)在经低效价VSV(感染50%组织培养细胞单层或小鼠的2X15剂量)感染后6天分离的Cd74+/+、Cd74^和Tapl+小鼠的脾脏中产生VSVNP(52-59)特异性(H_2Kb_VSVNP)CD8+T细胞，接着用VSVNP(52-59)刺激5天。象限中的数字指示每次通过的细胞百分比。(b)在如a中获得的细胞中H-2Kb-VSVNP(52-59)特异性CD8+T细胞频率(η=3种小鼠/基因型)。(c)在如a中VSV感染和体外加强之后产生的CTL的标准51Cr释放分析。*P〈0.05(史都登氏t检验)。数据代表至少3次单独实验(平均值土s.d.)。[0009]图2.CC174+小鼠在诱发初次免疫反应方面的缺陷在于其抗原呈递细胞且与CD4+T细胞无关。(a)从用VSV(感染50%组织培养细胞单层或小鼠的IX15剂量)注射且在体外用VSVNP(52-59)加强的嵌合体(η=3)获得的脾脏中产生VSVNP(52-59)特异性CD8+细胞。(b)在如a中体外加强之后产生的CTL的细胞毒性分析。目标细胞在指示时经VSVNP(52-59)脉冲处理或保持未标记作为非特异性杀伤的对照。(c)在如a中VSV感染和体外加强之后通过静脉内注射抗⑶4(+Ab)耗尽⑶4+细胞的Cd74+/+—Cd74^和CC174+—Cd74+/+嵌合体(η=3)的脾脏中产生对H_2Kb_VSVNP(52-59)具有特异性的CD8+T细胞。(d)在如c中体外加强之后产生的CTL的如b中的细胞毒性分析。*P〈0.05(史都登氏t检验)。数据代表3次实验(a)、至少3次实验(b)、2次实验(c)或3次实验(d;平均值和s.d.)ο[0010]图3.CC174+DC不能体内交叉呈递细胞相关的抗原来激活抗原特异性⑶8+T细胞。(a)方案:将经OVA蛋白或OVA(257-264)脉冲处理的0(174+或Cd74+/+BMDC与纯化的CFSE标记的⑶8+0T-1T细胞一起注射到BALB/c背景的Ragl+小鼠中(左侧);3天后，评估H-2KbCD8+T细胞的增殖(勾画的区域，右侧)。(b)来自a中接受体小鼠(η=3)的脾脏的增殖中的(黑色)和非增殖中的(灰色)OT-1T细胞。加括号线上方的数字指示CFSE_(分裂)细胞百分比。数据代表2次实验。[0011]图4.交叉呈递和交叉激活在CC174+DC中是有缺陷的。(a)在37°C(深灰色阴影曲线)或4°C(浅灰色线)下与OVA—起孵育后通过流式细胞术评估BMDC对OVA-AlexaFluor488的摄取。(b)通过流式细胞术所测量，在与(+0VA)或不与(-0VA)可溶性OVA—起孵育的情况下脾脏DC上H-2Kb-0VA(257-264)复合体的形成以及背景(灰色线；底部)上方的总H-2Kb(阴影曲线)。(c)通过流式细胞术所评估，与单独培养基(-0VA)、单独OVA(+0VA)或OVA和干扰素-Y(0VA+IFN-Y)一起孵育的BMDC上CD80和CD40的表达。(d)通过化学发光分析所测量，在细胞信号传导分子单独GM-CSF(顶部)或GM-CSF外加TNF(中部)或干扰素-Y(底部)存在下与各种浓度的可溶性OVA(横轴)一起孵育的脾脏衍生的DC对B3ZT细胞的活化。(e)如光学合并的图像所呈现，在有(底部)或没有(顶部)TNF情况下与OVA—起孵育、接着与H-2Kb-0VA(257-264)抗体(红色)和抗LAMP-1(绿色)一起共染色的成熟、脾脏衍生的DC的ICM。比例尺，5μm。(f)如归一化的个别像素相对于总像素所呈现，在TNF(顶部)存在下H-2Kb-0VA(257-264)与LAMP-Γ晚期内体的共定位的定量分析以及在有和没有TNF处理(底部)情况下0(174+^0(174+和Tapl+DC(>20个/品系)的荧光。*P〈0.05(史都登氏t检验)。数据代表2次(a-f)实验(误差线(f)，s.d.)或是来自代表具有类似结果的3次单独实验的I次实验(d式三份样品的平均值土s.d.)。[0012]图5.通过用氯奎处理来抑制DC中MHCI类的⑶74介导的运输。(a)通过流式细胞术所测量，保持未经处理(-CQ)或用氯奎处理(+CQ)且与单独培养基(蓝色)或可溶性OVA(红色；顶部)或OVA肽(红色；底部)一起孵育的BMDC上的H_2Kb-0VA(257-264)复合体的形成。(b)保持未经处理或与氯奎一起处理的BMDC上的总H-2Kb(绿色)；蓝色，背景。(c)如a中处理的BMDC上的表面H-2Kb-0VA(257-264)复合体，如归一化的平均荧光强度(MFI)所呈现，其中100%是在未经处理的BMDC上发现的H-2Kb-0VA(257-264)复合体的量。(d)如光学合并的图像所呈现，保持未经处理的或用氯奎处理、接着与抗H-2Kb(红色)和抗⑶74(绿色)一起共染色的成熟BMDC的ICM。比例尺，5μm。(e)如归一化的像素相对于总像素所呈现，d中的H-2Kb与⑶74的共定位的定量。(f)由经全长(+FL)⑶74或缺乏内溶酶体运输基元(+Λ2-17)的截短型⑶74重组且与可溶性OVA蛋白或OVA(257-264)一起孵育的CC174+BMDC诱导的CFSE标记的OT-1细胞的增殖。勾画出的区域中的数字指示相对于设定为100%的Cd74+/+对照(最左侧)的增殖中的OT-1细胞(⑶8+CFSE_)百分比。数据代表2次实验(误差线(c、e)，s.d.)。[0013]图6.⑶74控制DC中MHCI类的ER到内溶酶体运输。(a)用抗H_2Kb(绿色)夕卜加抗⑶74(红色；顶部)或抗LAMP-1(红色；底部)染色的成熟脾脏DC的ICM。比例尺，5μm。(b)如个别像素/总像素所呈现，LAMP-1+隔室(50个DC/小鼠品系)中MHCI类的定量。(c)使用抗1-A-1-E(1-Ab;左侧泳道)、抗⑶74(中间泳道)或抗H_2Kb(右侧泳道)的[35S]蛋氨酸标记的Cd74+/+、CC174+、Tapl+和β2-微球蛋白缺陷型￠2111+)BMDC的免疫沉淀(IP)。箭头指示41kDa(顶部)和31kDa(底部)CD74条带。(d)来自使用抗I_Ab、抗H-2Kb(构象依赖性)、H-2Kb细胞质域的抗体(e-VIII;构象非依赖性)或转铁蛋白受体(TFR)的抗体的Cd74+/+DC的溶解产物的蛋白的免疫沉淀，随后使用抗CD74进行免疫印迹分析。最右侧(WCL)，全细胞溶解产物(对照)的免疫印迹分析。(e)来自使用抗CD74的DC的溶解产物的蛋白的免疫沉淀，随后不消化(_)或使用EndoH(+)消化并使用抗MHCI类进行免疫印迹分析。(f)来自保持未经处理或用氯奎或EndoH处理的细胞的溶解产物的蛋白的免疫沉淀(使用抗MHCI类)，随后使用抗CD74进行免疫印迹分析。条带强度使用Odyssey软件定量。泳道下方的数字指示归一化到未经CQ处理的样品的条带强度。(g)通过流式细胞术随时间推移所评估和如与对照DC在4°C下比较在37°C下孵育的DC的平均荧光强度的降低百分比所呈现，经抗H-2Kb标记的DC中的MHCI类的内化。*P〈0.05(史都登氏t检验)。数据代表2次实验(a)、2次实验(b;平均值土s.d.)、5次实验(c)、3次实验(d)、3次实验(e)、2次实验(e)或2次实验(f;误差线，s.d.)。[0014]图7.嵌合小鼠的外周分析。[0015]图8.CC174+小鼠不能体内交叉呈递细胞相关的抗原来产生有效的初次免疫反应。