piggyBac转座子表达载体和转基因猪及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种piggyBac转座子表达载体和转基因猪及其构建方法，属于基因工程领域。所述表达载体是通过将含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段连接到pCyL50质粒上构建得到的。将该载体导入猪的基因组，并采用体细胞核移植技术生产出转基因猪。本发明的表达载体具有piggyBac转座子，极大地提高了转基因效率，且将普通质粒串联重组的转基因整合模式变成了单位点单拷贝整合，更好的模拟生物基因的内环境。本发明的转基因猪的构建方法为各种转基因动物的制备提供了一条新的思路，同时也对转基因动物生物模型的制作提供一种简便高效的方法。
【专利说明】piggyBac转座子表达载体和转基因猪及其构建方法
【技术领域】[0001]本发明属于基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种携带报告基因和抗性基因的piggyBac转座子表达载体:pPB-CMV_Neo/EGFP及其构建方法，以及piggyBac转座子转基因猪及其构建方法。
【背景技术】
[0002]转基因的概念是随着研究者首次通过原核显微注射法生产出携带外源基因的小鼠而产生的。在过去的三十三年时间里，为提高转基因动物的制备效率，研究者们发展了数种方法，但是最受研究者们欢迎的还是通过将线性化的转基因DNA利用原核显微注射法来进行转基因动物的制备。利用原核显微注射法生产转基因动物有十分明显的优点:如它所需要的仪器设备相对简单，而其他方法都会对仪器设备有特殊的要求，特别是慢病毒介导法，需要特制的仪器设备以提高安全性；但最重要的还是因为原核显微注射法制备转基因动物具有很好的稳定性，尤其在转基因小鼠制备上，如果有足够的受精卵进行原核显微注射，就可以保证获得转基因小鼠。然而在制备转基因家畜大型哺乳动物上，如牛、羊、猪等，由于卵母细胞中的高脂类含量，使得常规的光学显微镜因难以分辨清细胞核的结构，或是在操作过程中需要处理单个细胞胚胎，因此使用原核显微注射法制备转基因家畜的效率并不闻。
[0003]另一种转基因动物制备方法是胞浆内精子注射法，即利用精子作为转基因载体，来实现外源基因的插入，然而与原核显微注射法一样，该方法在转基因小鼠制备效率上高，但被研究者证明在转基因猪的制备上却被证明效率不高，因此也不适合转基因家畜的制备。
[0004]目前，通过体细胞核移植的方法来生产家畜已经得到了广泛的应用，且该技术已经越来越成熟。然而利用该方法生产动物效率只有2%。在进行体细胞核移植之前，还需要对体细胞进行转基因操作，如果这一步骤的效率也不高，将大大降低最后转基因动物的制备效率。通过对体细胞进行转基因改造，再进行体细胞核移植，成为一种制备转基因动物切实可行的办法。而对体细胞进行转基因改造所利用载体，经历了从早期的随机整合的质粒DNA载体、病毒载体,到睡美人(Sleeping Beauty)转座子系统。近年来另外一种转座子系统，即PiggyBac (pB)转座子系统，最初是从粉纹夜蛾中分离出来的，也已经应用于转基因领域，并且取得了大量的研究进展。但暂并没有见到利用PiggyBac (PB)转座子系统结合体细胞克隆法制备转基因动物的相关报道。
【发明内容】
[0005]基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种piggyBac转座子表达载体和转基因猪及其构建方法。
[0006]为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案:
[0007]—种piggyBac转座子表达载体的构建方法,包括以下步骤:[0008](I)、以 SEQ ID NO: 5 的质粒为模板，SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO: 2 为引物，PCR 扩增出序列号为SEQ ID NO: 3的含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段； [0009](2)、分别用SalI酶切步骤I的loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段与质粒pCyL50，纯化，连接，转化感受态细胞，挑选单克隆菌落进行扩大培养，提取阳性克隆的质粒，SalI进行酶切鉴定，得到piggyBac转座子表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP，序列号为SEQID N0:4。
[0010]在其中一个实施例中，步骤(I)中所述PCR扩增的反应程序为:98°C 3min ;98°C 30s, 65°C 30s, 72°C 3min ;35 个循环；72°C IOmin0
[0011 ] 本发明还提供了上述构建方法构建得到的piggyBac转座子表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP，序列号为 SEQ ID N0:4。
[0012]本发明还提供了 piggyBac转座子转基因猪的构建方法，包括以下步骤:
