高温耐酸性α-淀粉酶的突变株及其构建方法

专利名称：：高温耐酸性α-淀粉酶的突变株及其构建方法
技术领域：
：本发明涉及生物工程领域，尤其是一种高温耐酸性a-淀粉酶的突变株及其构建方法。
背景技术：
：a-淀粉酶(a-1，4-glucan-glucanhydrolaseEC3.2.1.1)又称为液化型淀粉酶，它能从淀粉分子的内部任意切开ct-l，4键，产生分子量比较小的麦芽糖糊精。淀粉在ct-淀粉酶的作用下，分子迅速降解，粘度下降，即完成液化。a-淀粉酶具有相当大的商业价值，广泛应用于淀粉深加工工业、酒精工业、啤酒工业、拧檬酸工业、味精及淀粉糖化工业、制药工业及纺织业。a-淀粉酶可由微生物发酵产生，也可由植物、动物提取。目前工业生产上大都以微生物发酵法大规模生产a-淀粉酶。枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽抱杆菌、米曲霉、黑曲霉等都是有实用价值的a-淀粉酶产生菌，其中地衣芽孢杆菌生产的a-淀粉酶因具有热稳定性而被优选使用。耐髙温a-淀粉酶由于具有相当高的热稳定性，因此被广泛应用于啤酒、酒精、制药及食品等行业，是目前工业上用途最广泛的一种酶。但是，近年来随着淀粉原料深加工行业的发展，要求酶制剂行业需要不断更新和完善酶的种类以满足工业生产的要求。对于淀粉糖化工业，目前工业上常采用双酶法水解淀粉制糖，自然pH为4.0-5.0的淀粉浆需经液化和糖化两个过程处理，即先加淀粉酶液化，再加糖化酶糖化来生产葡萄糖.但是由于目前市售的淀粉酶最适pH为6.5-9.0，而糖化酶的最适pH为4.5左右，因此淀粉浆需先加碱调整PH进行液化，液化液还需再加酸调整pH才能用于糖化，反复调节pH不仅使工艺变得繁琐增加生产成本，引入外源离于，加重离交负担，而且调节不当还会产生大量的副产物，使葡萄糖收率降低。在我国传统白酒生产中，随着发酵的进行，酸度不断增加，pH下降，使酶的活性降低，淀粉水解不彻底，原料大约有12%不能被利用；而在酒精行业中，由于废水的回填，使得原料液pH值降为4.0-5.0，也不适合a-淀粉酶的作用。味精行业对淀粉水解糖液的质量要求卜分严格，加工工艺的pfl—般为4.6-4.8。为了给淀粉原料的深加工提供更好的条件，开创新的酶法工艺，提高收得率、降低消耗、提高产品质量、增加效益，特别对于节约工业用粮，满足一些在酸性条件下进行淀粉原料液化工艺的要求，开发一种耐酸的高温a-淀粉酶就势在必行。早在1963年，H本的研究者YasujiMinoda等人就发现可以用真菌生产耐酸性a-淀粉酶，以后欧洲、美国、韩国、中国等国家都对耐酸性a-淀粉酶进行了研究，其屮得到的产耐酸性a-淀粉酶的微生物大多为芽孢杆菌和曲霉。1994年，日本宫崎大学的高崎幸义教授从土壤中分离到一株地衣芽孢杆菌，所产的a-淀粉酶最适pfl为5.0，最适温度为90'C。另外，日本科学家今中忠行选育出一株耐酸性的a-淀粉酶产生菌/yr0C0CCMSA，该菌株所产的a-淀粉酶最适pH为5.0,在pH5.0时最适反应温度为lOOC。运用基因工程手段，构建耐高温耐酸性a-淀粉酶生产菌，是目前各闺研究者最常用的一种育种方法。欧洲的研究者采用基因技术改造fec^7i/s"'c力em'/br啦's来生产耐热性的耐酸性a-淀粉酶。在原有天然菌株的DNA序列中将N188位的天冬氨酸残基用其它任何一种氨基酸取代，并使在N15或N197位的蛋氨酸残基缺失，得到的高产菌株所生产的a-淀粉酶适用的液化pH值可以降低到5.0，且在100-1IOIC时活性不变。在我国，20世纪70年代时已有人用力砂e/^77t/s/w'ger进行酸性a-淀粉酶的发酵研究，但未取得进展。90年代时，中科院微生物研究所研究了嗜热真菌7Zer迈o/^ces7a/w/^77osi/s对a-淀粉酶的生产，该酶的最适温度和pH分别为65"和5.0，其耐热性较差。目前商品化应用的真菌月SjDe7^/77tfsary幼e和i4s/e/^77^ASairafflKr/的a—淀粉酶PH范围为5-6，但不耐髙温。江南大学从淀粉加工厂的酸性土壤中筛选到的5aw7hsWearof力er历o/w7/ws,能够产生两种酸性a-淀粉酶，其最适pH分别为4.5和5.0，最适温度为601C，可以应用于一定条件下的酒糟利用和处理。可以看出，目前国内酸性a-淀粉酶的最适温度都低于7piC，由于超过7(TC进行水解反应时酶活就会大量损失，因此不能适应我国酒精、淀粉糖化等淀粉深加工行业工艺的要求。为了给淀粉原料的深加工提供更好的条件，需要开创新的酶法工艺；特别是为了节约工业用粮，就需要运用基因i程手段，获得既耐酸又耐高温的a-淀粉酶的高效表达，以显著提高经济效益和社会效益。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高温耐酸性a-淀粉酶的突变株及其构建方法。本发明是将经过体外定点突变改造后获得的耐髙温及耐酸同时兼顾的a-淀粉酶突变基因经过与出发菌株地衣芽孢杆菌的基因组DNA同源重组后整合到其基因组上，使高温耐酸性a-淀粉酶获得了同源高效表达。本发明采取的技术方案是一种高温耐酸性a-淀粉酶的突变株，是将出发菌株地衣芽孢杆菌耐高温a-淀粉酶基因经体外Leul34—Arg和Ser320—Ala突变后所获得的高温耐酸性a-淀粉酶基因取代原始耐高温a-淀粉酶基因后得到的突变株。