专利名称：α/β-干扰素结合蛋白，制法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的α/β-干扰素结合蛋白，它们能调节多种α-干扰素(IFN-α)亚型以及β-干扰素(IFN-β)的活性。更具体地说，本发明涉及编码这些蛋白质的DNA分子的克隆及其在宿主细胞中的表达和针对这些蛋白质的抗体。
以色列专利申请103052号描述了一种可溶性的分子量约为45，000的IFN-α受体蛋白，并提出了权利要求。这种蛋白是用抗IFN-α受体的单克隆抗体进行Western印迹分析而鉴别出。该专利申请还描述了另一种不同的可溶性IFN-α结合蛋白，同时也提出了权利要求，这种可溶性IFN-α结合蛋白分子量约40，000，是通过与125I-IFNα2交联再与抗IFN-α单克隆抗体进行免疫沉淀分析而鉴别出。来源于血清中的该种蛋白的分子量为50K。以色利专利申请106591号描述了上述40，000分子量的IFN-α结合蛋白(以下简称“IFNAB-BP”或“IFNAB-BPⅡ)并提出权利要求，其来源于尿，呈同质状态且其顺序不同于已知的任何其它蛋白质。IFNAB-BP与多种不同IFN-α亚型以及IFN-β结合并阻断它们的活性。就这方面而言，IFNAB-BP的结合特性明显地与那些先前描述过的只对人干扰素αB发生应答的细胞表面干扰素受体的特性很不相同。
根据本发明，克隆了两种编码IFNAB-BP前体的cDNA分子，并确定了它们的顺序。两者可能来自同一基因，由于不同的拼接而产生。同时也描述了在哺乳动物及其它宿主细胞中产生的两种重组蛋白，指定为IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ。还公开了直接针对IFNAB-BP，用于阻断IFN受体和用于IFNAB-BPⅠ及IFNAB-BPⅡ的免疫测定和免疫纯化的多克隆及单克隆抗体。
IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ能调节Ⅰ型干扰素即各种α-干扰素亚型和β-干扰素的活性。因此，它们可以抑制Ⅰ型干扰素的一些副作用。
Ⅰ型干扰素(IFN)(IFN-α，IFN-β和IFN-ω)构成了一组结构上相关的细胞素，这些细胞素通常是根据它们具有抵抗病毒感染的能力进行定义。已有Ⅰ型IFN的其它多种生物学活性的报导，包括细胞繁殖的抑制，Ⅰ类主要组织相容性复合体(MHC)抗原的诱导和其它多种免疫调控活性(1)。IFN-α和IFN-β能用于治疗一些病毒引起的疾病，包括丙型肝炎(2，3)和病毒性疣(4，5)，以及某些恶性肿瘤，如毛状细胞性白血病(6)，慢性骨髓性白血病(7)和卡波济(Kaposi′s)肉瘤(8)。
在许多患有自身免疫疾病如系统性红斑狼疮(9)的病人以及艾滋病人(10)的血清中检测到IFN-α。在青年型糖尿病的病情发展中也涉及到IFN-α(11)。还有报道说，在白质小神经胶质细胞中IFN-α的过量表达会导致阿尔茨海默病(51)。此外，IFN-α的治疗在某些情况下会导致意想不到的副作用，包括发热和神经病学方面的疾病(12)。因此在某些病理情况下，中和IFN-α的活性对病人是有利的。
同其它细胞素情况一样，IFN-α通过与一细胞表面受体结合而施加其生物活性，这种受体对所有IFN-α亚型以及IFN-β是特异的(13)。以Daudi细胞中鉴别并克隆了IFN-α受体(IFNAR)(14)。克隆化的受体具有单个穿膜区，一个细胞外区和一个细胞内区，当在鼠细胞中表达时，该受体将应答提呈给IFN-αB，但提呈给其它IFN-α和IFN-β种类的却明显的少，这表明在对IFN-β和对不同的IFN-α亚型的应答反应中还涉及其它的成份。
其它若干研究表明，在IFN-α及IFN-β的结合中有其它成份或受体亚单位存在(15-17)。此外，有报道称在所有IFN-α及IFN-β种类(18)的结合中都涉及到已描述的受体(14)。
细胞素结合蛋白(可溶性细胞素受体)对应于它们各自细胞表面细胞素受体的细胞外配体结合区域。它们或者由同一的细胞表面受体的原初mRNA通过不同拼接而得到，或者由细胞表面受体通过蛋白水解切割而得到。这样的可溶性受体过去已有描述，其中包括IL-6和IFN-γ(19-21)，TNF(22-24)，IL-1(25-27)，IL-4(25，28)，IL-2(29，30)，IL-7(31)和IFN-α的可溶性受体。
本发明提供编码已知IFN-α/β结合蛋白的DNA分子(IL106591)。这种DNA分子实际上编码两种不同的蛋白质，IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ。这两种蛋白质可能来自同一原初mRNA，通过不同的拼接方式产生两种mRNA分子，一个长度约为1.5kb，而另一个约4.5kb。每个都编码一种结合蛋白，1.5kbmRNA编码IFNAB-BPⅠ，而4.5kbmRNA编码IFNAB-BPⅡ。术语IFNAB-BP是指IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ两者。尿IFNAB-BP经鉴别为IFNAB-BPⅡ。
据此，本发明提供一种DNA分子，它编码的IFN-α/β结合蛋白选自IFNAB-BPⅠ，IFNAB-BPⅡ，IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的融合蛋白和突变蛋白，它们的功能衍生物及它们的活性片段。
本发明还提供可复制的含该DNA分子的表达载体，用其进行转化的宿主和用这种转化了的宿主产生的蛋白质。术语“DNA分子”包括基因组DNA，cDNA，人工合成的DNA及其结合物。
本发明还涉及可在严紧条件下与上述DNA分子杂交并且编码具有与IFNAB-BP相同生物学活性的蛋白质的DNA分子。
本发明还提供宿主细胞中制备产生功能性IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ，融合蛋白，突变蛋白或其活性片段的方式。
本发明还提供重组的IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ，融合蛋白，突变蛋白或其活性片段，和所有这些物质的盐，以及含有IFNAB-B PⅠ或IFNAB-BPⅡ，融合蛋白，突变蛋白，其活性片段或所有这些物质的盐的药物组合物。
IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ抑制自然的人体白细胞和成纤维细胞干扰素以及重组的人体IFN-α2，IFN-αB，IFN-αC和IFN-β的生物学活性。IFNAB-BPⅠ对应于一种新的穿膜蛋白。该穿膜蛋白是一种配体结合的IFN-α/β受体。IFNAB-BPⅡ是一种可溶性受体，基本上对应于IFNAB-BPⅠ的细胞外的配体结合的区域。
