专利名称：利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域和纳米技术领域，涉及一种利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法。
背景技术：
纳米技术作为本世纪的前沿技术已受到许多国家的极大重视，但是伴随纳米科学技术的高速发展，不仅使人们已经认识到纳米材料的优点和巨大的潜力，同时纳米材料也会对人类产生许多负面效应。纳米材料由于尺寸小，具有特殊的理化性质，与常规物质相比更容易进入细胞并影响细胞的功能。已有报道显示具有纳米尺度的颗粒会引发生物体免疫系统的炎症反应，造成哮喘甚至心血管疾病。随着纳米材料越来越多的出现在人类的生产和生活中，纳米材料生物效应(安全性)的研究迫在眉睫，这将关系到纳米技术的广泛应用及长远发展。
生命的遗传是基因组DNA准确地复制的过程，复制过程中突变率的改变必将引起基因突变，从而诱发癌变，因此分析不同种类的纳米材料对基因扩增准确度所带来的影响可以从分子水平探索纳米材料的生物安全性问题。基因不仅可以在细胞中进行复制，在体外也可以通过聚合酶实现基因扩增。其中聚合酶链式反应(PCR)是一种在体外模拟DNA体内复制的基因扩增技术，能在耐热DNA聚合酶的作用及特异性引物的引导下，在很短的时间内就能在一个试管内实现只有在生物体细胞分裂增殖时才出现的基因的大量复制，一般来说，在数小时内就可以将目的基因扩增至百万倍。此外，滚环扩增技术(RCA)、链置换扩增技术(SDA)等技术也可以实现体外基因扩增。因此将纳米材料添加到基因扩增体系，对产物突变率的检测可以研究纳米材料对突变率的影响，从分子水平研究纳米材料的生物安全性。
对基因突变的鉴定，最为关键的是建立一个高效、稳定的检测体系。传统的基因扩增突变的检测采用lac I基因突变研究系统，它以lac I作为突变测定的靶基因，同时以lacZ作为报告基因，通过常规的蓝白颜色筛选实验来鉴定靶基因的突变。因为PCR等技术所产生的体外基因突变是一种低频率事件，这种根据菌落的颜色来筛选靶基因突变的方法是一种非选择性方法，所以在进行大量分析时要消耗大量的原材料和劳动力。近年来报道的rpsl基因正向选择系统中，只有rpsl突变型菌能够在含有链霉素的平板形成菌落，实现正向选择靶基因突变子的目的。此外，rpsl分析背景较低，因为rpsL的自发突变率低至10-6，远低于同类筛选体系。目前，rpsl基因正向选择系统以其有效性和实用性成为体外基因扩增保真度检测的有力工具。本发明即利用rpsl基因正向选择系统考察纳米材料的分子安全性问题，不需lacI突变研究系统中大量试剂的耗费，而且大大节省了对突变率检测的工作量，可以实现大规模的突变率的筛选。
发明内容
本发明的目的在于结合分子生物学技术，提供一种利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法，本方法通过在体外基因扩增反应体系中添加纳米材料，利用正向选择系统对反应产物的突变进行筛选，达到定量检测纳米材料生物安全性的目的；本方法技术先进，检测结果准确可靠，使用成本较低。
本发明是通过以下技术方案来实现的 一种利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法，检测方法的步骤是 (1)纳米材料的灭菌将所检测的纳米材料除菌、灭DNA酶和RNA酶； (2).纳米材料悬浮溶液的制备；以纳米材料完全悬浮且在室温下可静止放置至少10min而不发生聚积沉淀现象为准； (3)体外扩增带有rpsl基因的质粒模板 ①.体外基因扩增体系的配置具体表现在dNTP、模板、Mg2+、引物的添加量应根据模板和体外扩增技术来选择，且在上述反应体系中加入纳米材料悬浮溶液； ②.