而且，所述的出发菌株地衣芽孢杆菌在中国工业微生物菌种保藏管理中心CTCC保藏，保藏号10181。一种髙温耐酸性a-淀粉酶的突变株的构建方法，其构建方法包括如下歩骤(1).构建打靶载体pUC-afl^-a/zy^Km-:以地衣芽孢杆菌基因组DNA为模板，各设计两对特异的PCR引物，扩增耐高温ci-淀粉酶的上游、下游同源性核苷酸片段，得到两个同源性核苷酸片段，将上游片段、卡那霉素抗性基因、下游片段定向连接入载体中，构建得到打靶载体pUC-a/zy^-az/T^KnT;(2).构建打靶载体pUC-a/^d以含高温耐酸性a-淀粉酶基因的重组质粒为模板，设计特异的PCR引物，扩增高温耐酸性a-淀粉酶基因，将该片段连入载体中，构建得到打靶载体pUC-a//"(3).获得地衣芽孢杆菌耐高温a-淀粉酶基因缺失株利用打靶载体pUC-a/zy^-a^iH(nf转化地衣芽孢杆菌原始出发菌株，同源重组其宿主细胞基因组DNA，卡那抗性基因取代基因组DNA中部分耐高温a-淀粉酶基因，获得地衣芽孢杆菌耐高温a-淀粉酶基因缺失株；(4).获得高温耐酸性a-淀粉酶基因突变株利用打靶载体pUC-afflj^/转化地衣芽孢杆菌耐高温a-淀粉酶基因缺失株，同源重组其宿主细胞基因组DNA，高温耐酸性a-淀粉酶基因带有两个突变位点的部分基因取代缺失株基因组中卡那抗性基因，获得地衣芽孢杆菌高温耐酸性a-淀粉酶基因突变株。而且，所述步骤(l)的耐高温a-淀粉酶的上游、下游同源性核苷酸片段分别为372bp和350bp。而且，所述歩骤(l)、(2)中连接基因片段的载体为pUC19;所述步骤(3)、(4)中卡那抗性基因来自于枯草芽孢杆菌p冊980质粒，大小为1112bp;所述步骤(2)中含高温耐酸性a-淀粉酶基因的重组质粒为pBEC。而且，所述步骤(3)的转化宿主细胞为地衣芽孢杆菌细胞；所述步骤(4)的转化宿主细胞为地衣芽孢杆菌耐高温a-淀粉麵基因缺失株细胞。本发明的优点和积极效果是本发明利用同源重组技术，将经过体外定点突变后获得的高温耐酸性a-淀粉酶基因整合到出发菌株地衣芽孢杆菌基因组DNA上，取代原有的耐高温a-淀粉酶基因，获得了耐高温及耐酸同时兼顾的a-淀粉酶的高效表达。该酶最适温度为951C，最适pH为4.5,在温度40"C-95iC，？114.0-6.5之间时，酶活较稳定，说明该酶具有良好的热稳定性和酸稳定性。本发明开创了新的酶法工艺，节约了工业用粮，给淀粉原料的深加工提供了更好的条件，更适用于工业化的生产和应用，不仅具有重要的经济效益，也具有明显的社会效"^i-o图l是本发明a/By厶湖y么KnT的PCR扩增电泳阁2是本发明打靶载体pLiC-^zy^-a/^^KnT构建示意图3是本发明湖yd的l)CR扩增电泳图4是本发明打靶载体pUC-湖y^构建示意图5是本发明突变a-淀粉酶对照原始a-淀粉酶最适pH示意图6是本发明突变a-淀粉酶对照原始a-淀粉酶PH稳定性示意图7是本发明突变a-淀粉酶对照原始a-淀粉酶DE值变化曲线示意图；图8是本发明突变a-淀粉酶对照原始a-淀粉酶透光率变化曲线示意图。具体实施例方式下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明将已经获得的高温耐酸性a-淀粉酶(a-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达.食品与发酵工业，2005，31(10):33-36.耐酸耐高温的a-淀粉酶及其制备方法，专利申请号200510013865.2)，为了提高从地衣芽孢杆菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC,保藏号，10181)中分离出的耐高温a-淀粉酶的耐酸稳定性，将该基因成熟肽134位的L-亮氨酸变为L-精氨酸、其320位的L-丝氨酸变为L-丙氨酸所获得的突变基因；将该基因利用同源重组的方法整合到出发菌株地衣芽孢杆菌基因组DNA中，取代原有的耐高温a-淀粉酶基因，实现高温耐酸性a-淀粉酶的同源髙效表达。该a-淀粉酶突变株产酶活力高，在保持其热稳定性的同时，具有了良好的酸稳定性，适用于工业化的生产和应用。本发明设计了3对上下游引物，按照图1所示以pUC19为载体，将耐高温a-淀粉酶基因的上游372bp、下游350bp的片段与卡那霉素抗性基因进行连接，构建打靶载体pUC-aay^-a/^^KnT，与出发菌株地衣芽孢杆菌进行同源重组，筛选卡那霉素抗性、氨苄青霉素敏感的地衣芽孢杆菌耐高温a-淀粉酶基因缺失株。按照图2所示以pUC19为载体，与高温耐酸性a-淀粉酶基因进行连接，构建打耙载体pUC-a^c/,与获得的基因敲除突变株进行同源重组，筛选卡那霉素及氨苄青霉素敏感的地衣芽孢杆菌髙温耐酸性a-淀粉酶基因突变株。本发明获得的突变株所产的a-淀粉酶在pH4.5时，具有良好的酸稳定性。