图1为IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的克隆策略。
(A)中间一行来自40，000分子量的尿IFNAB-BP的一段内部的溴化氰肽顺序(27个氨基酸残基，cb7)。
上面和下面两行人工合成的有意义(上面)和反意义(下面)简并性寡核苷酸混合物，这是根据肽顺序而制得，用于反转录(仅反意义引物)和聚合酶链反应(PCR)。
(B)用上述有意义和反意引物而得的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。用下列RNA和引物以产生作为PCR模板的cDNA(1)Poly A+Daudi细胞的RNA，反意义引物;(2)Poly A+Daudi细胞的RNA，寡聚d(T)引物;(3)WISH细胞总RNA，反意义引物。DNA标记物的大小(bp)示于左边。
(C)上行得自含有101bpPCR产物的pBluescript克隆的非简并性顺序部分。
下行将得到的非简并性DNA顺序翻译成所期望的顺序，为肽cb7的一部分(残基9-20)。
图2为携带IFNAB-BPIcDNA的q10克隆的cDNA顺序及翻译出的多肽顺序该克隆是从由人Hela细胞cDNA制成的λgt11文库中分离，用对应于图1(c)中的非简并性DNA顺序的人工合成寡核苷酸进行筛选而得。对应于尿IFNAB-BP的N-端和对应于其溴化氰肽的顺序下有划线，并且在线下方给出对应顺序的名称(n1为N-端1;n2为N-端2;cb3为溴化氰肽3;cb6为溴化氰肽6;cb7为溴化氰肽7)。
对应于信号肽(s)和穿膜区(tm)的疏水性顺序下划有双线。右侧黑体数字为氨基酸残基号码。一般印刷的数字对应于核苷酸残基号码，取ATG中起始的A为第一。
图3为用IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ顺序共同的一个特异性探针进行Northern印迹分析检测mRNA对应于IFNAB-BPⅠ核苷酸218-614的一个397碱基对(bp)的探针是通过使用合适的引物经PCR而制得，并且用随机引物标记法进行〔32P〕标记，Poly A+Daudi细胞RNA样品用1.5%琼脂糖电泳分析，印迹于硝基纤维素薄膜上并和该特异性探针杂交。核糖体RNA的大小示于右侧。
图4为对应于IFNAB-BPⅠ完整的1.5kb cDNA克隆核苷酸及氨基酸顺序。以单字符表示的氨基酸残基的编号从起始密码子开始，用黑体字表示。疏水性引导顺序和穿膜区下有划线。尿IFNAB-BP的N-端蛋白质顺序(从第27个密码子开始)以及内部溴化氰肽下划有点线。(然而Cys和N-糖基化的Asn残基推断不出)。N-糖基化信号用星号表明。多聚腺苷酸化信号下划有双线。
图5为对应于IFNAB-BPⅡ的4.5kb cDNA克隆的部分核苷酸及氨基酸顺序。以单字符表示的氨基酸残基的编号从起始密码子开始，用黑体字表示。疏水性引导顺序下有划线。尿IFNAB-BPⅡ和N-端蛋白质顺序(从第27个密码子开始)以及内部溴化氰肽下划有点线。N-糖基化信号和终止密码子用星号表明。
图6显示用于表达IFNAB-BPⅠ的细胞外配体结合区域的一个哺乳动物表达载体的构建。
(A)用于通过PCR制备编码IFNAB-BPⅠ的细胞外配体结合区域的DNA的人工合成的有意义和反意义寡核苷酸。
(B)用上述有意义和反意义引物及q10克隆的DNA进行PCR反应而得的约850bp的扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
(C)用于产生可溶性IFNAB-BPⅠ的哺乳动物表达载体pEF-BOS-IFNAB-BP-Ⅰ的结构。
图7显示IFNAB-BPⅠ和IFNAR-在各种细胞中的表达。
用去垢剂处理的细胞抽提物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(7.5%丙烯酰胺，非还原条件)，接着用兔抗IFNAB-BPⅡ抗体和125Ⅰ-蛋白A进行免疫印迹分析而显示出IFNAB-BPⅠ在各种细胞中的表达情况。369.11克隆是NIH-3T3细胞，表达IFNAB-BPⅠ;470.6克隆是表达IFNAR的NIH-3T3;508.12克隆表达两种蛋白。同时显示对照用NIH-3T3细胞及人Daudi细胞。用箭头标出IFNAB-BPⅠ的51千道尔顿(KDa)形式(在鼠细胞中)和102KDa形式(在Daudi细胞中)。分子量标记物示于左侧。
图8显示125I-IFN-α2与各种宿主细胞的结合。
(A)125I-IFN-α2与表达IFNAB-BPⅠ的NIH-3T3细胞(369.11克隆，■)和与表达IFNAB-BPⅠ及IFNAR及两者的细胞(508.12克隆，●)呈饱和性结合，与仅表达IFNAR的细胞(470.6克隆，△)缺失结合。(B)125I-IFN-α2与上述细胞结合的Scatchard分析。结合数据用LIGAND程序进行分析。下列细胞显示出高亲和力的饱和性结合hu Daudi(△)，IFNAB-BPⅠ-阳性细胞(369.11克隆，●)和表达IFNAR及IFNAB-BPⅠ两者的508.12克隆(■)。
图9总结了对用来确定尿IFNAB-BPⅡ与IFN-α2的亲和力的BIAcore体系的研究结果。
将IFN-α2固定于传感片，让各种浓度的尿IFNAB-BPⅡ通过传感片。“相关的反应vs时间”显示结合和解离过程。表观解离常数为3.12×10-9M。
图10显示尿IFNAB-BPⅡ的酶标免疫吸附测定(ELISA)分析。
将纯的尿IFNAB-BPⅡ连续地两倍稀释成所示浓度，加于已用单克隆抗IFNAB-BPⅡ抗体预涂覆的micro ELISA板上。此板再与兔抗IFNAB-BPⅡ抗体反应，后与结合有辣根过氧化物酶的山羊抗兔抗体及ABTS/H2O2底物反应。板在405/630纳米(nm)处测量。检测的下限为30皮克/毫升(pg/ml)。
根据以色列专利申请106591号，分子量为40，000的IFN-α/β结合蛋白(IFNAB-BP)是从正常尿液中经两步色谱分离而得。粗制的尿蛋白上柱于由与琼脂糖结合的IFN-α2组成的色谱柱。该柱经洗涤去除无关蛋白质，而结合的蛋白质在低pH下洗脱下。洗脱的蛋白质再用大小排阻的高效液相色谱法(HPLC)分开，得到几个蛋白质峰，其中一个通过其与125I-IFN-α2的特异反应能力以及阻断IFN-α和IFN-β的抗病毒活力的能力而定性。该蛋白质进一步经N-端微顺序分析而定性，得到其N-端区域的一个主要顺序Asp-Ser-Pro-Asp-Tyr-Thr-Asp-Glu-Ser-Arg-Thr-Phe-Lys-Ile-Arg-Leu-Arg.