[0016]图9.Cd74^DC定位于脾脏。【具体实施方式】[0017]本发明是基于以下发现:由⑶74起到的将MHCI受体连接于免疫细胞内含有入侵病原体的隔室的引导作用。这种复杂的线路允许免疫细胞识别身体中的病原体并发出病原体存在于身体中的信号，并且警告专门的T免疫战士细胞，所述细胞通过以下方式响应:分裂，并攻击感染的细胞，由此破坏病原体。具体来说，本发明是基于以下发现:CD74介导MHCI从树突状细胞的内质网运输到内溶酶体隔室以用于装载外源性肽，且因此⑶74在内溶酶体树突状细胞交叉呈递以用于激活MHCI介导的CTL反应方面具有关键功能。因此，本发明提供了调节MHCI介导的免疫反应的方法。[0018]在某些实施例中，提供了调节⑶74依赖性MHCI内溶酶体树突状细胞交叉呈递的化合物和方法。在某些实施例中，提供了一种刺激免疫反应(如MHCI介导的CTL反应)的方法，其通过增强⑶74依赖性MHCI树突状细胞交叉呈递进行。⑶74依赖性MHCI交叉呈递路径可通过例如增加树突状细胞中CD74的表达来增强。因此，在某些实施例中，提供了增强CD74表达的化合物和方法。[0019]表达载体可用于在细胞中表达本发明的CD74蛋白。所属领域的技术人员将清楚可用于构筑表达载体的适当表达载体。所属领域的技术人员还将清楚所述载体可直接投与个体。或者，来自个体的细胞可离体经编码本发明多肽的聚核苷酸(DNA或RNA)工程改造，且经工程改造的细胞接着被提供给个体。所述方法在此项技术中是熟知。[0020]另外，鼠CD74的氨基酸序列为此项技术中已知(参见，例如NCBI蛋白质数据库登录号P04441.3)且阐述于下文中:[0021]lmddqrdlisnheqlpilgnrprepercsrgalytgvsvlvalllagqattayflyqqqgr[0022]611dkltitsqnlqleslrmklpksakpvsqmrmatpllmrpmsmdnmllgpvknvtkygnm[0023]121tqdhvmhlltrsgpleypqlkgtfpenlkhlknsmdgvnwkifeswmkqwllfemsknsl[0024]181eekkpteappkvltkcqeevshipavypgafrpkcdengnylplqchgstgycwcvfpng[0025]241tevphtksrgrhncsepldmedlssglgvtrqelgqvtl[0026]人CD74的各种同工型的氨基酸序列也是此项技术中已知的(参见，例如基因库登录号AAH18726.1；AAH24272.1；EAW61729.1；EAW61730.1和EAW61731.1)。[0027]因此，在本发明的某些实施例中，提供了表达CD74的聚核苷酸和表达载体以及使用所述聚核苷酸和表达载体来表达CD74或其活性片段的方法。在某些实施例中，本发明的聚核苷酸和表达载体在体内用于基因工程细胞，包括(但不限于)树突状细胞。在某些其它实施例中，本发明的聚核苷酸和表达载体离体用于基因工程细胞，包括(但不限于)树突状细胞，且这些经基因工程改造的细胞可接着投与个体。因此，在某些实施例中，提供了已经基因工程改造以过度表达CD74的树突状细胞。聚核苷酸、表达载体和细胞可与医药学上可接受的稀释剂或载剂一起作为医药组合物投与。[0028]如上所述，有证据表明，内溶酶体是用于在树突状细胞中交叉呈递的主要隔室。在本发明的某些实施例中，提供了树突状细胞的内溶酶体。在某些实施例中，提供了用于呈递到在树突状细胞的内溶酶体隔室中产生的MHCI的肽。这些肽可为从抗原和其片段加工、特异性靶向树突状细胞的内溶酶体的肽。[0029]使抗原和其片段靶向树突状细胞的内溶酶体隔室可增强MHCI抗原的激活。因此，在本发明的某些实施例中，提供了使包括抗原和其片段的分子靶向树突状细胞的内溶酶体的化合物和方法。举例来说，CD74的内体靶向信号可用于将抗原或其片段投送到树突状细胞中的MHCI抗原加工路径。在本发明的某些实施例中，提供了融合蛋白质，其包含所关注的抗原或其片段和CD74内体靶向信号。在某些实施例中，靶向信号包含NCBI蛋白质数据库登录号P04441中阐述的序列的氨基酸2到17(序列:ddqrdlisnheqlpil)。[0030]本发明还提供了表达所述融合蛋白质的聚核苷酸、表达载体和细胞(包括树突状细胞)。如上所述，所属领域的技术人员将清楚适当表达载体。表达所述融合蛋白质的聚核苷酸和表达载体可在体内用于基因工程细胞(包括(但不限于)树突状细胞)，或可离体用于基因工程细胞(包括(但不限于)树突状细胞)且这些经基因工程改造的细胞可接着投与患者。融合蛋白质、聚核苷酸、表达载体和细胞可与医药学上可接受的稀释剂或载剂一起作为医药组合物投与。[0031]MHCI交叉呈递的增强可引起免疫反应的增强。具体来说，⑶74依赖性MHCI内溶酶体树突状细胞交叉呈递的增强可引起对MHCI介导的CTL反应的刺激。因此，在本发明的某些实施例中，提供了一种通过增强MHCI内溶酶体交叉呈递来刺激MHCI介导的CTL反应的方法。如上所述，MHCI交叉呈递的增强可经由在树突状细胞中过度表达⑶74和/或将抗原或其片段靶向MHCI抗原加工路径进行。这些方法可与其它免疫刺激方法(如投与免疫刺激化合物，包括(但不限于)细胞因子)组合以进一步刺激免疫反应。所属领域的技术人员将清楚适于与本发明的化合物和方法一起使用的其它免疫刺激方法和化合物。[0032]所属领域的技术人员将易于了解，刺激CTL反应可适用于预防和/或治疗许多疾病和/或病状。举例来说，刺激CTL反应可适用于预防和/或治疗由细胞内病原体(包括(但不限于)细菌、疟原虫和病毒)引起的疾病和/或治疗癌症。因此，在本发明的某些实施例中，提供了预防和/或治疗由细胞内病原体引起的疾病的方法，其通过刺激MHCI交叉呈递路径进行。在其它实施例中，提供了治疗癌症的方法，其通过刺激MHCI交叉呈递路径进行。[0033]在某些实施例中，提供了预防和/或治疗病毒性感染(包括(但不限于)HIV感染)的方法。在某些实施例中，提供了预防和/或治疗细菌感染(如分枝杆菌感染，包括(但不限于)结核分枝杆菌(M.tuberculosis)感染)的方法。在某些实施例中，提供了预防和/或治疗疟原虫感染(包括(但不限于)预防和/或治疗疟疾)的方法。[0034]增强MHCI抗原的激活的化合物和方法可适用于改进疫苗的免疫原性和功效。因此，本发明的化合物可用作佐剂和/或疫苗。举例来说，表达⑶74的聚核苷酸、表达载体和/或树突状细胞可用于刺激免疫反应。另外，靶向MHCI交叉呈递路径的融合蛋白质(和表达所述融合蛋白质的聚核苷酸和/或表达载体)可用于疫苗。因此，在某些实施例中，提供了靶向MHCI交叉呈递路径的疫苗。[0035]在某些实施例中，提供了用于刺激疫苗中初次免疫反应的组织蛋白酶裂解肽和这些肽的多联体。在某些实施例中，组织蛋白酶为组织蛋白酶S。[0036]在某些实施例中，提供了用于改进疫苗性能的化合物和方法。在某些实施例中，提供了用于改进癌症疫苗性能的化合物和方法。在某些实施例中，提供了用于改进对抗病毒(包括(但不限于)HIV)的疫苗的性能的化合物和方法。在某些实施例中，提供了用于改进对抗细菌(如分支杆菌，包括(但不限于)结核分枝杆菌)的疫苗的性能的化合物和方法。