一、打耙载体pUC-afl7y7-azy^"Kmr的构建从地衣芽孢杆菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心,CICC，保藏号10181)中分离出耐高温a-淀粉酶基因，设计如下引物(引物委托上海英骏生物技术有限公司合成)上游引物F1:5，-CCCAAGCTTGCAAATCTTAATGGGACGCT-3,下游引物R1:5，-CGCGGATCCGTCAGCGGGATCGACTTCAA-3'上游引物F2:5，-CGGGGTACCACGGGACGAMGGAGACTC-3，下游引物R2:5，-CCGGAATTCTCTTTGMCATAAATTGAAACCG-3,上游引物F3:5，-CGCGGATCCGCCGATGAAGATGGATTTTC-3，下游引物R3:5，-CGGGGTACCGCACACCCTTTATTCCGTTA-3'1.PCR扩增按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，反应组分加入量10XProbestbuffer5叱dNTP(2.5raol/L)4nL上游引物F1U0pmo]AiL)4ML下游引物R1U0pmol/MU4叱DNA模板'Probest高保真DNA聚合酶0.5叱ddH2031.5JJL总体积50叱扩增条件95t:3min，l个循环；30s，30s，72。C60s，30个循环；72°C10min，l个循环。其中上游引物F15'端含〃jV3dlII酶切位点，下游引物R15'端含万arfn酶切位点。以地衣芽孢杆菌耐高温o-淀粉酶基因为模板，引物F1和R为引物，在上述体系和条件下进行PCR1扩增，得到该基因上游372bp的DNA片段朋!r厶(2).PCR2按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，反应组分加入量10XProbestbuffer5MidNTP(2.5mol/L)4叱上游引物F2(10pmo]./ML)4叱下游引物R2(10pmol/叱)4叱DNA模板1HLProbest高保真DNA聚合酶0.5MLddH2031.5ML总体积50ML扩增条件95"3min，l个循环；94"30s，53X:30s，72"60s,30个循环；72"10min，l个循环。其中上游引物F25'端含,/wI酶切位点，下游引物R25'端含fcoRI酶切位点。以地衣芽孢杆菌耐高温a-淀粉酶基因为模板，引物F2和R2为引物，在上述体系和条件下进行PCR2扩增，得到该基因下游350bp的DNA片段朋7/么(3).PCR3按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，反应组分加入量10XProbestbuffer5MLdNTP(2.5mol/L)4叱上游引物F3(10praol/ML)化L下游引物R3(10pmolAiL)扭LDNA模板1PLProbest高保真DNA聚合酶0.5MLddH2031.5HL总体积50Mi扩增条件95"C3min，l个循环；94匸30s,53"30s，72°C60s，30个循环；72。C20min,l个循环。其中上游引物F35'端含ifeflHI酶切位点，下游引物R35'端含A^M酶切位点。以枯草芽孢杆菌pWB980质粒为模板，引物F3和R3为引物，在上述体系和条件下进行PCR3扩增，得到编码卡那抗性基因1112bp的DNA片段KnT。将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在约370bp，350bp，1112bp处出现特异性条带，结果如图l所示，其大小与目的基因片段a/zy^，，y么KnT完全吻合。2.构建打靶载体pUC-柳/7-;My^4CnT如图2，构建过程如下().将PCR扩增得到的目的基因a/z^分别用历Vxiin和5aflHI双酶切，酶切产物经DNA纯化试剂盒(改试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司)纯化。(2).将pUC19质粒(该质粒购自TAKARA公司)经〃i/3dni和/feflHI双酶切、纯化后与第(l)步的纯化产物通过连接试剂盒(该试剂盒购自TAKARA公司)在12t:的条件下连接12h，得到重组质粒pUC-a^厶(3).将10叱的pUC-a/^7电转化40^大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素(100Mg/mL)的IPTG、X-gal的LA平板上，从蓝白选择平板上挑选验证正确的的阳性转化子pUC-azy^，经/T/M7l和&oRI欢酶切、切胶纯化后回收。(4).将湖^邀A5Ml和^boRI双酶切、纯化后与第(3)步的回收产物通过连接试剂盒在12t:的条件下连接12h,得到重组质粒pUC-a/z^-aflr么(5).将10叱的pUC-afly^-aay滩转化40ML大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在含氨节青霉素(100Mg/mL)的IPTG、X-gal的LA平板上，从蓝白选择平板上挑选验证正确的阳性转化子pUC-a/^7-aay《，经Mn和A^7l双酶切、切胶纯化后回收。(6).将Knf经Mn和A^7l双酶切、纯化后与第(5)步的回收产物通过连接试剂盒在121C的条件下连接12h，得到重组质粒pUC-aay^-aay^"Knf。(7).将10ML的pUC-afl7//-affly^"Knf电转化40ML大肠杆菌JM109感受态细胞,涂布在含氨节青霉素(100Mg/mL)的IPTG、X-gal的LA平板上，从蓝白选择平板上挑选验证正确的阳性转化子pUC-柳y/-aay^"KnT，得到打耙载体pUC-柳y7-afly^"KnT。