检测到一个次要多肽顺序，它对应于主要顺序，但是在上述顺序的N-端具有三个额外氨基酸残基(Ile-xxx-Tyr)(xxx指一个未确定的氨基酸)。得到的顺序与已知的IFN-αB受体(14)进行比较，发现完全不相同。使用Fast A程序(33)，通过与Swissprot和Genebank数据库的比较确定它也不同于已知的任何其它蛋白质，也不由任何已知的DNA顺序所编码。
一份尿IFNAB-BP样品用溴化氰消化，在SDS-PAGE上分开，电印迹于PVDF膜上，得到的消化片段进行蛋白质微测序。其中一个片段分子量小于10K，并具有一个如下所示的内部顺序(Met在实际顺序之前。)Met-Val-Lys-Phe-Pro-Ser-Ile-Val-Glu-Glu-Glu-Leu-Gln-Phe-Asp-Leu-Ser-Leu-Val-Ile-Glu-Glu-Gln-Ser-Glu-Gly-Ile(27个残基)。
该段内部顺序被反向翻译成有意义和反意义引物，并在其中加入适当的限制性位点。人细胞总RNA纯化后，用反意义寡核苷酸混合物或寡聚d(T)作为引物，在反转录酶作用下产生最初的cDNA链。接着，得到的cDNA片段在PCR中扩增。在3%琼脂糖凝胶上分析PCR产物，显示出一条特异性101bp的寡核苷酸带。该DNA经限制性酶切，克隆到pBluescript(Stratagene)，再用该载体转染感受态大肠杆菌。对几个独立的克隆进行测序。两侧为有意义和反意义简并性引物的区域顺序是相同的，而且编码所预期的来自上述的尿IFNAB-BP的溴化氰肽(Cb7)顺序。合成了一段对应于该非简并性内部顺序的寡核苷酸，并末端标记，用于筛选cDNA库。
对人HeLa细胞λgt11 cDNA库(Clontech)的筛选结果得到了若干个阳性克隆。其中一个克隆命名为q10，具有对应于一条信号肽，一个细胞外区，一个穿膜区和一个短的细胞质区的开放阅读框。得自尿IFNAB-BP的顺序都存在于由q10编码的细胞外区中。由于受到蛋白质测序技术的限制(主要是因为不能鉴别Cys以及对应于Ser的低水平峰)，所以肽顺序中一部分氨基酸残基是不正确的。
对应于q10克隆的核苷酸顺序219-613(图2)两端的有意义和反意义引物被用来以q10作为模板通过PCR制备特异性的探针。得到的DNA用〔32P〕标记，用于与来自两个人细胞系的poly A+mRNA进行Northerm印迹杂交分析。在两种情况下都观察到存在两条特异性带，一条对应于1.5kb mRNA，另一条对应于4.5kb mRNA。1.5kb mRNA，另一条对应于4.5kb mRNA。1.5kb mRNA的原初翻译产物被命名为IFNAB-BPⅠ前体。4.5kb mRNA的原初翻译产物被命名为IFNAB-BPⅡ前体。
上述的特异性探针被用来筛选另一个人cDNA库，并鉴别出两组cDNA克隆。一组(约有20个独立的克隆)的长度为1.5kb而且编码由q10克隆编码的穿膜蛋白的同一前体。第二组(2个独立的克隆)的长度为4.5kb。它们的大小与两种mRNA的大小相同，所以1.5kb cDNA克隆编码IFNAB-BPⅠ而4.5kb cDNA克隆编码IFNAB-BPⅡ。4.5kb克隆的测序显示它们编码一个截短了的可溶性受体的前体，其以对应于q10克隆的1-239的密码子。但是238和239密码子不相同，其后为终止密码子。通过确定最后两个氨基酸残基，对分子量40，000的尿IFNAB-BP的C-端的蛋白质顺序分析表明，它是由4.5kb cDNA编码的。因此，尿IFNAB-BP被鉴别为IFNAB-BPⅡ。此处所用“前体”被定义为包括信号肽的原初翻译产物。
通过PCR产生编码IFNAB-BPⅠ的截短的可溶形式前体的DNA。得到的PCR产物被插入哺乳动物表达载体并用来转染各种哺乳动物细胞，如猴子COS细胞。这些细胞高水平地表达具生物学活性的重组的可溶性IFNAB-BPⅠ。
类似地通过PCR产生编码IFNAB-BPⅡ前体的DNA。得到的PCR产物被插入哺乳动物表达载体并用来转染各种哺乳动物细胞，如猴子COS细胞。这些细胞高水平地表达具生物学活性的重组的IFNAB-BPⅡ。
类似地通过PCR产生编码IFNAB-BPⅠ全长前体的DNA。得到的PCR产物被插入哺乳动物表达载体并用来转染各种哺乳动物细胞，小鼠NIH-3T3细胞。这些细胞高水平地表达IFNAB-BPⅠ。这些细胞能高亲和性地与人IFN-α2结合(Kd＝3.6×10-9M)。当人IFNAB-BPⅠ和先前克隆的人IFN-αB受体IFNAR(14)一起在小鼠NIH-3T3细胞中共表达时，复合受体的亲和力约增加10倍(Kd＝4×10-10M)。相反，仅有人IFNAR在小鼠细胞中表达时，不表现与人IFN-α2的结合。因此，与单独的IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ相比，含有两个相连多肽的复合蛋白对IFN-α2的亲和力更高。这两个多肽中一个具有IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ的配体结合区，另一个具有IFNAR的细胞外区。
通过BIAcore体系(Pharmacia，Sweden)确定了尿IFNAB-BPⅡ对人IFN-α2的亲和力。IFN-α2固定于传感片上，使之与IFNAB-BPⅡ结合。根据Kon和Koff值，得到Kd值为3.12×10-9M。该值与用表达IFNAB-BPⅠ的NIH-3T3细胞获得的值十分接近。
上述的克隆，克隆分离，鉴别，定性和测序的程序在后面的实施例中将更详细地描述。
IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ也可以通过其它类型的重组细胞而产生，如原核细胞的大肠杆菌，或其它真核细胞，比如CHO，酵母或昆虫细胞。构建适当的携带编码IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡDNA，并且适合用来转化(如大肠杆菌或酵母细胞)或感染昆虫细胞的载体，以产生重组的IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的方法，在本领域是共知的。例如，可参见Ausubel等人编著的“Current Protocols in Molecular Biology”Current Protocols，1993;和Sambrook等人编著的“Molecular CloningA Laboratory Manual”，第二版，Cold Spring Harbor Press，1989。
本发明还涉及IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的活性突变蛋白和活性片段，还涉及由融合于另一多肽或蛋白质的野生型IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ，或它们的活性突变蛋白或它们的活性片段组成的融合蛋白，融合蛋白发挥一相似的阻断IFN-α和IFN-β或其它具有α/β干扰素受体的细胞素的生物学活性。
将编码IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ、它们的活性片段，突变蛋白或融合蛋白的，和操纵上连接的转录和翻译调控信号一起插入能将所期望的基因顺序整合入宿主细胞染色体的真核生物载体中。为了能选出已将引入的DNA稳定地整合入染色体的细胞，可以使用一种或多种标记以选择含表达载体的宿主细胞。标记可以将营养缺陷型宿主，提供耐致命物质(如抗菌素)的能力，提供抗重金属如铜的耐性，或类似的性能。可选择的标记基因可以直接连于待表达的基因顺序，也可以通过共转染一起引入同一细胞。也需要一些额外的因子以最理想地合成出单链结合蛋白mRNA。这些因子可以包括拼接信号，以及转录启动子，增强子和终止信号(34)。