在某些实施例中，提供了用于改进对抗疟原虫(包括(但不限于)恶性疟原虫(PlasmodiumfaIciparum))的疫苗的性能的化合物和方法。[0037]对CD74作用的理解也可开始阐明在未来会冲击个人化医学选择的个体之间的免疫反应差异。因此，在某些实施例中，提供了基于个体的⑶74依赖性MHCI交叉呈递路径开发个人化疫苗途径的方法。[0038]MHCI交叉呈递的抑制可引起对免疫反应的抑制。举例来说，⑶74表达的缺陷可引起MHCI交叉呈递减少，所述减少又可减少MHCI介导的免疫反应，包括MHCI介导的CTL反应。因此，在本发明的某些实施例中，提供了抑制MHCI交叉呈递且由此抑制MHCI介导的免疫反应的方法，其通过在树突状细胞中抑制CD74的表达和/或活性进行。所述方法可适用于治疗自体免疫疾病和/或预防/抑制移植物排斥。抑制CD74的表达和/或活性的化合物可包括例如反义化合物和/或中和抗体。[0039]已表明MHCI信号传导可影响Toll样受体(TLR)先天性炎症反应。具体来说，已发现组成性表达的膜MHCI减弱TLR触发的先天性炎症反应。(自然免疫学(NatureImmunology)13:551-559)。因此，在本发明的某些实施例中，提供了通过改变MHCI信号传导来改变先天性免疫反应的方法。[0040]可在体内动物模型中测试本发明的化合物对免疫反应的影响。举例来说，可在体内通过重组RAG-/-免疫缺陷小鼠中的抗原呈递细胞和T细胞来评估免疫反应。因此,在本发明的某些实施例中，提供了在RAG-/-免疫缺陷小鼠中筛选免疫调节剂和/或佐剂的方法，其包含用树突状细胞和⑶8+T细胞重组小鼠且分析小鼠中的免疫反应。候选免疫调节剂可直接投与重组后的小鼠和/或树突状细胞和/或T细胞(随后注射到RAG-/-小鼠中)。[0041]⑶74缺陷小鼠和/或树突状细胞也可用于开发靶向MHCI交叉呈递路径的疫苗。举例来说，所述小鼠和细胞可适用于鉴别由MHCI交叉呈递的肽，且因此可适用于刺激初次免疫反应。为了获得对本文中所述的本发明的更好了解，阐述以下实例。应了解，这些实例打算描述本发明的说明性实施例且并不打算以任何方式限制本发明的范围。[0042]实例:⑶74依赖性MHCI类内溶酶体交叉呈递路径.[0043]免疫反应由交叉呈递外源性抗原的树突状细胞(DC)启动并激活。伴侣分子CD74(不变链)被认为在主要组织相容性复合体(MHC)II类的情形下专门促进DC激活。然而，此处展示了DC中的CD74依赖性MHCI类交叉呈递路径，其在对病毒蛋白质相关抗原和细胞相关抗原产生MHCI类限制性、溶细胞性T淋巴细胞(CTL)反应方面具有重要的作用。⑶74与DC的内质网中的MHCI类缔合且介导MHCI类向内溶酶体隔室运输以用于装载外源性肽。推断出，CD74在用于激活MHCI类介导的CTL反应的内溶酶体DC交叉呈递中具有先前未被发现的生理功能。[0044]在初次免疫反应期间，树突状细胞(DC)为主要的抗原呈递细胞，其主要经由交叉呈递并交叉激活T细胞来启动适应性免疫反应。这涉及细胞外抗原摄取、细胞相关的抗原片段的消化和主要组织相容性复合体(MHC)I类和MHCII类分子上蛋白水解肽产物的呈递1O对于MHCI类，已描述了两种可阐明这一过程如何发生的主要路径:有说服力地展示在体外起作用的胞质路径2_5和展示在体内对某些抗原具有主要作用的液泡路径6Λ交叉呈递的‘吞噬-ER’(内质网介导的吞噬作用)模型已被视为主要交叉呈递路径9。随后的数据质疑所述结论'促成这一争论的一个因素似乎是对数据的过度诠释，所述数据将细胞内蛋白质指定为确定的特定细胞器标记，其常常并非唯一的而是仅仅在动态细胞器生物发生和分配期间经历富集。另外，可从不同形式外源性抗原的研究和在长期DC细胞株的研究相对于刚分离的DC的研究中推断出不同结论。[0045]在液泡路径中，组织蛋白酶S已被鉴别为会产生装载在易于接受肽的MHCI类分子上的抗原肽的蛋白酶n。另外，膜和胞质SNARE蛋白质(其在细胞内膜融合期间控制供体和接受体的系栓和对接事件)似乎也在交叉呈递事件中具有基础性作用12。然而，交叉激活隔室中MHCI类的来源、其转运机制和肽装载部位仍然是活性研究领域8，13。[0046]已展示了再循环MHCI类进入内体的自发性内化14’15。已公开的结果支持其中MHCI类从质膜再循环到内溶酶体装载隔室的模型通过识别可见于MHCI类细胞质尾域的酪氨酸内化信号来促进8’13。因此，从质膜再循环的MHCI类分子是用于装载注定参与交叉呈递的外源性抗原的MHCI类的一个来源8，13。同样地，也已提出MHCI类从内质网(ER)转运到内吞隔室。这可通过涉及吞噬体和ER的融合的机制发生9。替代性和潜在补充假设是伴侣分子⑶74(不变链)(已知与ER中的MHCII类缔合，由此防止肽的过早结合且通过分选CD74细胞质尾域中存在的信号来介导向内吞路径的运输U6)可结合MHCI类且将MHCI类的一部分传递到液泡-内吞隔室以在交叉呈递中起作用17’18。这一机制将巧合地将易于接受肽的MHCI类与外源性抗原和MHCII类分子置放于相同隔室(或相似隔室)19，MIIC隔室，促进抗原肽装载并结合到MHCI类分子上。这一路径将MHCI类转运与液泡路径关联，因为⑶74未必将参与MHCI类外源性呈递的胞质投送2°’21。[0047]已在人细胞株中展示了MHCI类与⑶74的相互作用和其在同一隔室中巧合的定位17_19。尽管基于较旧的范例推断出，MHCI类-⑶74相互作用可能并不控制MHCI类在生理条件下转运到内体的命运22，但其它对比研究已展示经转染以表达⑶74的细胞具有由不同等位基因编码的MHCI类的远为更高的表面表达，这表明MHCI类-⑶74可能具有功能重要性23。此处研究了MHCI类与⑶74体内相互作用的免疫学相关性，且描述了⑶74在通过DC交叉呈递外源性抗原和后续交叉激活中的明确并关键的作用。[0048]结果[0049]⑶74为初次抗病毒反应所需[0050]DC可被直接感染且可因此使用通过MHCI类的经典呈递来活化未处理⑶8+T细胞。然而，在经病毒以低效价感染期间，DC的直接感染较不可能，且DC交叉呈递是造成⑶8+T细胞反应产生的占主导地位的路径8’24。为了解决⑶74在交叉呈递以产生初次抗病毒免疫反应中的作用，用低剂量水泡性口炎病毒(VSV)感染野生型(Cd74+/+)小鼠和CD74缺乏￠(174+)小鼠。我们类似地感染缺乏转运蛋白TAP的小鼠(Tapl+小鼠)作为阴性对照，所述小鼠的MHCI类的装配和细胞内转运受损，且由此因不当胸腺选择而缺乏CD8+T细胞25(图1和图7a)。在这个感染中，对VSV的初次和记忆⑶8+T细胞反应可在不存在⑶4+T细胞的情况下产生26’27。以这种方式，CD74在交叉呈递中的作用可在不考虑其在CD4+T细胞反应中的作用的情况下评估。评估在VSV感染之后响应于MHCI类(H-2Kb)上呈递的免疫显性表位VSV核蛋白氨基酸52-59(VSVNP(52-59))产生的⑶8+T细胞的频率。0(174+小鼠与Cd74+/+小鼠相比产生抗原特异性⑶8+T细胞的能力显著较低(5.0%对19.0%;图la、b)。这引起细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤能力较小的免疫反应(图1c)。[0051]构筑骨髓嵌合体以进一步排除T细胞在VSV感染模型中帮助交叉激活的作用的可能性26’27。