二、打靶载体pUC-afly^/的构建1.PCR扩增按以下次序，将各成分在灭菌薄壁离心管内混合，反应组分加入量10XProbestbuffer5MLd證(2.5mol/L)4nL上游引物F1(10pmoJAiU下游引物K2(10pmol/叱)4W,DNA模板1HLProbest高保真DNA聚合酶0.5叱ddH2031.5ML总体积50化扩增条件95"C3min，l个循环；94°C30s,63^30s，72°C60s，30个循环；72°C10min，l个循环。其中上游引物F15，端含W/xinT酶切位点，下游引物R25，端含fcoRI酶切位点。以地衣芽孢杆菌高温耐酸性a-淀粉酶基因为模板，引物F1和R1为引物，在上述体系和条件下进行PCR扩增，得到该基因1449bp的DNA片段湖7/A将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在1500bp处出现特异性条带，结果如图3所示，其大小与目的基因片段湖vo完全吻合。2.构建打靶载体pUC-aay^如图4，构建过程如下(1).将PCR扩增得到的目的基因柳/纷别用///]111和￡6'凍1双酶切，酶切产物经DMA纯化试剂盒纯化。(2).将01^19质粒经///^111和/^^1双酶切、纯化后与第(l)步的纯化产物通过连接试剂盒在12C的条件下连接12h，得到重组质粒pUC-a/ff.^/。(3).将10ML的pUC-3ffi[Kfl电转化40ML大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在含氨节青霉素(100Mg/mU的IPTG、X-gal的UV平板上，从蓝白选择平板上挑选验证正确的阳性转化子pUC-aayW，得到打靶载体pUC-azy^/。三、利用打靶载体pUC-a^^KnT同源重组地衣芽孢杆菌，获得地衣芽孢杆菌耐高温a-淀粉酶基因缺失株将出发菌株地衣芽孢杆菌单菌落接种到30mLPA液体培养基/250mL三角瓶(PA培养基配方100g去皮马铃薯加500ml水煮沸30min，双层纱布过滤；lg酵母粉lOg蛋白胨，pH7.2，H201000mL)37"，200r/min培养72h。离心收集芽孢。将107个芽孢接种到25mLNBSG~X生长培养基/250mL三角瓶(NBSG"X培养基配方K^PO^56.Og，KH2P0424.Og，(NH》2SO,2.0g，拧檬酸三钠6.Og，MgS04.7H201.2g，FeCl3'611200.04g，MnS04WO0.0025g，甘油5.0g，营养肉汤8.0g，pH8.0，H20lOOOmL)37X:，往复式摇床，振幅5cm，100次/min，培养18h。将0.1mL培养液、0.1mL(lOOMg)质粒pUC-aOTy/-afflyfKnr与0.8mLTM培养基(TM培养基配方lyff(U4.0g，KH2P0,6.0g，(NH^SOA0g，柠檬酸三钠1.Og,MgS(^7H201.Og，MnSOiH200.0125g，CaCl22H200.30g，NaCl11.7g，葡萄糖5.Og,H20lOOOmL)混合，37C往复式摇床，振幅5cm，100次/min，培养3h。将转化液涂布于含卡那霉素(30Mg/mL)的minimal1琼脂平板上(minimal1琼脂培养基配方KJff0414.Og，KHaPOW.0g，(NH^SC^2二0g，拧檬酸三钠1.Og,MgS04'7&00.20g，FeCl:,6H200.04g，MnSOtH200.0025g，葡萄糖5.0g，酸水解酪蛋白lg，琼脂粉20g，H201000mL)。48h后挑取转化子，点接到含氨苄青霉素(100Mg/mL)的minimi1琼脂平板上，以在含氨苄青霉素(100fig/mL)的minimal1琼脂平板上未长的转化子基因组DM为模板，利用上游引物F3、下游引物R3，上游引物F1、下游引物R2分别进行PCR扩增，将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在约1100bp,1800bp处出现特异性条带，即为阳性转化子。此转化子即为地衣芽孢杆菌耐高温a-淀粉酶基因缺失株。四、利用打靶载体plJC-c柳j^同源重组地衣芽孢杆菌耐高温ci-淀粉酶基因缺失株，获得高温耐酸性a-淀粉酶基因突变株将地衣芽孢杆菌耐高温a-淀粉酶基因缺失株单菌落接种到30mLPA液体培养基/250mL三角瓶，37'C,200r/min培养72h。离心收集芽孢。将107个芽孢接种到25mLNBSG-X生长培养基/250mL三角瓶，37汇，往复式摇床，振幅5cm,100次/mJn，培养18h。将0.1mL培养液、0.1mL(100Hg)质粒pUC-与0.8mLTM培养基混合，37°C，往复式摇床，振幅5cm，100次/ndn，培养3h。将转化液涂布于minimal.1琼脂平板上。48h后挑取转化子，点接到含氨苄青霉素(100Mg/mL)、卡那霉素(30Mg/mL)的minimal1琼脂平板上，以在含氨苄青霉素(lOOPg/raL)、卡那霉素(30Mg/mL)的minima]1琼脂平板上未长的转化子基因组DNA为模板，上游引物FK下游引物R2，进行PCR扩增，将所得的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，在约1500bp处出现特异性条带，即为阳性转化子。