重组正电荷多肽干扰素及在抗肿瘤和抗病毒治疗中的应用【
技术领域：
】[0001]本发明采用cDNA文库方法，筛选出能增强干扰素抗肿瘤作用的多肤片段，重组正电荷多肤干扰素在抗肿瘤和抗病毒治疗中的应用。【
背景技术：
】[0002]干扰素是1957年英国科学家Isaacs和Lindenmann在研究病毒干扰现象时发现的，是一种由病毒感染诱导产生的、具有抗病毒作用的细胞因子，能够抑制病毒复制，是一类高活性的糖蛋白。近年来研究发现干扰素除抗病毒活性外，还具有广泛调节功能，如调节和控制细胞复制、增生及机体免疫系统功能，在恶性肿瘤、免疫疾病、血管增生性疾病和纤维化疾病等病理状态中发挥作用。但干扰素在人体含量极低，又无适当的制造方式，因而限制了其临床应用的价值。直到最近，生物技术突飞猛进，干扰素才得W量产而广泛的应用于临床。主要通过抑制肿瘤细胞增生、促进肿瘤细胞调亡、抑制癌基因表达、调节免疫、抗肿瘤血管生成、抑制肿瘤转移、与其他抗癌药物协同、诱导肿瘤肿瘤细胞分化等机制抗肿瘤。干扰素目前主要分为S大类：IFN-a，IFN-0和IFN-丫，由于IFN-a和IFN-0在理化特性、抗原性及受体等方面均有许多相似之处，并发挥相似的生物学效应，故W往IFN-a和IFN-0被合称为I型干扰素，而IFN-丫则归为II型干扰素。[000引cDNA文库是W特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA(cDNA)与适当的载体（常用瞻菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，该样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。cDNA文库比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，同时含有大量的重复序列。采用电泳分离和杂交的方法，都难W直接分离到目的基因。因此从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因相对于从mRNA出发的cDNA克隆比较困难。高等生物通常约具有105种不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都仅有15%左右的基因得W表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。[0004]综上所述，干扰素作为一种已成熟应用于临床的抗肿瘤药物，具有广谱抗肿瘤，调节免疫，抑制肿瘤血管形成等作用，然而，临床实践证明现有干扰素仅对部分实体肿瘤和白血病治疗敏感，与一线抗肿瘤药物相比疗效有限，更多的时候被用作辅助抗肿瘤和免疫调节药物，其临床应用仍不够广泛。为提高干扰素抗肿瘤的效果，我们通过cDNA文库筛选的方式，将干扰素与多肤片段融合，形成重组多肤-干扰素，通过体外实验筛选出比单纯干扰素更有效抑制肿瘤生长的干扰素-多肤组合。【
发明内容】[0005]本发明通过cDNA文库的方式，将多肤片段与抗性蛋白（卡拉霉素）同一阅读框内克隆至载体质粒，通过抗生素筛选之后，获得同一开放阅读框内的ATG-多肤-卡拉霉素融合蛋白文库，将此文库酶切克隆至真核表达系统并与干扰素3'端连接成干扰素-多肤文库质粒，将此文库质粒包装成病毒后感染预先稳转带有报告基因的肿瘤细胞，通过流式细胞仪分选出报告巧光最强的肿瘤细胞，提取DNA鉴定该细胞中的多肤序列，筛选出可能增强干扰素效果的多肤片段，并采用巧光素酶实验和MIT实验对其抗肿瘤效果进行验证，证实重组正电荷多肤干扰素能增强抗肿瘤效果。【附图说明】[0006]图1是OriginalSequence;IFN-BamHI-人胎盘生长因子（Placentagrowthfactor,PGF)基因序列。[0007]图2是干扰素反应元件-巧光素酶实验对照图一。[0008]图3是干扰素反应元件-巧光素酶实验对照图二。[0009]图4是MTT试验对照图一。[0010]图5是MTT试验对照图二。【具体实施方式】[0011]一、构建多肤片段克隆载体（PolypeptidesCloningVector)[0012]在卡拉霉素启动子后插入ATG和BamH/EcoRV酶切位点，并删除卡拉霉素的ATG起始蛋氨酸序列，确保多肤插入BamHI和EcoRV后和卡拉霉素在同一开放阅读框内（openreading化ame)，否则，细菌将不能在含有卡拉霉素的培养基中存活。