另外，嵌合体用于证实在产生免疫反应方面的缺陷是否取决于造血细胞衍生的DC交叉呈递抗原并激活T细胞的能力。为此，具有Cd74+/+骨髓(Cd74+/+—Cd74+/+)或CC174+骨髓(CC174+—Cd74+/+)的Cd74+/+小鼠和重组的CC174+小鼠用Cd74+/+骨髓(Cd74+/+—Cd74+)或Cd74+骨髓(Cd74+—Cd74+)重组。在Cd74+/+—Cd74+/+和0(174+—Cd74+/+小鼠的外周中已发现正常量的⑶8+T细胞和⑶4+T细胞。然而，在CC174+—CC174+和Cd74+/+—Cd74v_小鼠中发现较少的CD4+T细胞和稍微较多的CD8+T细胞(图7b、c)。这指示了在接受体CC174+小鼠中的阳性选择因CC174+胸腺上皮细胞中MHCII类的较低丰度而受损。[0052]为了检查抗病毒反应，嵌合小鼠用低效价VSV感染且通过四聚体分析和CTL杀伤性分析评估VSVNP(52-59)特异性CD8+T细胞产生(图2)。CD4+T细胞数目低的Cd74+/+—Cd74+小鼠能够与野生型Cd74+/+—Cd74+/+嵌合体类似地产生VSVNP(52-59)特异性⑶8+T细胞(1.1%对1.2%;图2a)，这引起具有类似杀伤能力的免疫反应(16.8%对1.9%;图2b)。然而，CC174+—Cd74+/+小鼠尽管具有正常CD4+T细胞，但在产生VSVNP(52-59)特异性⑶8+T细胞方面极度受损(0.2%;图2a)，这引起较低的CTL杀伤反应(18.0%对4.5%;图2b)。这表明VSV特异性CTL反应的产生与⑶4+T细胞数目无关。值得注意的是，需要表达⑶74的骨髓衍生的抗原呈递细胞且其允许CC174+小鼠产生与Cd74+/+小鼠的抗病毒免疫反应类似的稳固的抗病毒免疫反应。[0053]⑶4+细胞的耗尽对抗VSV反应没有影响[0054]接着，排除了以下可能性:由CC174+小鼠中功能失常的阳性选择产生的Cd74+/+—Cd74^嵌合体中的剩余CD4+T细胞促进其抗病毒免疫反应的效率。在感染过程期间，Cd74+/+—Cd74^嵌合体通过对其注射CD4的GKl.5抗体(抗CD4)而耗尽CD4+细胞。尽管⑶4+细胞相对于背景几乎是完全不可检测的，但耗尽⑶4+细胞的Cd74+/+—Cd74v-嵌合体与0(174+—Cd74+/+嵌合体相比产生显著较多的对VSVNP(52-59)具有特异性的CD8+T细胞(13.5%对4.1%;图2c)，这引起溶解活性较大的免疫反应(14.0%对4.9%;图2(1)。这些数据合起来证实Cd74+/+—CC174+与CC174+—Cd74+/+嵌合体相比展出更强的抗VSV反应。这不依赖于⑶4+T细胞，而是代之以归因于CC174+小鼠经充分能够激活抗病毒⑶8+T细胞反应的野生型DC的重建。[0055]细胞相关的抗原的交叉激活是⑶74依赖性的[0056]为了研究CD74在对细胞相关的抗原的初次免疫反应中的作用，使用经卵白蛋白(OVA)脉冲处理的经致死性辐射的DC或经OVA脉冲处理的具有与宿主不匹配的MHCI类的DC作为细胞相关的抗原的来源以活化Cd74+/+小鼠、耗尽CD4+细胞的Cd74+/+小鼠和CC174+小鼠以及重组的小鼠嵌合体中的CTL。用细胞相关的OVA攻击的具有野生型免疫系统的小鼠能够诱导源自于OT-1转基因小鼠的CD8+T细胞的增殖(图8)或活化会有效杀伤OVA氨基酸257-264(0VA(257-264)脉冲处理的目标细胞的内源性CTL(数据未示出)。然而，在细胞相关的OVA的相同攻击的情况下，造血系统缺乏CD74的小鼠更不能刺激OT-1CD8+T细胞的增殖且产生会促成较低杀伤能力的较少内源性CTL(图8和数据未示出)。[0057]⑶74依赖性交叉激活不依赖于⑶4+T细胞[0058]为了特别集中于DC交叉激活缺陷并排除外来因素(包括对CD4+T细胞辅助的需求)的促成作用，将CC174+和Cd74+/+DC与OVA蛋白或OVA(257-264)肽一起孵育，并将那些细胞与经细胞溶质染料CFSE标记的纯化的OT-1⑶8+T细胞一起注射到BALB/c背景的T细胞缺乏的重组-活化基因I缺乏(Ragl+)小鼠中。评估DC交叉激活OT-1T细胞的能力(图3a)。当与OVA蛋白一起孵育时，CC174+DC与Cd74+/+DC相比诱导远为更少的OT-1增殖(18%对48%;图3b)。然而，当DC经OVA(257-264)肽脉冲处理时，作为直接呈递的阳性对照，Cd74^DC在活化CD8+0T-1T细胞方面与Cd74+/+DC—样有能力(59.5%对60.0%;图3b)。[0059]为了解决⑶74在DC从注射部位到脾脏的运动性和归巢28方面的可能的混淆作用，评估在静脉注射之后CFSE标记的DC的定位29(图3b和图9)。静脉内注射到Ragl+小鼠中的Cd74+/+和CC174+DC等同地定位于脾脏。因此，CC174+DC诱导T细胞增殖的能力较低并不归因于DC迁移的差异，而是归因于加工和呈递抗原的能力较小。推断出CD74在通过MHCI类交叉呈递细胞相关的抗原方面和在体内CD8+T细胞激活方面具有关键作用，且这与⑶4+T细胞辅助或⑶74介导的DC运动性无关。[0060]⑶74缺乏的DC具有受损的交叉激活能力[0061]评估来自各种小鼠品系的脾脏衍生的DC体外交叉呈递H_2Kb限制性卵白蛋白表位OVA(257-264)的能力。DC在有或者没有细胞因子的情况下与可溶性OVA—起孵育，并且或者用对H-2Kb-0VA(257-264)复合体具有特异性的抗体对细胞进行染色，或者将细胞与B3Z(—种T细胞杂交瘤，其在识别H-2Kb与OVA(257-264)缔合之后被活化)一起培养3°。Cd74+/+和CC174+DC具有类似的内化OVA的能力且具有类似的MHCI类的总表面表达(图4a、b)。然而，在与OVA—起孵育之后，CC174+DC与Cd74+/+DC相比具有低得多的H-2Kb-0VA(257-264)复合体丰度(图4b)。已显示DC的交叉激活能力通过诱导共刺激和MHC分子上调且减少内吞作用的炎性介体增强31’32。这产生较大的对T细胞激活的能力，但减小DC捕获并呈递可溶性抗原的能力。为了在涉及共刺激的类似体内条件的情况下评估T细胞活化，将OVA脉冲处理的DC在有和没有细胞因子的情况下与B3ZT细胞一起孵育。在肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素-Y存在下，Cd74+/+和CC174+DC具有等同的上调共刺激分子CD80、CD86和CD40的能力(图4c和数据未示出)，但Cd74+DC与Cd74+/+DC相比活化B3ZT细胞的能力远为较小(图4d)。正如所料，细胞在细胞因子存在下与源自于Tapl+小鼠的OVA脉冲处理的DC—起孵育后，未检测到T细胞活化。这些数据支持⑶74在T细胞交叉激活中具有作用且并不影响共刺激分子的表达的结论。[0062]⑶74介导内溶酶体MHCI类装载[0063]为了更好地在分子层面了解交叉呈递和激活缺陷的机制，使用比较性免疫荧光共聚焦显微术(ICM)来评估在有和没有TNF的情况下Cd74+/+和CC174+DC中OVA(257-264)装载的MHCI类的细胞内定位、运输和分布。细胞与OVA蛋白一起孵育，且用H-2Kb-0VA(257-264)的抗体和晚期内体标记LAMP-1的抗体细胞内染色细胞。