将转化子该基因进行核苷酸序列测定进行比对，结果与高温耐酸性a-淀粉酶基因完全吻合的，即为高温耐酸性a-淀粉酶基因突变株。五、突变株高温耐酸性a-淀粉酶的表达及纯化在活化培养基(牛肉粉5.0g，NaC12.0g，酵母粉2.0g，蛋白胨10g，粗淀粉10g，葡萄糖50g(单消)，琼脂粉17g,H20lOOOmL)上培养36h，挑取地衣芽孢杆菌突变株单菌落接种到50mL种子培养基/250mL三角瓶(种子培养基配方牛肉粉1.50g，酵母粉L50g，蛋白胨5.00g,磷酸二氢钾(无水)1.32g，磷酸氢二钾3.68g，葡萄糖l.OOg,NaC13.00g，H201000mL)，37"，200r/min培养16h。然后按2%接种量转接至50mL发酵培养基/250mL挡板三角瓶(豆饼粉26g，棉籽饼粉21g,磷酸氢二钾28.8g，磷酸二氢钾(无水)6.7g，柠檬酸三钠2.0g，玉米浆20g，(肌)孤5.0g，CaCl20.45g,乳糖10g(单消)，H20lOOOmL),421C，300r/min培养96h。将发酵液经离心后获得的上清液，先加入30%饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到70%，沉淀目的蛋白，可取得较好的分离效果。用0.02mol/LTris-HC1(pH7.0)缓冲液平衡DEAE-S印haroseFastFlow(2.4cmX30cm)离子交换层析柱，将盐析脱盐后得到的活性组分用同样的缓冲液溶解，6000r/min离心10min，上样(2ml)后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含0-lmol/LNaCl的0.02raol/LTris-HC1(pH7.0)缓冲液梯度洗脱，分歩收集。用0.02mol/LTris-HC1(pH7.0)缓冲液平衡S印hadexG-75(1.6cmX80cm)凝胶层析柱，将离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/LNaCl的0.02.ol/LTris-HC1(pH7.0)缓冲液平衡，样品6000r/rain离心10min，上样(2ml)后用相同的缓冲液以0.5ml/min的速度洗脱，每管收集2.Oml，紫外检测器在线检测A280nm，收集活性峰，得到电泳纯的高温耐酸性ci-淀粉酶。产品性能测定1.a-淀粉酶活力的测定酶活力单位定义在70'C、pH6.0条件下，lmin液化lmg可溶性淀粉成为糊精所需要的酶量，即为1个酶活力单位，以U/mL(U/g)表示。测定方法(QB/T2306-97)如下1.酶液制备用缓冲液配制成酶溶液，使其最终酶浓度控制在65U/mL-70U/mL范围之内。2.测定(1)吸取可溶性淀粉溶液(20g/L)20mL和磷酸缓冲液(pH=6.0)5mL于试管中。在70'C恒温水浴中预热3min-5min。(2)加入稀释好的待测酶液1.OOmL，立即计吋，摇匀，准确反应5rain。(3)立即吸取1.OOmL反应液移入预先装有0.lmol/LHC10.5mL和5mL稀碘液的试管中摇匀。(4)以0.lmol/LHC10.5mL和5mL稀碘液的混合液作空白，于660nm波长下，用lOmm比色皿迅速测定吸光度(A)。根据吸光度査表，求得测试酶液的浓度(C)。3.计算X=CXNX16.67式中X-样品的酶活力U/mL(U/g);C-测试的酶液浓度U/mL;N-样品的稀释倍数；16.67-换算常数。所得结果表示至整数。将突变株及原始株发酵液，12000r/min离心lOmin去除细胞，测定上淸液中的酶活(记为细胞外酶活)。2.a-淀粉酶性质的研究经硫酸铵盐析、DEAE-S印haroscFastFlow离子交换层析、S印hadexG-75凝胶层析分离纯化后，得到电泳纯的突变a-淀粉酶及原始a-淀粉酶，对其进行酶学性质的研究。(1).温度对酶活力的影响纯酶最适反应温度的测定在不同温度(30x:、4or;、5or、60"c、70°c、so'c、90'C、IOOX:)，pl诉.5的条件下测定重组酶纯化酶液的酶活，将最高活力定为100%。②纯酶的热稳定性测定将两种重组酶纯化酶液分别置于不同温度U0r、60'C、80"、100r)服.5的条件下保温21，每隔20min取出，各自测定其残余酶活力，以相应温度下未保温的酶液活力为100%，绘制温度稳定性曲线。原始a-淀粉酶和突变a-淀粉酶反应的最适温度均为95C在70X:到IOOX:之间相对酶活为80%以上。两种酶在40到801C保温120min，酶活基本没有损失，残余酶活保持在80%以上，1001C保温60min，原始a-淀粉酶和突变a-淀粉酶仍有61%、68%的残余酶活，具有一定的耐热性.，.说明原始a-淀粉酶经过体外定点突变后获得突变a-淀粉酶,耐高温的酶学特性并没有改变,,(2).pH对酶活力的影响①纯酶最适反应pH的测定在不同pH值(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)70匸的下测定重组酶纯化酶液的酶活，将最高活力定为100%。