[0013](I)、将表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB混合共转染猪胎儿成纤维细胞系，筛选可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系；
[0014](2)、将获得的单克隆转基因细胞系作为核供体细胞，注射到卵母细胞中，构建重构胚胎，采用常规育种技术进行培育，即可得到PiggyBac转座子的转基因猪。
[0015]在其中一个实施例中，所述共转染的步骤为:
[0016](I)、把表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB混合加入到1000 μ L Opt1-MEM'? I 中，混匀；
[0017](2)、加入7yL用前混匀的PLUS?Reagents，混匀后静置5min ；
[0018](3)、加入 21 μ L 用前混匀的 Lipofectamine?LTX，混匀后静置 30min ；
[0019](4)、用DMEM洗单层细胞1_2次，加入1000 μ L DMEM，再把上述(3)的混合液左右轻晃混匀，4-6h后换上含有10%胎牛血清的细胞生长培养基，转染48小时。
[0020]在其中一个实施例中，所述表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB的摩尔数比为3:1。
[0021]在其中一个实施例中，所述可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系的筛选步骤为:
[0022]转染48小时后，弃培养基，用PBS洗1-2遍单层细胞，加500 μ g/mLG418筛选浓度培养基4mL，隔天换液，置于39°C，5%C02，饱和湿度继续培养至有单个的细胞克隆出现时，分离出单个的细胞克隆，并做扩大培养，即得单克隆转基因细胞系。
[0023]本发明还提供了上述构建方法构建得到的piggyBac转座子转基因猪。
[0024]本发明 申请人:已经证明利用piggyBac (pB)转座子系统对哺乳动物细胞系进行转基因操作是十分高效的。PiggyBac (pB)转座子系统包括2个质粒载体:pB转座子载体和mPB转座酶载体，其中pB转座子载体携带着转座元件和目的基因，转座元件可使PB转座子载体以转座方式整合进入细胞基因组，目的基因则是本发明 申请人:所要研究的对象；mPB转座酶载体则会表达转座酶，负责对PB转座子载体转座元件外的无用序列进行切割，提高PB转座子载体的整合效率。而且，由于PiggyBac (pB)转座子系统的主动整合特性，除了整合效率高之外，它较普通质粒载体还具有单拷贝多位点整合的特点，这样进一步提高转基因动物的生产效率。
[0025]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:[0026]1、本发明的表达载体采用piggyBac转座系统，将普通质粒串联重组的转基因整合模式，变成了单位点单拷贝整合，更好的模拟生物基因的内环境。该转座系统含有多克隆位点MCS，可以方便地进行载体重构建，以便研究感兴趣的基因；还携带有EGFP绿色荧光标记、Neo抗性筛选标记，便于检测和筛选细胞系，其1xP重组位点，也可以方便后期删除。
[0027]2、本发明的转基因猪的构建方法提供了一种高效制备转基因动物的方法，为各种转基因动物的制备提供了一条新的思路，同时也对转基因动物生物模型的制作提供一种简便高效的方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为本发明实施例1中loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段的PCR扩增结果电泳鉴定图谱，其中M为marker，I为EGFP-Neo融合双标记片段的PCR产物；
[0029]图2为本发明实施例1中构建得到的载体pPB-CMV-Neo/EGFP的图谱，其中，PB3’和PB5’为转座子载体中的转座元件，MCS为多克隆位点，CMV为Neo/EGFP融合基因的启动子，Neo为新霉素抗性基因，EGFP为绿色荧光蛋白基因，BGH polyA为终止信号，AmpiR为氨苄抗性基因；
[0030]图3为本发明实施例3中的转基因猪绿色荧光检测结果，其中A部分为活体照片，B部分为解剖照片，蓝光为荧光灯蓝光激发条件下所拍照片，自然光为自然条件下所拍照片；转基因代表获得的转基因猪，野生型为同期出生的同品种杜洛克非转基因猪。
[0031]图4为本发明实施例3中的转基因猪PCR、Southern blot结果，其中A部分，M为DNA Marker, I至8为8只不同转基因猪的DNA样品；9，10为非转基因猪DNA对照；最后一条泳道是质粒对照；A部分第一张图代表目的基因EGFP片段PCR扩增电泳结果，第二张图代表转座酶质粒PCR扩增电泳结果，第三张图是β-actin为内参基因对照；B部分，M为DIG标记的Marker，IC是将带有EG FP基因的转基因质粒用于Southern杂交的I个拷贝的阳性对照，3C是将带有EGFP基因的转基因质粒用于Southern杂交的5个拷贝的阳性对照，5C是将带有EGFP基因的转基因质粒用于Southern杂交的10个拷贝的阳性对照；1至8为8只不同转基因猪DNA的EGFP基因片段southern blot杂交结果，9，10为非转基因猪DNA对
昭.>、、、?