当未将TNF加入培养物时，与LAMP-1的共定位在针对H-2Kb-0VA(257-264)复合体染色的许多Cd74+/+脾脏DC中是可检测的(图4e、f)。在Cd74+和Tap1+DC中鉴别出一些H_2Kb-0VA(257-264)复合体；然而，与晚期内体的共定位是最少的(图4e、f)japl+DC中不存在装载的MHCI类与TAP在交叉呈递中的作用(一种之前已假定的机制)一致24’33。在用TNF处理之后，Cd74+/+DC具有显著较多的H-2Kb-0VA(257-264)复合体与LAMP-1(图4e、f)而非与ER标记GRP78或高尔基体标记giantin(数据未示出)的共定位。相比之下,在CC174+DC中的晚期内体隔室中观察到很少的H-2Kb-0VA(257-264)复合体，这指示晚期内体中H_2Kb-0VA(257-264)复合体的形成较少(图4f)。ICM数据的比较指示了在存在TNF的情况下，源自于CC174+的DC与Cd74+/+DC相比具有显著较少的OVA(257-264)装载到晚期内体中的H_2Kb上(62%对32%;图4f)。这些数据表明在DC中，存在为交叉呈递外源性抗原所需的⑶74依赖性MHCI类抗原加工路径。[0064]CD74将MHCI类从ER引导到内溶酶体[0065]⑶74缺陷在晚期内体隔室中产生较少的H-2Kb_0VA(257-264)复合体的发现表明CD74将MHCI类从ER靶向内溶酶体路径。在那里，CD74据推测降解，且MHCI类装载外源性抗原肽。为了更详细地检查这一点，内体的酸化经由使用氯奎阻断，且评估⑶74介导的MHCI类交叉呈递路径。已发现，用氯奎处理的骨髓衍生的DC(BMDC)具有与未经处理的对照的MHCI类表面表达等同的MHCI类表面表达，且在经OVA(257-264)肽脉冲处理时展示H-2Kb-0VA(257-264);然而，在与可溶性OVA—起孵育时，经氯奎处理的DC与未经处理的DC相比具有少得多的表面H-2Kb-0VA(257-264)(图5a_c)。ICM分析展示BMDC在用氯奎处理之后具有更多的H-2Kb与⑶74的共定位(图5d、e)。这指示了用氯奎处理产生更多的内溶酶体MHCI类分子，其据推测通过以与针对MHCII类路径所报道34类似的方式阻断内溶酶体中MHCI类与⑶74的解离并通过抑制再循环MHCI类的降解进行。最后结果是MHCI类较少装载外源性抗原且随后表面H-2Kb-0VA(257-264)较少。为了证实⑶74将MHCI类引导到内溶酶体隔室的发现并明确地展示⑶74介导的MHCI类运输，⑶74缺乏的BMDC经全长⑶74或缺乏胞质运输域的⑶74的表达载体转染，且评估其呈递OVA蛋白或OVA(257-264)肽(将略过对加工的需求的阳性对照)的能力。CC174+DC的交叉激活能力受损且与Cd74+/+DC相比诱导少得多的OT-1T细胞增殖(图5f)。正如所料，交叉激活能力恢复η个经全长⑶74重组的CC174+DC，且DC能够以与野生型DC的能力类似的能力诱导OT-1T细胞增殖。然而，当我们将缺乏内体运输基元的⑶74再引入CC174+DC时，交叉激活能力继续受损(图5f)，这展示出在不存在CD74的情况下，引导到内溶酶体的MHCI类较少且OT-1T细胞的交叉激活较少。合起来，这些数据展示⑶74影响MHCI类运输到其中发生外源性抗原有效呈递的交叉激活隔室。[0066]⑶74和MHCI类分子在DC中形成复合体[0067]在分子层面研究作为将MHCI类靶向交叉激活隔室的先决条件的CD74与MHCI类在DC中的相互作用。将来源于Cd74+/+和CC174+小鼠脾脏的DC分离以用于通过ICM分析。DC用抗H-2Kb和抗CD74染色，且发现H_2Kb分子分布在细胞表面处和细胞质(其中其主要定位于泡样隔室)中。CD74分子与这些细胞内隔室显著共定位于Cd74+/+DC中(图6a)。然而，我们观察到H-2Kb与⑶74较少共定位于Tapl+DC中，这推测上归因于H_2Kb的限制性总体可利用性(图6a)。[0068]为了鉴别其中这些分子共定位的隔室，用抗H_2Kb和抗LAMP-1染色脾脏DC(以检测晚期内体)。相当大比例的晚期内体在Cd74+/+DC中含有H-2Kb(图6a)，这证实了实质性量的MHCI类分子存在于内吞隔室中8，21。相比之下，仅一小部分H-2Kb与晚期内体共定位于CC174+DC中(图6a)。这一结果由ICM图像的定量证实，这表明显著与在Cd74+/+DC中相t匕，在CC174+DC中显著更少的MHCI类分子靶向内溶酶体隔室(73%对47%;图6b)。共定位在Tapl+DC甚至更不明显中，可能归因于在不存在TAP的情况下H_2Kb分子对内溶酶体的靶向受损。这些数据表明实质性部分的MHCI类分子与CD74相互作用，促进其(可能从ER)转运到DC的内溶酶体隔室。[0069]DC中MHCI类与⑶74之间的直接分子相互作用的证实将进一步强化这是DC中迄今尚未描述的抗原呈递路径的论据。为了证实这一点，从各种基因敲除和野生型小鼠获得BMDC且用35S标记细胞，接着使共免疫沉淀的复合体结合到MHCI类(H_2Kb)、MHCII类(1-Ab)或CD74，且基于这些复合体中的蛋白质的表观分子量对其进行鉴别。MHCII类的抗体免疫沉淀Cd74+/+DC中CD74的丰富的41千道尔顿(kilodalton)(4IkDa)和31kDa同工型(图6c)。抗H-2Kb也沉淀那些相同的⑶74同工型(图6c)，这表明在任一时刻，⑶74与DC中总MHCI类分子池的一部分结合。用介于41kDa和31kDa之间的分子大小检测的两种重要蛋白质可能是MHCI类装载或转运复合体的组分。其大小与在MHCII类装载中充当伴侣分子的H-2DM或H-2D0的大小一致，但其身份尚未最终确定。⑶74的41kDa和31kDa形式在CC174+DC中不存在(图6c)，这指示其的确是已展示与MHCI类和MHCII类分子一起免疫沉淀的所报道的CD74同工型17_19’23。另外，在Tapl+DC中，41kDa和3IkDaCD74同工型与H-2Kb—起免疫沉淀(图6c)，这表明CD74与MHCI类的结合并不依赖于TAP的肽转运蛋白功能。最后，⑶74同工型与来自β2-微球蛋白缺陷型DC的MHCI类一起沉淀(图6c)，这表明⑶74能够结合缔合折叠β2-微球蛋白的MHCI类复合体和无β2-微球蛋白的MHCI类复合体。[0070]接着使用免疫印迹分析来证实与MHCI类分子结合的⑶74同工型的身份。使蛋白质经抗I_Ab、抗H-2Kb和由外显子8编码的MHCI类分子的区域的抗体以及与不相关的转铁蛋白受体的抗体免疫沉淀，随后用抗CD74进行免疫印迹分析(图6d)。正如所料，CD74与MHCII类(1-Ab)缔合，但不与不相关的蛋白质转铁蛋白受体缔合(图6d)。CD74被决定性地鉴别为与MHCI类缔合(图6d)，这证实这种相互作用在用于这一免疫沉淀程序的条件下是可检测并稳定的。[0071]MHCI类-⑶74复合体在前高尔基体隔室中形成[0072]接着，为了明确地展示MHCI类与⑶74之间相互作用的动力学和来源，使用生物化学手段来进一步推演其中发生这种相互作用的细胞内隔室。分泌路径中的蛋白质在其从ER运输穿过高尔基体隔室时获得对内切糖苷酶(EndoH)的抗性，且其在所述高尔基体隔室中经历甘露糖苷酶II裂解35。