②纯酶的pH稳定性测定将两种重组酶纯化酶液在不同pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)条件下在70"保温60min，各自测定其残余酶活力，以相应pH下未保温的酶活力为10094，绘制pH稳定性曲线。由图5可知，原始a-淀粉酶的最适pH为6.5，在pH6-7之间，相对酶活在90%以上，pH3,5以下完全失活。突变a-淀粉酶最适pH为4.5，在pH4时相对酶活仍达到80%。由图6可知，原始a-淀粉酶在pH5.5-7.0范围内较稳定，残余酶活为80%以上，突变a-淀粉酶在pH4.0-6.5范围内较稳定，残余酶活为80%以上，pH4.5时残余酶活为90%,具有很好的耐酸稳定性。结果表明，原始a-淀粉酶经过体外定点突变后获得突变a-淀粉酶，耐高温的酶学特性并没有改变，而耐酸稳定性明显提高，获得了既耐酸又耐高温的新型a-淀粉酶。(3).a-淀粉酶应用实验配置浓度为20%的玉米淀粉溶液100mL，调节pH值至4.5，按30U/g淀粉加入重组酶，95t:保温90rain后，加入盐酸调液化液pH至2.0，使酶钝化，终止酶的反应，并迅速冷却至常温，钝化后加入相应的氢氧化钠中和盐酸进行DE值测定。①DE值的测定与计算测定方法参照中华人民共和国行业标准QB12I6-91中6.6.2直接滴定法。DE计算按下式进行说，=lxK/x10式中DE-样品的DE值，％:VI-标定时消耗葡萄糖标准溶液(g/L);V2-测定时消耗试样的体积，mL;m-样品的质量，g;G-样品的固形物含量。②透光率的测定玉米淀粉液化反应结束，立即加入一定量的lmol/L盐酸终止反应，并冷却至室温，以蒸馏水做对照，测定640rai波长下的透光率。DE值的变化结果如图7所示，在95'C，pH值4.5的反应体系下，突变a-淀粉酶的DE值明显高于原始a-淀粉酶。由图8所示，突变a-淀粉酶的透光率值高于原始a-淀粉酶，说明在此反应体系f，突变a-淀粉酶液化液中杂质凝聚的效果好于原始a-淀粉酶液化液。这一应用试验结果表明，突变a-淀粉酶在高温酸性条件下的酶活力及稳定性明显高于原始a-淀粉酶。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>275HisTyrGinPhe290ArgLysLeuLeu305ValThrPheValSerThrValGin340ThrArgGluSer355ThrLysGlyAsp370GluProliel"eu385AspTyrPheAspSerSerValAla420GlyG]yAlaLys435TrpHisAspIe450Glu(;lyTrpC'.ly465ValGinArg<210>2<2J1〉1846<212>PRT<213>耐高温a-<40()〉2GlyCysAlaAlaCysG]yCysThr20ThrGlyAlaAla35AlaA丄aThrGly50GlyGlyAlaAla65CysGlyAJaCysGJ.yCysThrGly100CysThrGlyCysHisAsnAsp325ThrGlySerLysHis405AsnArgThrGluAlaGly310AsnTrpTyrGinAla390HisSerMetGlyPhe470Ala295ThrHisPheProArg375ArgAspGlyTyrAsn455His280SerValAspLysGin360G]uLyslieLeuVal440ArgVatThrValThrPro345VallieGinValAla425GlySerAsnGinSerGin330LeuPheProTyrGly410AlaArgGluGlyGlyLys315ProAlaTyrAlaAla395TrpLeuGinProGly475Gly300HisGlyTyrGlyLeu380TyrThrlieAsnVal460Ser285GlyProGinAlaAsp365LysGlyArgThrAla445ValValTyrLeuSerPhe350MetHisAlaGluAsp430GlylieSorAspLysLeu335lieTyrLysGinGly415GlyGluAsnTieMetAla320GluLeuGlylieHis400AspProThrSerTyr柳.淀粉酶缺失株(a_1,4-glucan-glucanhydrolase)Ala5GlyThrAlaGlyThr85AlaCysThrAlaGlyCysCys70CysAlaGlyCysThrGlyGly55GlyGJyCysThrThrGJyThr40GlyThrGlyA.laThrCys25AlaCysThrCysGys105ThrAla10八LaCysCysThrAla90GlyGlyAlaGlyAJaAlaGJy75ThrGlyGlyThrThrThrAla60CysAlaThrAlaGlyAlaGJy45CysAlaThrAlaThrGlyGly15ThrThr30CysCysAlaThrAlaA1bThrThr95ThrThr110ThrCysAlaThrCysThrAla80GJyAlaCysCysAla145ThrCysGlyAlaAla225G]yCysThrGlyThr305CysGlyThrThrGly385ThrThrThrAlaCys465