基因扩增条件的设定与运行反应体系中的预变性、变性及退火各阶段的温度和对应时间根据模板和引物融解温度来选择，或者反应温度根据所用聚合酶的温度来选择，延伸时间根据所扩增片段的长度来选择； ③.基因扩增产物的纯化扩增产物用限制性内切酶在37℃进行消化反应，然后纯化； (4).基因扩增产物的自身连接经纯化的扩增产物用T4 DNA连接酶在16℃连接； (5).重组质粒的转化和正向选择系统采用CaCl2方法转化MF101感受态细胞，转化后的MF101细胞涂板于含氨苄青霉素的100μg/ml平板上以确定转化细胞的总数，涂板于含氨苄青霉素和链霉素100μg/ml平板上以确定rpsL基因突变的总数； (6).基因扩增突变频率和错误率的计算 突变频率＝突变总数÷转化细胞总数； 错误率＝突变频率÷(130×25)； 其中130为构成rpsL表型变化的氨基酸数，25为模板加倍数。
而且，所述的纳米材料是指水溶性和非水溶性产品、修饰与未修饰产品，还包括颗粒大小各异的产品，或者具备以上一种或多种不同性质组合的产品。
而且，所述的纳米材料悬浮溶液是指纳米材料均匀分散在纯水或者PCR缓冲液或者其它适用于基因扩增反应的液相中。
而且，所述的体外基因扩增技术包括聚合酶链式反应、滚环扩增技术、链置换扩增技术、低拷贝数DNA扩增、长片段PCR、复杂模板PCR、反复扩增的PCR以及含有较多重复序列的DNA片段的扩增。
本发明的优点和有益效果是 1.本发明是从分子水平研究纳米材料的生物安全性，在体外基因扩增体系中加入纳米材料，对其造成的基因突变频率具有定量准确的特点。
2.本发明通过体外基因扩增实验来考察纳米材料的生物安全性，利用PCR等技术在几个小时内实现基因的大量扩增，扩增方法技术成熟，易于操作，是普通细胞在短时间内无法达到的。
3.本发明采用rpsl基因正向选择系统，与已有的其它选择系统相比，能够大量节约试剂，节省操作的工作量，检测结果准确可靠，使用成本较低，适用于对纳米材料安全性的大规模检测。
图1为本发明的技术路线图； 图2为本发明中rpsl基因正向选择系统的结果图(图2a.为含氨苄青霉素的平板1/100转化细胞总数；图2b.为含氨苄青霉素和链霉素平板1/10rpsl突变型菌数)。
具体实施例方式 本发明通过以下实施例进一步详述，但以下的实施例是说明性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明所涉及的利用体外基因扩增的突变率对纳米材料生物安全性的定量检测，其具体详细的操作方法如下 1.纳米材料的灭菌 为适合体外基因扩增反应的特殊需要，所有用于制备纳米材料悬浮溶液的纳米材料均需用一定的方法除菌、灭DNA酶和RNA酶。
2.纳米材料悬浮溶液的制备 纳米材料固体粉末可以用市售产品，属于现有技术，不再详细叙述。以配置浓度为10mg/mL(W/V)的纳米材料悬浮溶液为例，先精确称取10mg已灭菌的纳米材料置于已灭菌的1.5mL的小离心管中，用移液器缓慢加入灭菌水至体积为1mL；随后盖紧离心管盖置于超声波振荡器中超声处理一定时间，具体的超声功率及超声时间应以纳米材料完全悬浮且在室温下可静止放置至少10min不发生聚积沉淀现象为准。
3.体外基因扩增体系的配置 体外基因扩增体系依据现有技术，根据扩增DNA技术的不同而各不相同。具体表现在dNTP、模板、Mg2+、引物的添加量应根据不同的模板和不同的扩增技术来选择；并且在上述反应体系中加入一定体积的纳米材料悬浮溶液。
反应体系中的H2O为双蒸水及以上级别水，体系中水的添加量应根据纳米材料悬浮溶液添加的体积进行调整，即应扣除相应添加的纳米材料悬浮溶液的体积。
4.基因扩增条件的设定与运行 PCR反应条件中的预变性，变性及退火各阶段的温度和对应时间应根据不同模板和引物融解温度来选择；其它的扩增技术的反应温度根据所用聚合酶的合适温度来选择；其中的延伸时间根据所扩增片段的长度来选择； 5.扩增产物用限制性内切酶进行消化反应(37℃)，然后加以纯化。