已被普遍接受的是，对EndoH的敏感性充当蛋白质定位于ER或者ER与顺面高尔基体之间的‘过渡元件’中的指示。来自Cd74+/+BMDC的⑶74结合的MHCI类经抗⑶74或抗MHCI类免疫沉淀，且用EndoH处理免疫沉淀物，接着用抗MHCI类或抗⑶74进行免疫印迹分析以将MHCI类-⑶74复合体对EndoH的敏感性可视化。我们发现，与⑶74缔合的MHCI类对EndoH敏感(图6e、f)。另外，在用氯奎处理之后，EndoH抗性CD74与MHCI类的缔合略微较多，如由较高条带强度所展示(图6f)。总体而言，这些数据表明，⑶74与MHCI类的相互作用起源于ER，其中⑶74结合MHCI类分子的‘不成熟’部分且自此处启动向内溶酶体隔室的运输，从而介导交叉呈递、T细胞激活和初次免疫反应8，13。[0073]⑶74不影响MHCI类的内化[0074]最后，为了确定结合⑶74的MHCI类的来源，我们研究了⑶74介导的MHCI类从质膜的运输的作用。为了确定⑶74是否在表面受体再循环中起作用，监测Cd74+/+和CC174+DC中的MHCI类内化。BMDC用抗H_2Kb染色且使用流式细胞术以监测随时间推移的内化。Cd74+/+和CC174+DC具有极其相似的MHCI类内化动力学(图6g)。这指示了⑶74并不与MHCI类在细胞表面处相互作用以引起内化到细胞内隔室中以实现交叉呈递。这种被致意的已公开研究展示出MHCI类分子的细胞质域中的基于酪氨酸的基元对于再循环MHCI类分子从质膜内化到内溶酶体交叉激活隔室中至关重要8，13且因此展示出⑶74依赖性MHCI类运输的独特和不同的路径。[0075]讨论[0076]外源性肽由MHCII类分子呈递相对于胞质肽由MHCI类分子展示的二分法已被修订6’8’36’37。MHCI类交叉呈递不仅展示出这种划分的模糊性而且展示出对于特定细胞类型(如DC)来说，这种现象在体内产生初次免疫反应中起到重要作用8。另外，MHCII类分子上内源性衍生的肽的呈递展示出MHCI类和II类路径可能交叉且其可能共用相同的抗原装载隔室38。尽管⑶74被经典公认为通过MHCII类呈递中的主要伴侣分子，但⑶74和MHCI类也已展示出互相作用17’18’39’4°。然而，⑶74对MHCI类介导的免疫反应的生理学贡献尚未被研究，且对MHCI类-⑶74相互作用的鉴别基本上被贬损为生物学好奇心。此处，已展示⑶74实质上有助于DC中的MHCI类交叉呈递路径。这些研究已鉴别出⑶74依赖性交叉激活在产生对病毒和细胞相关的抗原的反应中的重要作用。[0077]为了评估经由DC交叉呈递产生的⑶4+T细胞非依赖性CTL反应，使用以低剂量VSV感染的模型。低病毒剂量模拟其中大部分DC将推测上幸免于感染且其它感染的细胞将充当抗原肽供体的生理学情形，这允许直接或内源性呈递对交叉呈递的描述。缺乏⑶74的小鼠在其尤其对交叉激活可能相较于通过DC直接激活占主导地位的低病毒剂量产生MHCI类限制性CTL反应的能力方面显著受损的观察结果支持了以下结论:MHCI类交叉呈递是抗病毒⑶8+T细胞介导的免疫性在体内生理条件下产生的主要机制8’41。我们也证实了别人的工作且展示出对病毒(如VSV)的CTL反应是⑶4+T细胞非依赖性的26’27且因此不依赖于MHCII类-⑶74复合体的功能。[0078]骨髓嵌合体的产生使得研究野生型宿主背景的CC174+骨髓细胞衍生的DC的活性成为可能。那些研究得出结论，CD74的激活缺陷是属于DC来源且指示出所述缺陷是在DC交叉呈递层面下。另外，⑶74依赖性交叉激活被鉴别为重要的MHCI类抗原呈递路径，因为不存在CD74产生超过50%更少的抗VSVCTL0另外，通过小鼠嵌合体获得的发现支持了以下观察结果:CD74缺陷与较低丰度的CD4+T细胞无关地损害对VSV产生的初次免疫反应26，42。这是根据其它已公开的数据，展示出在一些情况下，⑶4+T细胞为二次CTL群体扩增而非初次群体扩增所需43。CDS+CTL通过B7分子共刺激以及T细胞抗原受体的刺激可在没有T细胞辅助的情况下足以诱发CD8+CTL26。或者，完全有可能的是，存在两种不同谱系的CDS+CTL前体，由此CD4+T细胞非依赖性群体提供了对各种病毒的主要的反应，这引起在不存在CD4+T细胞的情况下无CTL功能损失42。[0079]已发现，⑶74缺乏其内体靶向信号的形式的表达未能补充DC交叉呈递并激活T细胞。然而，用含有功能内体靶向信号的野生型⑶74分子重组恢复了交叉激活，这支持了MHCI类是通过⑶74从ER转运到内溶酶体的机制的提议。另外，完全缺乏⑶4+T细胞的Ragl+小鼠中CC174+DC对CD8+T细胞的缺陷活化明确地展示出，DC交叉激活功能的缺陷是归因于不存在CD74。在我们的研究中，CD74在体内DC归巢和运动性中似乎并不具有作用，但介导用于DC对⑶8+T细胞的⑶74依赖性MHCI类交叉激活的生理学上重要路径。[0080]我们的研究还提供了在生理条件下DC中MHCI类分子与⑶74之间的缔合的证明。其还表明在MHCI类-CD74复合体在内溶酶体中解离之后，内溶酶体隔室中可接着发生MHCI类重链与β2_微球蛋白和抗原肽的重装配44。在此情况下，直接展示了MHCI类-⑶74复合体仍然在被鉴别为晚期内体的泡样隔室中装配。另外，已确立的是，CD74影响内溶酶体中MHCI类的存在，这证实了以下已公开的观察结果:MHCI类-⑶74相互作用引起MHCI类分子的子集对内溶酶体路径的靶向17。[0081]先前已描述的MHCI类细胞质尾域中的酪氨酸内化信号8’13’45将再循环MHCI类靶向到交叉激活隔室中。与这一机制形成对比，⑶74与MHCI类分子之间的稳定相互作用未必发生在质膜处以引导再循环MHCI类，因为DC中不存在CD74似乎并不影响MHCI类的内化。我们的结果支持了以下模型=MHCI类通过细胞质域中的酪氨酸内化信号所引导而从质膜再循环以及MHCI类经由结合到CD74伴侣分子从ER运输两者促成内溶酶体路径中的易于接受肽的MHCI类池。因此，以与通过MHCII类分子所用的类似的方式，MHCI类-⑶74复合体在ER中形成且可以在其运送到交叉激活隔室时遮蔽肽结合的构象形式保持。实际上，两项独立研究已展示CD74肽(包括来源于核MHCII类缔合的⑶74肽CLIP的较小肽(MRMATPLLM)、结合在MHCII类结合沟槽中的⑶74的部分)可从MHCI类分子洗脱46’47。因此，这种肽是CLIP的MHCI类等效物的强有力的候选物。这种CLIP衍生的肽可防止类似于MHCII类情形的过早肽结合46’48。在这种模型中，在消化并去除CD74之后，MHCI类可为装载高亲和力的组织蛋白酶S衍生的外源性肽11且前进到细胞表面，其中其可有效地将⑶8+T细胞前体激活成变得活化。[0082]总而言之，此处我们的结果和其它已公开数据8’49强调了内溶酶体作为DC中交叉呈递的主要隔室的重要性，且此处我们的研究已正式确定了MHCI类-⑶74相互作用关于MHCI类分子的细胞内投送和DC的交叉激活功能的结构和功能相关性。我们的观察结果已定义了先前未知的免疫反应激活路径；未来的研究将完全阐明这一过程。我们的结果具有相当大的临床相关性，且表明将疫苗候选物靶向DC的内溶酶体将增强对MHCI类和MHCII类抗原两者的激活且由此改进疫苗的免疫原性和功效。[0083]方法[0084]小鼠.Cd74+/+(H-2Kb)小鼠是来自查尔斯河实验室(CharlesRiver)。