[0032]图5为本发明实施例4中的piggyBac转座子系统与普通质粒筛选绿色突光单克隆细胞团的效率对比图，其中A部分为转染后细胞在蓝色荧光灯下的成像，左边是普通的EGFP质粒
[0033]pT2AL200R175-CAGGS-EGFP转染猪胎儿成纤维细胞的结果，右边为piggyBac转座子系统转染猪胎儿成纤维细胞的结果，B部分是分别统计piggyBac转座子系统和普通EGFP质粒
[0034]pT2AL200Rl75-CAGGS-EGFP转染猪胎儿成纤维细胞所获得的阳性细胞克隆团数。【具体实施方式】
[0035]以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
[0036]如无特殊说明，以下实施例中所使用的试剂均来源于市售，操作方法均为现有常规操作方法。[0037]实施例1携带报告基因与抗性基因的piggyBac转座子表达载体φΡΒ-CMV-Neo/EGFP的构建
[0038]包括以下步骤:
[0039]1、扩增含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段
[0040]以质粒PPSP-PB-neoEGFP-XynB-manA(SEQ ID NO: 5，这个质粒是经过 申请人:采用改造常规手段，PCR、酶切以及连接的方法改造而成的)为模板，设计引物，5'加酶切位点Sail，扩增出含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段；引物序列分别如下:
[0041]Neo/EGFP-F:
[0042]5’ -GTCGACCGTGAGGCGTGCTTGTCAATGC-3’ (SEQ ID NO:1);Neo/EGFP-R:
[0043]5’-GTCGACGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCA-3’ (SEQ ID NO:2)PCR 的反应体系为
[0044]
【权利要求】
1.一种piggyBac转座子表达载体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤: (1)、以SEQID NO: 5的质粒为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2为引物，PCR扩增出序列为SEQ ID NO:3的含有loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段； (2)、分别用SalI酶切步骤I的loxP-Neo/EGFP基因表达盒的融合片段与质粒pCyL50，纯化，连接，转化感受态细胞，挑选单克隆菌落进行扩大培养，提取阳性克隆的质粒，SalI进行酶切鉴定，得到PiggyBac转座子表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP，序列为SEQ ID N0:4。
2.根据权利要求1所述的piggyBac转座子表达载体的构建方法,其特征在于,步骤(I)中所述 PCR 扩增的反应程序为:98°C 3min ；98°C 30s, 65°C 30s, 72°C 3min ;35 个循环；72°C IOmin。
3.权利要求1或2所述的构建方法构建得到的piggyBac转座子表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP，序列为 SEQ ID N0:4。
4.一种piggyBac转座子的转基因猪的构建方法,其特征在于,包括以下步骤: (1)、将权利要求3所述的表达载体与转座酶质粒mPB混合共转染猪胎儿成纤维细胞系，筛选可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系； (2)、将获得的单克隆转基因细胞系作为核供体细胞，注射到卵母细胞中，构建重构胚胎，采用常规育种技术进行培育，即可得到PiggyBac转座子的转基因猪。
5.根据权利要求4所述的piggyBac转座子的转基因猪的构建方法，其特征在于，所述共转染的步骤为: (1)、把表达载体pPB-CMV-N eo/EGFP与转座酶质粒mPB混合加入到1000 μ L Opt1-MEM? I 中，混匀； (2)、加入7μ L用前混匀的PLUS?Reagents，混匀后静置5min ； (3)、加入21μ L用前混匀的Lipofectamine?LTX，混匀后静置30min ； (4)、用DMEM洗单层细胞1-2次，加入1000μ L DMEM，再把上述(3)的混合液左右轻晃混匀，4-6h后换上含有10%胎牛血清的细胞生长培养基，转染48小时。
6.根据权利要求4或5所述的piggyBac转座子的转基因猪的构建方法，其特征在于，所述表达载体pPB-CMV-Neo/EGFP与转座酶质粒mPB的摩尔数比为3:1。
7.根据权利要求4或5所述的piggyBac转座子的转基因猪的构建方法，其特征在于，所述可稳定表达载体的单克隆转基因细胞系的筛选步骤为: 转染48小时后，弃培养基，用PBS洗1-2遍单层细胞，加500 μ g/mLG418筛选浓度培养基4mL，隔天换液，置于39°C，5%C02，饱和湿度继续培养至有单个的细胞克隆出现时，分离出单个的细胞克隆，并做扩大培养，即得单克隆转基因细胞系。
8.权利要求4-7任一项所述的构建方法构建得到的piggyBac转座子的转基因猪。
【文档编号】C12N15/66GK103468732SQ201310320502
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年7月26日 优先权日:2013年7月26日
【发明者】徐志谦, 吴珍芳, 邹娴, 李紫聪, 刘德武, 张献伟, 曾芳, 周荣, 曾海玉 申请人:吴珍芳, 李紫聪