6.经纯化的扩增产物用T4 DNA连接酶在16℃连接，然后转化MF101感受态细胞。感受态细胞的制备采用CaCl2的方法。转化后的MF101细胞涂板于含氨苄青霉素的平板(100μg/ml)上来确定转化细胞的总数；涂板于含氨苄青霉素和链霉素(100μg/ml)平板上以确定rpsL基因突变的总数。
突变频率＝突变总数÷转化细胞总数。
错误率＝突变频率÷(130×25)。
130为构成rpsL表型变化的氨基酸数，25为模板加倍数。
本发明在正向选择体系中的扩增产物带有rpsl基因，并且可利用链霉素进行正向筛选。
上述的体外基因扩增技术包括聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增技术(RCA)、链置换扩增技术(SDA)、低拷贝数DNA扩增、长片段PCR、复杂模板PCR、反复扩增的PCR以及含有较多重复序列的DNA片段的扩增。
上述纳米材料是指包括水溶性和非水溶性产品，修饰(如羟基化或羧基化等)与未修饰产品，还包括颗粒大小各异的产品，或者具备以上一种或多种不同性质组合的产品。需要说明的是本实施例只叙述了水溶性纳米材料的检测，其他如非水溶性产品、修饰(如羟基化或羧基化等)与未修饰产品、颗粒大小各异的产品以及具备以上一种或多种不同性质组合的产品的使用方式与功效与水溶性纳米材料基本相同。
具体实例1PCR的突变率对纳米Ag颗粒生物安全性的定量检测 1.PCR反应 .按以下顺序和添加量配置体系于薄壁PCR管中。
ddH2O24.4μL 10×PCR缓冲液(含Mg2+)5μL dNTP底物(2.5mM) 5μL 引物1(2.0μM)5μL 引物2(2.0μM)5μL 模板(3.75ng/μL) 2.6μL 纳米Ag颗粒(0.24μg/μL) 2μL Taq酶(5U/μL)0.5μL 其中，模板为线性化的质粒pMOL21，引物为5’端带有生物素标记，Taq酶购自北京三博远志生物工程公司。
引物序列分别为 引物15′-biotin-AAAAAAAAAAACGCGTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTAC-3′ 引物25′-AAAAAAAAAAACGCGTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGT-3′ 2.按以下条件在PCR仪上设定循环条件进行PCR热循环。
3.PCR产物与等体积的磁珠混合，轻轻旋转混合后室温反应30分钟。离心回收磁珠，用10个单位的Mlu I，37℃酶切12小时以上释放PCR产物。磁珠用一个磁性架回收，并对酶切产物加以纯化。
4.经纯化的PCR产物用T4 DNA连接酶在16℃连接12小时，然后转化MF101感受态细胞。感受态细胞的制备采用Cacl2的方法。转化后的MF101细胞涂板于含氨苄青霉素的平板(100μg/ml)上来确定转化细胞的总数；涂板于含氨苄青霉素和链霉素(100μg/ml)平板上以确定rpsL基因突变的总数。
突变频率＝突变总数÷转化细胞总数。
错误率＝突变频率÷(130×30)。
130为构成rpsL表型变化的氨基酸数，30为模板加倍数。
从图2中可以看出，转化细胞数量巨大(图2a)，10毫升转化培养液中取100微升(稀释100倍)涂板的细胞已经布满了LB平板；但是只有rpsL突变型细菌才能够在含有两种抗生素的平板上生长(图2b，10毫升转化培养液中取1000微升(稀释10倍))。因此rpsl基因正向选择系统能有效的节约成本和工作量。
具体实例2 等温扩增的突变率对纳米Au(10nm)胶体生物安全性的定量检测 1.滚环扩增反应体系的配置 (1).样品加热变性及引物与质粒退火反应 ddH2O4.4μl 10×buffer 1.0μl 随机引物(100μM) 2.5μl sample(1μg/ml) 1.0μl 95℃加热3分钟，然后置于冰上15分钟。