为了表达IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ蛋白、它们的活性片段或衍生物，最好将待引入已选择好的细胞的DNA分子插入到一个能在受体宿主中自主复制的质粒或病毒载体中。
在选择特定质粒或病毒载体中的重要因素包括能方便地识别并将含有载体的受体细胞从不含载体的受体细胞中选择出来;在特定宿主中所期望的载体的拷贝数目;是否有利于使载体在不同种的宿主细胞之间“穿梭”。较佳的原核生物载体包括那些可在大肠杆菌中复制的质粒，如pBR322，ColE1，pSC101，pACYC184等(35);芽孢杆菌(Bacillus)属质粒如pC194，pC221，pT127等(36);链霉菌(Streptomyces)属质粒，包括pIJ101(37)，链霉菌(Streptomyces)属噬菌体如ΦC31(38)和假单胞菌属质粒(39，40)。
理想的真核生物质粒包括BPV牛痘、SV40、2-微米环等或它们的衍生物。这些质粒是本领域中共知的(41-45)。
一旦制备好用于表达的载体或含构建物的DNA顺序，可以通过一系列合适的方法中的任何一种将表达载体引入适当的宿主细胞，如通过转化、转染、脂质体载体转染、接合作用、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀法、直接显微注射法等。
用于本发明的宿主细胞可以是原核或真核生物的。理想的原核生物宿主包括细菌如大肠杆菌(E.Coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉素属(Streptomyces)、假单孢菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)、沙雷菌属(Serratia)等。最理想的原核生物宿主是大肠杆菌。特别感兴趣的细菌宿主包括E.coli K12菌株294(ATCC31446)、E.coli X1766(ATCC31537)、E.coli W3110(F-，λ-，光合营养的(ATCC27325))和其它肠细菌，如鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)或灵杆菌(Serratia narcescens)及多种假单胞菌属的种。在这些条件下，蛋白质将不被糖基化。原核生物宿主必须可与表达质粒中的复制子和控制顺序相容。
然而，因为IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ是糖基化的蛋白，所以真核生物宿主优于原核生物宿主。理想的真核生物宿主是哺乳动物细胞，如人、猴、小鼠和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，因为这些细胞可提供蛋白质分子翻译后的修饰，包括正确的折叠，形成正确的二硫键以及在正确的位点糖基化。同样，酵母细胞和昆虫细胞也可进行翻译后肽的修饰，包括高度的甘露糖基化。有许多使用强启动子顺序和高拷贝数目质粒的重组DNA策略，可用来在酵母和昆虫细胞中产生所期望的蛋白质。酵母细胞识别克隆的哺乳动物基因产物上的引导顺序并分泌带引导顺序的肽。引入载体后，宿主细胞在选择培养基上生长，选择含载体的细胞。克隆的基因顺序的表达导致产生IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ、其融合蛋白或突变蛋白、或其活性片段。接着表达的蛋白质用任一种常规程序进行分离和纯化，其中包括提取、沉淀、色谱、电泳或类似方法。或者使用柱中所含凝胶基质上固定的抗-IFNAB-BPⅠ单克隆抗体进行亲合层析，将含该重组IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ、它们的活性片段或衍生物的粗制剂通过该柱，此时IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ，它们的活性片段或衍生物将通过特异性的抗体结合于柱上而杂质将流走。洗涤之后，可在通常用来洗脱的条件下，即在高pH或低pH下，如pH11或pH2，将蛋白从凝胶上洗脱下来。
此处所用的术语“突变蛋白”指IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ的类似物，其中一个或多个天然IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ或其活性片段的氨基酸残基被不同的氨基酸残基所替换或缺失，或者一个或多个氨基酸残基被加入到天然IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ的顺序中。而且，与野生型的IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ它们的活性片段相比，没有显著改变所得到的产物的活性。这些突变蛋白可以用于已知的人工合成和/或定点诱变技术或任何其它已知的适合用于该目的的技术来制备。
任何一种这样的突变蛋白最好具有与IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ的氨基酸顺序足够一样的氨基酸顺序，从而使其具有与IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ或其活性片段实质上相似的活性。IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ的一个活性是能与一种或多种Ⅰ型干扰素结合，如天然的人白细胞和成纤维细胞干扰素以及重组的人IFN-α2，IFN-αB，IFN-αC和IFN-β。只要突变蛋白实质上具有与一种或多种这些干扰素的结合能力，它便能通过诸如亲合层析的方法用于纯化这些干扰素，从而能认为具有与IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ实质上相似的活性。因此，可以通过常规的实验方法来确定任何给定的突变蛋白是否实质上具有与IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ相同的活性，包括让这样一种突变蛋白经简单的三明治式竞争测定以确定它是否与适当标记的干扰素结合，比如放射免疫测定或ELISA测定。该试验应使用多种Ⅰ型干扰素进行重复，因为一个能与任何种类的Ⅰ型干扰素结合的突变蛋白具有足够的IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ活性及具有至少一种公开的IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ的效用，因而具有与之实质上相似的活性。
在较佳的具体例子中，任何这样的突变蛋白与IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ至少具有40%的一致性或同源性。更佳的具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或最佳的具有至少90%一致性或同源性。