AlaCys130CysGlyGlyGlyAla210AlaGlyGlyThrThr290CysGlyAlaThrGly370AlaThrThrAlaGlyAlaGly115CysGlyGlyAlaGly195GlyAlaAlaAlaCys275ThrAlaGlyA.laGly355AlaAlaAlaGlyThr435ThrG]yAlaGlyAlaGlyCys180GlyGlyGlyGlyThr260CysThrThrCysGJy340AlaCysGyThr()]yThrThrThrThrGlyGlyCys165CysAlaGlyThrAla245CysCysAlaCysGly325AlaAlaGlyA]aThr405GlyThrCysThrGly485CysCys150ThrThrGlyAlaAla230GlyAlaGlyCysAla310CysThrGlyGlyThr390G〗yAlaThrAlaThr470CysAla135CysAlaThrThrCys215CysCysAlaCysGly295AlaThrG-:yThrAla375GlyCysA]aA丄iiAla455GlyThr120ThrAlaCysThrThr200GlyAlaThrAaGly280(;lyCys;LyThr360Thr(;lyAlaCysThr柳CysThrAlaAlaAlaGlyAla185ThrGlyGlyGlyAla265AlaGlyCysAlaAla345(;lyCysAlaAaGly425ThrAlaThrThrThrGlyGly170ThrCysThrCysCys250GlyCysGlyAlaThr330AlaAlaCysThrThr410GlyAlaA]aGlyA丄a490AlaCys155ThrGlyAlaThrAla235AlaThrAlaAlaCys315GlyCysThrGlyThr395GlyAlaAlaAlaAla475AlaAla140GlyGlyAlaThrCys220CysAlaCysThrThr300AlaCysCysCysCys380ThrThrAlaAlaCys460AlaThr125GlyGlyCysThrCys205GlyAlaThrThrThr285GlyAJa(;yGlyCys365CysThrGlyAlaGly445GyGlyThrGlyAlaThrThr190AlaGlyAlaCysThr270AlaThrAlaAlaCys350CysGlyCysG].yA]a430AlaGlyAlaGlyGlyThrThr175ThrAlaAlaAlaThr255CysAlaGlyGlyCys335GlyGlyAlaThrAla415AlaGlyGlyThrThr495AlaGly160AlaAlaAlaCysAla240GlyAlaCysGlyGly320CysG]yCysThrAla400AlaThrThrCysThr480ThrAlaGlyAlaAla545CysAlaAlaAlaGly625CysGlyAlaThrThr705(;]yThrThrAlaThr785AlaGlyAlaG]yGlyThrAlaGly530ThrCysGlyAlaAla610GlyThrAlaThrGly690;lyG]yThrGlyThr770CysGlyAlaGlyAla850AlaThrThr515ThrAlaAlaAlaThr595ThrAlaAlaAlaThr675GlyAlaThrGlyGly755ThrAlaCysAlaThr835AlaG]yAla500GlyThrAlaAlaAla580ThrGlyCysGlyGly660AlaAlaThr〔;lyGly740GlyGlyThrAlaThr820GlyThrAlaAlaCysAlaGlyAla565AlaAlaAlaCysAla645AlaAlaThrGlyThr725ThrCysAlaGlyGly805Gly(;lyThrThrAlaThrThrAla550ThrAlaThrGlyAla630GlyThrGlyAlaThr710ThrCysCysGlyThr790AlaGlyAlaThrThrAlaThrThr535AlaAlaG]yCysAla615AlaAlaThrAla695ThrThrGlyCysAla775CysGlyAlaA〗aThr855GlyA丄a520AlaCysThrCysThr600AlaThrAlaGly咖AlaAlaAlaThrThr760ThrA.laThrCysGlyGlyThrGly505GlyAlaGlyThrAla585GlyThrAlaGlyThr665Ala'J'hrAlaThrCys745AlaGlyAlaThrAla825GlyAlaALaAlaGlyThrGlyCys570AlaAlaAlaAlaAla650ThrCysAlaGlyGly730AlaThrAlaCysCys810AlaThrThrCysThrAlaAlaThr555ThrAlaAlaGlyThr635AlaCysGJyThrG]y715GlyG〗yThrThrAla795AlaCysGlyAlaThrThrAlaGly540GlyThrThrAlaThr620AlaAlaAlaAlaGly700CysCysAlaCysGly780G]yGlyCysGlyGly