β2_微球蛋白缺陷型BZnr^TaplvOT-1OUKb)和Ragl+(H_2Kd)小鼠是来自杰克逊实验室(JacksonLaboratory)。Cd74+(H_2Kb)小鼠是来自D.马西斯(D.Mathis)的礼物。对于嵌合小鼠，供体骨髓用抗Thy-1(MRC0X-7;艾碧康公司(Abcam))耗尽成熟T细胞且被注射(IX17个细胞)到经亚致死辐射的接受体(1，200拉德)中。外周T细胞子集在用抗⑶8(53-6.7；碧迪法明更公司(BDPharmingen))和抗⑶4(GK1.5,碧迪法明更公司)染色之后通过流式细胞术分析。为了耗尽CD4+细胞，在免疫接种之前和T细胞评估之前48小时，用10yg抗Q)4(GK1.5)注射小鼠5°。所有研究均遵循由英属哥伦比亚大学(UniversityofBritishColumbia)的动物护理委员会(AnimalCareCommittee)和加拿大动物保护协会(CanadianCouncilonAnimalCare)设定的指南。[0085]病毒感染.腹膜内注射VSV(以感染50%组织培养细胞单层的IXlO5到2X15的剂量)。在感染后6天，脾细胞用抗CD8(53-6.7)和H-2Kb-VSVNP(52-59)或H_2Kb-0VA(257-264)iTAg四聚体(免疫组学贝克曼库尔特公司(immunomics-BeckmanCoulter)染色并用FACSCalibur(碧迪公司(BectonDickinson))和FlowJo软件分析。脾细胞与ΙμΜOVA(257-264)(SIINFEKL)或VSVNP(52-59)(RGYVYQGL)一起进一步培养5天，随后如上所述进行四聚体染色。如所述进行细胞毒性分析8。[0086]摄取分析.如所述产生BMDC8。将细胞在4°C下或在37°C下与OVA-AlexaFluor488(30μg/ml;英杰公司(Invitrogen))—起孵育30分钟。OVA摄取通过流式细胞术分析。[0087]交叉呈递分析.如所述产生BMDC8或用⑶Ilc+磁性珠粒(美天旎生物技术公司(MiltenyiB1tech))分离脾脏DC。DC与OVA(沃辛顿公司(Worthington))和在指示时与100μM氯奎一起孵育15小时。DC用FeBlock(法明更公司(PharMingen))，接着用抗H-2Kb(AF.6-88.5)、抗CD80(16-10A1)、抗CD86(GLl)、抗CD40(3/23)(均来自碧迪法明更公司)或抗H-2Kb-0VA(257-264)(25.Dl.16;来自J.耶德尔(J.Yewdell)的礼物)染色，并通过流式细胞术分析。针对交叉激活分析，将DC与OVA、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；15ng/ml;西格玛公司(Sigma))和TNF(10ng/ml)或干扰素I(安迪公司(R&DSystems))一起孵育。如所述评估B3ZT细胞(来自N.夏斯特里(N.Shastri)的礼物)的活化8。[0088]针对体内研究，将Cd74+/+和Cd74+BMDC与OVA或OVA(257-264)(各自10mg/ml)一起孵育2小时，且静脉内注射到Ragl+BALB/c小鼠中(IX17个细胞)。24小时后，OT-1T细胞用2.5μMCFSE(羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯；分子探针公司(MolecularProbes)标记且静脉内注射到小鼠中(5X106个细胞)。OT-1T细胞在脾脏中的增殖在3天后通过流式细胞术以CFSE稀释度形式评估。为了证实定位到脾脏，将CFSE标记的DC静脉内注射到Ragl+BALB/c小鼠中。2小时后，用流式细胞术评估脾脏中CFSE+细胞的存在。[0089]共聚焦显微术.如所述将脾脏衍生的DC分离，固定且使其可渗透8。针对交叉呈递的分析，将DC在存在或不存在TNF(10ng/ml)的情况下与0VA(5mg/ml)—起孵育10小时。当需要时，将DC在加工之前用50μM氯奎处理72小时34。细胞用抗H-2Kb(AF.6-88.5)、抗CD74(In-l;菲茨杰拉德公司(Fitzgerald))、抗LAMP-1(N19;圣克鲁斯生物技术公司(SantaCruzB1technology))或抗H_2Kb-0VA(257-264)(25.Dl.16)染色。将AlexaFluor488结合的或AlexaFluor568结合的兔抗小鼠(A-11029、A_11031;分子探针公司)、AlexaFluor488结合的或AlexaFluor568结合的兔抗山羊(A-11078、A-11079;分子探针公司)或AlexaFluor488结合的山羊抗小鼠(A-11001;分子探针公司)用作二次抗体。用Nikon-Cl、TE2000-UICM和EZ-C1软件获得图像。数据使用ImageJ.1、Openlab和AdobePhotoshop分析。个别颜色的荧光强度以总荧光强度百分比形式呈现。[0090]增殖分析.将来源于C3H/He小鼠(H_2Kk)的BMDC与0VA(10mg/ml)—起孵育15小时且腹膜内注射到小鼠中(5X16个细胞)。如上所述标记并静脉内注射OT-1T细胞。OT-1T细胞的增殖在3天后通过流式细胞术以CFSE稀释度形式评估。[0091]转染.不成熟的BMDC经由使用Amaxa小鼠树突状细胞核转染试剂盒(AmaxaMouseDendriticCellNucleofectorkit)用含有全长小鼠⑶74(p31同工型)或缺乏氨基酸2-17的⑶74的pBabe载体(来自1.沙哈尔(1.Shachar)的礼物)转染。在电穿孔后I天，将DC与0VA(20mg/ml)或OVA(257-264)(IμΜ)一起孵育8小时，接着与CFSE标记的OT-1⑶8+Τ细胞一起孵育3天。CFSE稀释度通过流式细胞术评估。[0092]免疫沉淀.将BMDC在无蛋氨酸且无半胱氨酸的培养基中孵育I小时，接着经[35S]蛋氨酸GOOyCi/ml)脉冲处理30分钟，接着溶解在含有蛋白酶抑制剂‘混合液’(罗氏公司(Roche))和PMSF(苯甲磺酰氟；40μg/ml)的0.5%(体积/体积)NonidetP-40缓冲液(120mMNaCl、4mMMgCl2和20mMTris-HCl，pH7.6)中。当指示时，将DC与100μM氯奎一起孵育过夜，随后溶解。细胞溶解产物通过与正常家兔血清和蛋白质A-琼脂糖凝胶(法玛西亚公司(Pharmacia))—起孵育过夜来进行预澄清。将识别完全折叠的MHCI类的抗H-2Kb(AF6.88.5;碧迪法明更公司)、识别所有MHCI类的由外显子8编码的序列的抗体(来自D.威廉姆斯(D.Williams)和B.巴博尔(B.Barber))、抗1-A-1-E(M5/114.15.2;碧迪公司)、抗CD74(In-l;菲茨杰拉德公司)和转铁蛋白受体的抗体(H68.4;英杰公司)用于免疫沉淀。样品通过10%-12%SDS-PAGE分离。将凝胶固定，用Amplify(安玛西亚生物科学公司(AmershamB1sciences))增强,干燥且曝光到KodakXMR自动射线照相膜上。或者，将样品转移到硝化纤维素膜上且使用抗CD74(In-1;菲茨杰拉德公司)或抗MHCI类(KH95;圣克鲁斯生物技术公司)通过免疫印迹法分析。