根据本发明所能使用的IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ多肽或蛋白质或它们的活性片段的突变蛋白，或者为其编码的核酸，包括一系列有限的实质上对应的置换肽或多聚核苷酸顺序，它们可以由本领域的一般熟练技术人员，依据此处给出的说明和指导，通过适当的实验方法常规地获得。详细的蛋白质化学和结构描述，请参见Schulz，G.E.等人，Principles of Protein Structure，SpringerVerlag，New York，1978;和Creighton，T.E.，ProteinsStructure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，1983，这些都在此引用作为参考。核苷酸顺序置换方面的描述，可以参见Ausubel等人，supra，§§A.1.1-A.1.24，和Sambrook等人，supra，附录C和D。
根据本发明，较佳的突变蛋白的改变是那些已知的“保守的”置换。IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ多肽或蛋白质或它们的活性片段的保守的氨基酸置换可以包括一组同义氨基酸，这些氨基酸具有足够相似的物化性能使得组中氨基酸之间的置换会保留该分子的生物学功能。Grantham，Science，Vol，185，pp.862-864(1974)。已经清楚，在上述限定的顺序中也可以插入或缺失一些氨基酸而不改变其功能，尤其是如果插入或缺失只包括少数氨基酸例如小于30个，较佳的小于10个，并且不去除或替换对功能构象至关重要的氨基酸如Cys残基时。Anfinsen，“Principles That Govern The Folding of Protein Chains”，Science，Vol.，181，pp.223-230(1973)。这样的缺点和/或插入而形成的蛋白质和突变蛋白归于本发明的范围。
较佳的同义氨基酸组是如表Ⅰ所限定的。更佳的同义氨基酸组是如表Ⅱ所限定的;最佳的同义氨基酸组是如表Ⅲ所限定的。
表Ⅰ 较佳的同义氨基酸组氨基酸 同义组Ser Ser,Thr,Gly,AsnArg Arg,Gln,Lys,Glu,HisLeu Ile,Phe,Tyr,Met,Val,LeuPro Gly,Ala,Thr,ProThr Pro,Ser,Ala,Gly,His,Gln,ThrAla Gly,Thr,Pro,AlaVal Met,Tyr,Phe,Ile,Leu,ValGly Ala,Thr,Pro,Ser,GlyIle Met,Tyr,Phe,Val,Leu,IlePhe Trp,Met,Tyr,Ile,Val,Leu,PheTyr Trp,Met,Phe,Ile,Val,Leu,TyrCys Ser,Thr,CysHis Glu,Lys,Gln,Thr,Arg,HisGln Glu,Lys,Asn,His,Thr,Arg,GlnAsn Gln,Asp,Ser,AsnLys Glu,Gln,His,Arg,LysAsp Glu,Asn,AspGlu Asp,Lys,Asn,Gln,His,Arg,GluMet Phe,Ile,Val,Leu,MetTrp Trp
表Ⅱ 更佳的同义氨基酸组氨基酸 同义组Ser SerArg His,Lys,ArgLeu Leu,Ile,Phe,MetPro Ala,ProThr ThrAla Pro,AlaVal Val,Met,IleGly GlyIle Ile,Met,Phe,Val,LeuPhe Met,Tyr,Ile,Leu,PheThr Phe,TyrCys Cys,SerHis His,Gln,ArgGln Glu,Gln,HisAsn Asp,AsnLys Lys,ArgAsp Asp,AsnGlu Glu,GlnMet Met,Phe,Ile,Val,LeuTrp Trp
表Ⅲ最佳的同义氨基酸组氨基酸 同义组Ser SerArg ArgLeu Leu,Ile,MetPro ProThr ThrAla AlaVal ValGly GlyIle Ile,Met,LeuPhe PheThr TyrCys Cys,SerHis HisGln GlnAsn AspLys LysAsp AspGlu GluMet Met,Ile,LeuTrp Trp本发明中使用的用来获得IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ多肽、蛋白质或它们的活性片段的突变蛋白的蛋白质氨基酸置换例子包括用任何已知方法步骤获得的，例如在美国专利RE 33，653，4，959，314，4，588，585和4，737，462，授于Mark等人;5，116，943，授于Koths等人;4，965，195，授于Namen等人;4，879，111，授于Chong等人;和5，017，691，授于Lee等人中所述以及在美国专利4，904，584号(Shaw等人)中所述的Lys置换蛋白。
在本发明的另一优选实施例中，任何IFNAB-BPI或IFNAB-BPⅡ或它们的活性片段的突变蛋白都具有与IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ大体一致的氨基酸顺序。术语“大体一致”用来包括与天然蛋白顺序有微小改变但不影响天然蛋白基本特性的蛋白质，尤其在考虑其与一种或多种Ⅰ型干扰素结合从而抑制Ⅰ型干扰素与天然Ⅰ型干扰素受体在原位发生结合的能力方面没有影响。这种通常被认为归于“大体一致”范畴的改变是对编码这些蛋白质的DNA使用传统的诱变技术产生一些小修饰，再用上述的方法通过筛选所期望的活性而产生。
本发明的突变蛋白包括由核酸如DNA或RNA编码的蛋白质，这些核酸在严紧条件下会与编码本发明的IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ的DNA或RNA杂交。本发明还包括一类核酸，它能作为探针用于鉴别和纯化所期望的核酸。此外，该核酸是主要的候选对象，以确定它是否编码一种具有本发明的IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ功能活性的多肽。术语“严紧条件”是指那些本领域的一般熟练技术人员常规上称为“严紧的”杂交及随后的洗涤条件。参见Ausubel等人，Current Prolocols in Molecular Biology，supra，Interscience，NY，§§6.3和6.4(1987，1992)和Sambrook等人，supra。无限制时，严紧条件的例子包括比计算出的所研究杂交体的解链温度(Tm)低12-20℃的洗涤条件，如2×SSC和0.5%SDS5分钟，2×SSC和0.1%SDS15分钟;0.1×SSC和0.5%SDS，37℃，30-60分钟，以及0.1×SSC和0.5%SDS，68℃，30-60分钟。本领域的一般熟练技术人员明白严紧条件还取决于DNA顺序，寡核苷酸探针(如10-40个碱基)或混合寡核苷酸探针的长度。如果使用混合探针，最好用四甲基氯化铵(TMAC)替代SSC。参见Ausubel，Supra。
术语“融合蛋白”指含有与另一种蛋白质比如具有更长体液驻时间的蛋白质相融合的IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ或它们的活性片段或它们的突变蛋白的一种多肽。因此，IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ或它们的活性片段可以与另一种蛋白质多肽或类似物如免疫球蛋白或其片段相融合。