(2).扩增反应dNTP(10mM) 0.5μl 100XBSA 0.1μl Phi29 DNApolymerase(10U/μl) 0.5μl 加入纳米Au(10nm)胶体，使最终反应体系为20μl，30℃温育过夜。
(3).热失活phi29DNA聚合酶65℃，10分钟。
2.扩增产物经纯化后，用10个单位的EcoR I，37℃酶切6小时以上，然后加以纯化。
3.经纯化的扩增产物进行上例的第五步操作，计算突变频率。
其它未尽事宜同于实施例1。
权利要求
1.一种利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法，其特征在于检测方法的步骤是
(1).纳米材料的灭菌将所检测的纳米材料除菌、灭DNA酶和RNA酶；
(2).纳米材料悬浮溶液的制备；以纳米材料完全悬浮且在室温下可静止放置至少10min而不发生聚积沉淀现象为准；
(3).体外扩增带有rpsl基因的质粒模板
①.体外基因扩增体系的配置具体表现在dNTP、模板、Mg2+、引物的添加量应根据模板和体外扩增技术来选择，且在上述反应体系中加入纳米材料悬浮溶液；
②.基因扩增条件的设定与运行反应体系中的预变性、变性及退火各阶段的温度和对应时间根据模板和引物融解温度来选择，或者反应温度根据所用聚合酶的温度来选择，延伸时间根据所扩增片段的长度来选择；
③.基因扩增产物的纯化扩增产物用限制性内切酶在37℃进行消化反应，然后纯化；
(4).基因扩增产物的自身连接经纯化的扩增产物用T4 DNA连接酶在16℃连接；
(5).重组质粒的转化和正向选择系统采用CaCl2方法转化MF101感受态细胞，转化后的MF101细胞涂板于含氨苄青霉素的100μg/ml平板上以确定转化细胞的总数，涂板于含氨苄青霉素和链霉素100μg/ml平板上以确定rpsL基因突变的总数；
(6).基因扩增突变频率和错误率的计算
突变频率＝突变总数÷转化细胞总数；
错误率＝突变频率÷(130×25)；
其中130为构成rpsL表型变化的氨基酸数，25为模板加倍数。
2.根据权利要求1所述的利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法，其特征在于所述的纳米材料是指水溶性和非水溶性产品、修饰与未修饰产品，还包括颗粒大小各异的产品，或者具备以上一种或多种不同性质组合的产品。
3.根据权利要求1所述的利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法，其特征在于所述的纳米材料悬浮溶液是指纳米材料均匀分散在纯水或者PCR缓冲液或者其它适用于基因扩增反应的液相中。
4.根据权利要求1所述的利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法，其特征在于所述的体外基因扩增技术包括聚合酶链式反应、滚环扩增技术、链置换扩增技术、低拷贝数DNA扩增、长片段PCR、复杂模板PCR、反复扩增的PCR以及含有较多重复序列的DNA片段的扩增。
全文摘要
本发明涉及一种利用分子生物学技术定量检测纳米材料生物安全性的方法，该方法是通过检测纳米材料对体外基因扩增的影响，从而实现定量衡量不同类型纳米材料的生物安全性。本发明利用体外基因扩增技术和基因重组技术，可对于纳米材料所引起的体外基因突变率进行精确地计算；此外，利用高效的rpsl基因正向选择系统，可在进行大规模分析时节省大量的原材料和劳动力。
文档编号C12Q1/68GK101280341SQ20081005317
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月21日 优先权日2008年5月21日
发明者张治洲, 沈汵超, 刘清岱, 杨文娟, 林 贺 申请人:天津科技大学