860AlaGlyGly525CysCysAlaCysAla605GlyAlaGlyThrAla685GlyThrThrCysGly765ThrAlaCysGlyAla845CysAla510AlaThrThrThrThr590GlyAlaThrAlaGly670ThrGlyAlaCysThr750GlyGlyGlyCysGly830AlaGlyAlaCysGlyCysThr575AlaGlyAlaGlyAla655AlaAlaGlyThrThr735GlyAlaThrGlyAla815ThrGlyAlaGlyGlyAlaThr560ThrAlaC'lyThrAla640ThrA]aThrAlaThr720CysAlaThrGlyAla800ThrGlyThrAlaGlyAaThrThr865AlaAlaAlaThrThr945ThrAlaGlyThrThrGlyThrCysCysThrAlaAlaThrCysAlaGlyGlyCysThrThrCysCys930ThrAlaThrGlyThr1010Gly1025Ala1040Ala1055Gly1070Ala1085Thr1100Cys1115Thr腦Thr1145Ala1]60Cys1175Thr1190Thr1205Thr1220GlyCysAla915ThrA]aCysCysThr995CysCysAla900CysCysThrThrAla980AlaAla885GlyAlaThrGlyThr965AlaGly870ThrAlaThrAlaAla950A]aAlaAlaCysThrGlyThr935ThrGlyCysAlaThrThrPly920ThrThrA]aThrGlyCysGly905ThrThrCysGlyGly985Ala柳GlyCysThrAlaAla970Cys875GlyCysAlaGlyGly955AlaThrGlyCysA〗aCys940GlyAlaAlaThrGlyThr925CysThrGlyAlaGlyCys910ThrGlyGlyThrAla990Gly895ThrThrAlaGlyGly975Thr880AlaThrThrThrAla960ThrCys1000CysAlaCysGlyAlaThrAlaThrThrAlaThrThrGlyGlyThrGlyCysThfThrGlyGlyGlyA]aGlyCysGlyGlyAlaCysAlaThrAlaCysCysAlaCysAlaGlyThrThrCysThrGlyCysThrCysGlyAlaThrA]aAlaAlaA丄aThrCysGlyAlaAlaG]yCysThr1015Cys1030Cys画Gly1060Ala1075Cys1090Cys1105Cyslt20Gly1135Gly1150Ala1165Ala腦Ala1195Cys1210Thr1225ThrThrGlyThrCysCysAlaGlyGlyThrGlyCysAidCysCysCysCysAlaAlaAlaCysGly1005ThrGlyCysGlyAlaThrthr1020ThrAlaThrCysGlyThrAla1035GlyThrThrThrGlyAlaAla腳CysAlaA[aA丄aThrGlyGly065ThrCysGlyThrGlyThrGly1080Gl.yAlaCysAlaAlaCysAla1095ALaThrCysCysThrThrGly1110GlyGlyThrAlaGlyCysAla1125ThrGlyCysCysA]aThrG]y1140ThrCysThrGlyCysAlaThr1155CysThrGlyThrThrAlaThr1170CysGlyCysThrThrCysGly185ThrGlyAlaAlaG]yCysAla200AlaThrCysAlaGlyALaThr1215AlaGlyGlyThrThrAlaThr1230GlyThrCysGlyThrThrGlyCysGlyAlaAlaThrThrCysGlyGJyCys(;lyG]yGlyCysThrAlaAla1235Thr1250Ala1265Ala1280Cys1295Gly1310Ala1325Ala13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涉及一种高温耐酸性α-淀粉酶的突变株及其构建方法，是将地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因经突变后(Leu134→Arg和Ser320→Ala)获得的高温耐酸性α-淀粉酶基因，通过构建打靶载体，利用同源重组的方法，将其整合到出发菌株地衣芽孢杆菌的基因组DNA中，得到了地衣芽孢杆菌突变株，实现高温耐酸性α-淀粉酶的同源高效表达。本发明中的突变株所产α-淀粉酶在本身耐高温的基础上，酸稳定性也有了明显地提高，为我国酒精、淀粉糖化等淀粉深加工行业提供了更好的工艺条件，降低了成本，节省了能源和工业用粮，满足了一些在酸性条件下进行淀粉原料液化工艺的要求。文档编号C12N15/56GK101298604SQ20081005362公开日2008年11月5日申请日期2008年6月25日优先权日2008年6月25日发明者刘逸寒,玉李,杜连祥,王建玲,王春霞,路福平申请人:天津科技大学