此处术语“盐”指IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ、它们的活性片段、突变蛋白、或其融合蛋白的羧基盐以及氨基的酸加成盐。羧基盐可以用本领域已知的方法形成，包括无机盐如钠、钙、铵、铁或锌盐和类似的盐以及与有机碱形成的盐如与胺比如三乙醇胺，精氨酸，或赖氨酸、六氢吡啶、普鲁卡因和类似碱形成的盐。酸加成盐包括例如与无机酸如盐酸或硫酸形成的盐，与有机酸如乙酸和草酸形成的盐。当然，任一种这样的盐都必须具有与IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ或它们的活性片段实质上相似的活性。
此所所用“功能衍生物”，是覆盖这样一类IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ或它们的活性片段及它们的突变蛋白和融合蛋白的衍生物。它们是用领域中已知的方法在位于残基侧链的功能基团或N-端或C-端基团上制备而得的，而且只要它们保留药学上的可接受性，即它们不破坏与IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ活性实质上相似的蛋白质活性，也不将毒性赋于含有其本身的组合物，它们便属于本发明范围。例如这些衍生物可包括聚乙二醇侧链，它会掩盖抗原性的位点从而延长IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ或它们的活性片段在体液中的驻留时间。其它的衍生物包括羧基的脂肪族、羧基与氨或伯胺或仲胺反应形成的酰胺、氨基酸残基的游离氨基与酰基部分(如链烷酰基或碳环芳香酰基)形成的N-酰基衍生物或游离羟基(如丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基)与酰基部分形成的O-酰基衍生物。
IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ、突变蛋白和融合蛋白的“活性片段”在本发明中覆盖任何蛋白质分子多肽链的片段或前体，或者含有IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ的任何这种片段的融合蛋白，它们或是单独地或是与连于其上的关联分子或残基(如糖或磷酸盐残基)一起，或者是任何上述蛋白质分子的聚集体，只要该片段具有与IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ实质上相似的活性。
本发明还涉及一种药物组合物，它含有药学上可接受的载体以及本发明的IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ或它们的活性突变蛋白、融合蛋白及它们的盐、功能衍生物或其活性片段。
本发明中用于施用的药物组合物的制备可以通过将IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ或它们的衍生物与生理学上可接受的载体和/或稳定剂和/或赋形剂混合而成，并制成剂量形式如通过剂量小瓶的冷冻干燥法。给药方法可以通过已接受的类似药剂的施用方式且要取决于治疗条件，例如静脉内、肌肉或皮下局部注射或者局部施用，或者连续输液等。施用的活性化合物数量取决于施用途径、待治疗的疾病以及病人病情。例如，以体重为基准的局部注射所需的蛋白质的量少于静脉注射。
例如在以色利专利申请106591号中所述，IFN-α/β结合蛋白(此处称为IFNAB-BPⅡ)抑制IFN-α2、INF-αB、IFN-αC和IFN-β而不是IFN-γ的抗病毒活性，这表明IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ是通用的Ⅰ型IFN结合蛋白，因此，能用于调节或阻断各种IFN-α亚型和IFN-β的生物学活性，例如用于Ⅰ型糖尿病、各种自身免疫疾病、移植排斥、AIDS和类似疾病，在这些疾病中存在IFN-α或IFB-β的异常表达。IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ可用于任何因为内生成或外施用而造成的IFN-α或IFN-β过多的场合。
因此，IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ、它们的活性片段，突变蛋白、融合蛋白及它们的盐、功能衍生物及其活性片段都暗示能用于治疗自身免疫疾病，用于哺乳动物的其它炎症，用于治疗由于施用α-或β-干扰素而产生的毒性，用于青年型糖尿病，用于红斑狼疮和AIDS。
如上所述，本发明的蛋白质也有治疗之外用途，如用于纯化Ⅰ型干扰素。
本发明还包括抗IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ、它们的突变蛋白、融合蛋白、盐、功能衍生物和活性片段的抗体。
术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体(monoclonal antibodiy，Mab)、嵌合抗体、针对抗体的抗个体基因型(anti-Id)抗体，这些抗体及它们的活性片段能以可溶性或结合性形式被标记。活性片段由任何已知技术提供，这些技术有(但并不局限于)酶切，肽合成或重组技术。
多克隆抗体是来自用抗原免疫过的动物血清中异质的抗体分子群。单克隆抗体含有实质上同质的特异地针对抗原的抗体群，该群含有实质上相似的抗原决定簇结合位点。Mab可用本领域技术人员已知的方法获得。例如可参见Kohler和Milstein，Nature256495-497(1975);美国专利4，376，110号;Ausubel等人编著的supra，Harlow and Lane，ANTIBODIESA LABORATORYMANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory(1988);和Coligan等人编著的Current Protocols in Immunology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Intersecience，N.Y.，(1992，1993)，这些参考文献的内容在此一起引用作为参考。这样的抗体可具有任何免疫球蛋白类型，包括IgG、IgM、IgE、GILD及其任何亚类。产生本发明Mab的杂交瘤可以体外、体内或原位培养。体内或原位高效价Mab的产生使之成为目前较佳的产生方法。