[0013]二、构建IFNa/丫-多肤重组基因表达载体巧ecombination-IFN-ExpressionVector)[0014]将IFNa/丫克隆到慢病毒表达载体的多功能酶切位点中，并在干扰素3'端构建BamHI/EcoRV酶切位点，W方便多肤片段的插入，并确保多肤插入后和干扰素在同一开放阅读框内。[0015]S、构建IFN反应原件-绿色巧光蛋白报告质粒(Lenti-ISRE-GFP-Puro-RepOTter)[0016]购买CignalLentiISRERepo;rter(luc)Kit:CLS-〇08L。改造CLS-008L质粒，将巧光素酶基因替换为绿色巧光蛋白-T2A-嚷岭霉素融合基因，命名为Lenti-ISRE-GFP-Pur〇-Reporter。[0017]四、建立Lenti-ISRE-GFP-Puro-RepOTter稳转肿瘤细胞株（IFNrespondingelementpromoter-GRP-Puro-Reporterlentiviralstableclones)[0018]将Lenti-ISRE-GFP-Puro-RepOTter、PSPAX2和PMD2G共转293T细胞株包装成慢病毒颗粒，收集病毒上清，感染肿瘤细胞，并采用嚷岭霉素筛选1周，获得干扰素报告系统稳转肿瘤细胞。[0019]五、建立cDNA文库并筛选出目标多肤；[0020]1.从正常人成纤维细胞中提取总RNA，并分离纯化mRNA。[0021]2.将mRNA逆转录成cDNA，然后再将cDNA合成为dsDNA。[0022]3.用超声波将dsDNA破碎成小的片段[0023]4.采用PAGE胶分离纯化50-100bpcDNA片段文库（Shoddouble-strandcDNAfragments,DCF)[0024]5.将纯化的DCF克隆到预先构建好的多肤片段克隆载体获得质粒文库。[0025]6.将构建好的质粒文库电转到感受态细胞中。[0026]7.在含有卡拉霉素的LB-Agar培养皿中37°C培养过夜（其中，只有ATG-DCF-卡拉霉素在同一开放阅读框内表达的细菌才能存活）。[0027]8.将Agar培养皿上的细菌用LB培养液洗脱到500ml的锥形瓶中，LB培养液中加入卡拉霉素，37°C，300巧m，培养过夜。[0028]9.将细菌离屯、并提取质粒。[002引10.用BamHI/EcoRV酶切DCF文库，并将其克隆进IFNa/丫-多肤重组基因表达载体，使干扰素-DCF在同一开放阅读框内。[0030]11.将构建好的质粒文库电转染到感受态细胞中。[0031]12.在含有氨节西林的LB-Agar培养皿中37°C培养过夜。[0032]13.将细菌离屯、并提取质粒。[0033]14.将提取的文库质粒和PsPAX2,PMD2G质粒一起转入293T细胞，包装成慢病毒颗粒。[0034]15.收集病毒上清并用Lenti-ISRE-GFP-Puro-RepOTter稳转肿瘤细胞株（IFNrespondingelementpromoter-GFP-Puro-Reporterlentiviralstableclones)[0035]16.用流式细胞仪分选出巧光最亮的肿瘤细胞[003引17.提取DNA，扩增该单克隆中的多肤序列，并将其克隆至IFNa/丫-多肤重组基因表达载体。[0037]18.重复第10-17步，3次[003引19.将第4次提取的DNA克隆进pjet质粒，挑取单克隆，测序[003引20.将测序序列和人基因组DNA比对，得到多肤序列即我们的目标片段[0040]六、DCF文库测序序列[0041]1、测序后，我们得到来源于不同基因的转录片段，进一步筛选出其中有同源性极高的5个克隆，通过UCSC基因组Blat，我们发现，该5个多肤片段均来自胎盘生长因子(placentagrowthfactor,PGF)，该5个片段共享60bp序列。如图1所不，为OriginalSequence;IFN-BamHI-人胎盘生长因子（Placentagrowthfactor,PGF)基因序列；Inte计eron-DCFl~5分别为筛选出来的5个单克隆。[0042]2、将上述筛选的5个多肤的核巧酸序列翻译成氨基酸序列后，分别命名为胎盘生长因子多肤（PlacentaGrowthFactorPolip邱tides当前第1页1 2