样品根据制造商的方案(新英格兰生物实验室(NewEnglandB1labs))用内切糖苷酶Hf消化。全细胞溶解产物作为阳性对照通过免疫印迹法分析。将小鼠免疫球蛋白G的驴抗体(926-32212;里-克尔生物科学公司(L1-CorB1sciences))和小鼠大鼠免疫球蛋白G的山羊抗体(A21096;英杰公司)用作二次抗体。印迹使用Odyssey红外成象可视化。[0093]MHCI类内化.BMDC用FeBlock(碧迪法明更公司)染色，接着在0°C下用生物素化的抗H-2Kb(AF6-88.5;碧迪法明更公司)标记30分钟。将样品在37°C或(TC下孵育。在适当时间，将DC固定于2%(体积/体积)多聚甲醛中且用链霉亲和素-藻红蛋白标记，接着通过流式细胞术检查。数据用Flowjo软件分析以计算内化的MHCI类的量。[0094]统计分析.史都登氏t检验(Student’st_test)用于比较群体之间的差异。当P值小于0.05(两尾)时，将差异视为在统计学上显著。[0095]参考文献[0096]1.瓜利亚尔迪L.E.(Guagliardi,L.E.)等人参与抗原加工和呈递的分子在早期细胞内吞隔室中的共定位(Co-localizat1nofmoleculesinvolvedinantigenprocessingandpresentat1ninanearlyendocyticcompartment).自然(Nature)343,133-139(1990)。[0097]2.科瓦切维奇-班科夫斯基M(Kovacsovics_Bankowski，Μ.)和洛克K.L.(Rock,K.L.)MHCI类分子上呈递的外源性抗原的吞曬体到细胞溶质路径(Aphagosome-to-cytosolpathwayforexogenousantigenspresentedonMHCclassImolecules).科学(Science)267，243-246(1995)。[0098]3.阿克曼A.L.(Ackerman,A.L.),齐里齐斯C.(Kyritsis,C.),坦佩R.(Tampe,R.)和克雷斯韦尔P.(Cresswell,P.)树突状细胞中的早期吞噬体形成足以用于外源性抗原交叉呈递的细胞隔室(Earlyphagosomesindendriticcellsformacellularcompartmentsufficientforcrosspresentat1nofexogenousantigens).美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)100,12889-12894(2003)。[0099]4.盖尔蒙普雷P(Guermonprez,P.)等人ER-吞噬体融合定义树突状细胞中的MHCI类交叉呈递隔室(ER-phagosomefus1ndefinesanMHCclassIcross-presentat1ncompartmentindendriticcells).自然425，397-402(2003)。[0100]5.霍德M.(Houde,Μ.)等人吞噬体为抗原交叉呈递的感受态细胞器(Phagosomesarecompetentorganellesforantigencross-presentat1n).自然425，402-406(2003)。[0101]6.普法伊费尔J.D.(Pfeifer，J.D.)等人细菌抗原针对I类MHC呈递到T细胞的吞嗤力口工(PhagocyticprocessingofbacterialantigensforclassIMHCpresentat1ntoTcells).自然361，359-362(1993)。[0102]7.桑R.(Song,R.)和哈德林C.V.(Harding,C.V.)蛋白酶体、用于抗原呈递的转运蛋白(TAP)和β2-微球蛋白在经由替代性I类MHC加工路径加工细菌或微粒抗原中的作用(Rolesofproteasomes,transporterforantigenpresentat1n(TAP)，andβ2-microglobulinintheprocessingofbacterialorparticulateantigensviaanalternateclassIMHCprocessingpathway).免疫学杂志(J.1mmunol.)156，4182-4190(1996)。[0103]8.利齐G.(Lizee,G.)等人通过主要组织相容性复合体I类细胞质域控制树突状细胞交叉呈递(Controlofdendriticcellcross-presentat1nbythemajorhistocompatibilitycomplexclassIcytoplasmicdomain).自然免疫学(Nat.Immunol.)4，1065-1073(2003)。[0104]9.加农E.(Gagnon,E.)等人内质网介导的吞噬作用是一种进入巨噬细胞的机制(Endoplasmicreticulum-mediatedphagocytosisisamechanismofentryintomacrophages).细胞(Cell)110，119—131(2002)?[0105]10.图雷N.(Touret，N.)等人ER对吞嗷体形成的贡献的定量和动态评估(Quantitativeanddynamicassessmentofthecontribut1noftheERtophagosomeformat1n).细胞123，157-170(2005)。[0106]11.沈L(Shen，L.)，西加尔LJ.(SigaljLJ.),伯斯M.(Boes，Μ.)和洛克K.L组织蛋白酶S在产生肽以用于体内TAP非依赖性MHCI类交叉呈递中的重要作用(ImportantroleofcathepsinSingeneratingpeptidesforTAP—independentMHCclassIcrosspresentat1ninvivo).免疫(Immunity)21，155-165(2004)。[0107]12.西布利安1.(Cebrian,1.)等人Sec22b通过树突状细胞调节吞嗷体成熟和抗原交叉呈递(Sec22bregulatesphagosomalmaturat1nandantigencrosspresentat1nbydendriticcells).细胞147，1355-1368(2011)。[0108]13.巴沙G.(Basha，G.)等人MHCI类内体和溶酶体运输与树突状细胞中的外源性抗原装载一致(MHCclassIendosomalandlysosomaltraffickingcoincideswithexogenousantigenloadingindendriticcells).公共科学图书馆?综合(PLoSONE)3，e3247(2008)。[0109]14.丘1.(Chiu，1.)，戴维斯D.M.(Davis，D.Μ.)和施特罗明格J.L(Strominger,J.L.)自发内吞的MHC蛋白质的运输(Traffickingofspontaneous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