嵌合抗体是一种其不同部分来自不同动物种的分子，例如具有来自鼠Mab可变区和人免疫球蛋白恒定区的嵌合抗体。嵌合抗体在应用中主要用来减少免疫原性并增加产量，例如当来自杂交瘤的鼠Mab具有较高的产量但人体中免疫原性也高时，可以使用人/鼠嵌合Mab。嵌合抗体及其生产方法是本领域中已知的(Cabilly et al，Proc.Natl.Acad.Sci USA813273-3277(1984);Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA816851-6855(1984);Boulianne et al.，Nature312643-646(1984);Cabilly et al.，欧洲专利申请125023(1984年11月14日出版);Neuberger et al.，Nature314268-270(1985);Taniguchi et al.，欧洲专利申请171496(1985年2月19日出版);Morrison et al.，欧洲专利申请173494(1986年3月5日出版);Neuberger et al.，PCT申请WO8601533，(1986年3月13日出版);Kudo et al.，欧洲专利申请184187(1986年6月11日出版);Morrison et al.，欧洲专利申请173494(1986年3月5日出版);Sahagan et al.，Immunol.1371066-1074(1986);Robinson et al.，国际专利出版物，WO9702671(1987年5月7日出版);Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA843439-3443(1987);Sun et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84214-218(1987);Better et al.，Science2401041-1043(1988);以及Harlow和Lane，ANTIBODIESALABORATORY MANUAL，supra。这些参考文献在此一起参考引用。
抗个体基因型(anti-Id)抗体是一种识别通常与一抗体的抗原结合位点联合一起的单一性决定簇的抗体。Id抗体可以通过用一种Mab免疫作为Mab来源的种和遗传类型相同的动物(如小鼠品系)来制备，同时制备针对该Mab的anti-Id。免疫后的动物会识别免疫抗体的个体基因型决定簇并通过产生针对这些个体基因型决定簇的抗体(anti-Id抗体)而作出应答。例如，可参见美国专利4，699，880号，其内容在此结合作为参考。
anti-Id抗体也可用作“免疫原”在另一种动物中诱导免疫应答反应，产生一种所谓的抗anti-Id抗体(anti-anti-Id抗体)。anti-anti-Id的抗原决定簇可与最初诱导anti-Id的Mab相同。因此，通过使用针对Mab的个体基因型决定簇的抗体，可以鉴别出表达具有相同特异性的抗体的其它克隆。
因此，产生针对本发明IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ和相关蛋白的Mab可用来在适合的动物如BALB/C小鼠中诱导anti-Id抗体。这种免疫小鼠的脾细胞可用来产生分泌anti-Id Mab的anti-Id杂交瘤。此外，anti-Id Mab还可联于载体如Keyhole 血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)上，并用来免疫其它BALB/C小鼠。来自这些小鼠的血清含有的anti-anti-Id抗体具有最初Mab特异地针对IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ抗原决定簇的结合性能。
因此anti-Id Mab具有其自身的个体基因型的抗原决定簇或称“个体决定簇”，它们在结构上类似于待评估的抗原决定簇如IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ。
术语“抗体”也用来包括完整的抗体分子及其能结合抗原的活性片段，例如Fab分段和F(ab′)2分段(Fab，F(ab′)2)。Fab和F(ab′)2缺少完整抗体的Fc片段，会更快地从循环系统中被清除，而且可能其非特异组织结合能力小于完整的抗体(Wahl等人，J.Nucl.Med.24316-325(1983))。
应理解，根据此外公开的用于完整抗体分子的方法，本发明的Fab和F(ab′)2和其它抗体片段可以用于检测和定量分析IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ和相关蛋白。这些片段典型地是由蛋白水解切割而形成，如使用木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)2片段)。
如果抗体能特异性地与某分子反应从而将该分子与其结合在一起，那么便称该抗体是“能结合”一种分子。术语“抗原决定簇”意指任何分子的能被抗体结合并且也能被该抗体识别的部分。“抗原决定簇”或“表位”通常是由分子表面化学性活泼的基团组成如氨基酸或糖侧链，而且具有特异的三维结构特征以及特异的电荷特征。
“抗原”是一种分子或分子的一部分，它能被抗体结合，还能诱导动物产生能够与抗抗原的抗原决定簇结合的抗体。一个抗原可以有一个或超过一个的抗原决定簇。上述的特异反应指抗原会以高选择性方式与其对应的抗体反应而不会和大量的由其它抗原诱发的其它抗体发生反应。
用于本发明的抗体包括抗体片段，可以在用来定量或定性地检测样品中的IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ或相关蛋白，或检测表达本发明的这些蛋白的细胞的存在。这可以通过使用荧光标记的抗体(见下文)，用免疫荧光技术配合光学显微镜，流式细胞光度术或荧光检测方法而实现。
本发明中使用的抗体(或其片段)可以在组织学上用于原位检测本发明的IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ和相关蛋白，如在免疫荧光或免疫电子显微式中。原位检测的实现可以取一病人组织样品，并将本发明的标记抗体提供给该样品。最好通过将标记抗体(或片段)施用或铺于生物样品上而提供抗体(或片段)。使用这种程序，不仅可以确定IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ或相关蛋白的存在，而且还能确定其在检测组织中的分布。使用本发明时，熟练技术人员会很容易理解，可以对众多不同的组织学方法中的任一种加以修饰以实现原位检测。
用于本发明的IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ或相关蛋白的这些测定典型地包括将生物样品在能鉴别IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ或相关蛋白的可检测标记抗体存在下进行培育，如生物体液、组织提取液、新收获的细胞如淋巴细胞或白细胞或已在组织培养中培育的细胞，以及用本领域公知的技术中的任一种检测抗体。
生物样品可以用固相支承物或载体如硝基纤维素，或其能固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白质的固态支承物或载体处理。根据本发明，在用可检测的标记抗体处理后，用适当的缓冲液洗涤支承物或载体。接着第二次用缓冲液洗涤固相支承物或载体以去除未结合的抗体。再用传统手段检测结合于该固态支承物或载体上的标记物的数量。
“固相支承物”、“固相载体”、“固态支承物”、“固态载体”、“支承物”或“载体”指任何能与抗原或抗体结合的支承物或载体。共知的支承物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然或改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿等。用于本发明目的的载体性质可以是部分可溶或者不溶。支承物材料几乎可以有任何可能的构型，只要偶联的分子能结合抗原或抗体。因此，支承物或载体的构型可以是球形如珠状或者圆柱形，可位于试管的内表面或者棒的外表面。或者表面可以是平的如片或测试带等。较佳的支承物或载体包括聚苯乙烯珠。本领域的技术人员知道许多其它合适的结合抗原或抗体的载体，也能用常规的实验方法确定这些载体。
可以用共知的方法来测定本发明给出的大量抗体的结合活性。那些本领域的技术人员通过常规实验方法能确定每种测定所需的操作条件和最佳分析条件。
其它这样的步骤如洗涤、搅拌、振荡、过滤和类似步骤可以按特定情况习惯地或必需地加入到分析中去。
本发明的抗体能被可检测地标记时，其中一种方法是通过将该抗体联于某种酶，并使用酶免疫测定(EIA)，随后当该酶暴露于适当的底物时，与底物反应产生可检测的化学部分，可通过例如分光光度，荧光测定或肉眼观察方法检测。能用来可检测地标记抗体的酶包括(但并不局限于)苹果酸脱氢酶、葡萄球菌属的核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。检测可以通过此色法实现，即使用酶的产生颜色底物。检测也可通过视觉比较底物的酶反应程序和类似的制备基准而实现。
检测可以用众多其它免疫测定中的任何一种而实现。例如通过放射性标记的抗体或抗体片段，可以用放射免疫测定(RIA)检测IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ。关于RIA的较好阐述可见Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology，由Mork，T.S.等人编著，North Holland Publishing Company，NY(1978)，特别参见章节“An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques”，由Chard，T.撰写，这些内容在此引入作为参考。放射性同位素可以用下列方法如γ-计数器或液闪计数仪或放射自显影等检测。
也可用荧光化合物标记本发明的抗体。当荧光标记的抗体暴露于适当波长光时，会因为荧光而检测到其存在。在最常用的荧光标记化合物中有异硫氰酸荧光素、若丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻篮蛋白、o-苯二醛和荧光胺。
抗体也可用释放金属原子如152Eu或其它镧系金属的荧光而可检测地标记。这些金属原子可以用诸如二乙三胺五乙酸(DETPA)之类的金属螯合基团而附着于抗体。
抗体也可通过偶联于生物素而可检测地标记。生物素化抗体的检测可以通过偶联于荧光化合物或酶(如过氧化物酶)或放射性同位素及类似物上的抗生物素蛋白(卵白素)或链霉抗生物素蛋白(链亲和素)进行。
抗体也可通过偶联于化学发生化合物而可检测地标记。接着，通过检测在化学反应过程中产生的发光现象而确定化学发光标记的抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子包括鲁米诺，异鲁米诺，吖啶鎓酯(theromatic acridinium ester)咪唑，吖啶鎓盐和草酸酯。
类似地可以用生物发光化合物来标记本发明的抗体。生物发光物是一类在生物体系中发现的化学发光物质，其中催化蛋白会增加化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在通过检测荧光而确定。用于标记目的的重要的生物发光化合物是虫荧光素，虫荧光素酶和水母发光蛋白。
本发明的抗体分子也适用于免疫测定分析，即所谓的“两点”或“三明治式”测定。在典型的免疫测定分析中，一定量的非标记抗体(或抗体片段)结合于固态支承物或载体，再加入一定量的可检测地标记的可溶性抗体，以检测和/或定量分析固相抗体、抗原和标记抗体之间形成的三元复合物。
典型地同时也是优选地，免疫测定包括“向前式”测定(“forward”assays)，其中将结合于固相的抗体先与被测试样品接触，从而通过形成二元的固相抗体-抗原复合物而将抗原从样品中吸出。在培育适当时间后，洗涤固态支承物或载体以去除液体样品的残余物，包括未反应的抗原(如果有的话)，然后再与含有未定量的标记抗体(作为“报告分子”)的溶液接触。第二次培育使标记抗体通过未标记抗体与结合于固态支承物或载体上的抗原形成复合物之后，再次洗涤固态载体或支承物以去除未反应的标记抗体。
在另一种也可用于本发明抗原的“三明治式”测定中，可以使用所谓的“同步”或“反式”。“同步”测定涉及一个培育步骤，因为结合于固态支承物或载体的抗体和标记的抗体两者是同时加入至被测试的样品中。在培育之后，洗涤固态支承物或载体以去除残余液体样品和非复合的抗体。与固态支承物或载体相连的标记抗体的存在可如在传统的“向前”三明治式测定那样进行确定。
在“反式”分析中，按步骤将标记抗体的溶液加于液体样品，再在适当培育时间之后将结合于固态支承物或载体的未标记抗体加入。再次培育之后，固相用常规方式洗涤以洗去被测试样品的残余物以及未反应的标记抗体溶液。再如“同步”和“向前”或测定那样确定与固态支承物或载体相连的标记抗体。
本发明还提供编码如上定义的本发明任一种蛋白质的DNA分子，含有任何这种DNA分子的可复制表达载体，用任何这种表达载体转化的宿主细胞，包括原核和真核细胞，较佳的是猴COS细胞。
本发明还包括产生本发明任一蛋白质的方法，包括培养本发明的转化细胞和回收由该转化的宿主细胞内的DNA分子和表达载体编码的蛋白质。
本发明由下列不起限制作用的实施例进一步阐明实施例1尿IFNAB-BP的蛋白质顺序分析如以色列专利申请106591号中所述而获得的纯IFNAB-BP被吸附于PVDF膜上(Pro-Spin，Applied Biosytems，美国)，将膜用475型微量测序仪(Applied Biosystems，美国)进行蛋白质顺序分析。获得下列主顺序 此外，检测到另一个在主顺序的N-端具有三个额外氨基酸残基(Ile-xxx-Tyr)的多肽，xxx代表未确定的氨基酸。得到的顺序完全不同于已知的IFN-αB受体(IFNAR，参考文献14)，也不同于任何已知蛋白质。用Fast A(33)程序经Swissprot和Genebank数据库检索确定，它也不同于任一由已知DNA顺序编码的蛋白质。因此，该蛋白质是一种新的IFX-α结合蛋白。通过cDNA克隆的分离(见下文)，已清楚残基10是Cys而不是Arg，而残基15是Ser而不是Arg。此外，xxx被确定为Ser。大家知道，Cys不能由蛋白质微量测序仪测出，而且有时候Ser在分析过程中被破坏从而鉴别不出。
一份尿IFNAB-BPⅠ样品用溴化氰(CNBr)消化，在SDSPAGE上分开，并印迹于PVDF膜。用考马斯亮蓝染色，在膜上检测到七条分开的不同肽带，命名为Cb1-Cb7。切下每条带并经蛋白质微量测序，其中一种肽即Cb7，分子量小于10，000并具有下列内部顺序(Met在实际顺序之前)Met-Val-Lys-Phe-Pro-Ser-Ile-Val-Glu-Glu-Glu-Leu-Gln-Phe-Asp-Leu-1 5 10 15Ser-Leu-Val-Ile-Glu-Glu-Gln-Ser-Glu-Gly-Ile....
20 25 27另一条肽Cb3具有下列顺序(Met在实际顺序之前)Met-Ser-Lys-Pro-Glu-Asp-Leu-Lys-Val-Val-Lys-Asn-XXX-Ala-Asn-1 5 10 15Thr-Thr-Arg....
18经cDNA顺序确定(见下文)残基13后来被鉴别为Cys。Cys残基不能在蛋白质微量测序中测出。
另一条肽Vb6具有下列顺序(Met在实际顺序之前)
Met-Ser-Gly-XXX-Phe-Thr-Tyr-Ile-Ile-Asp-Lys-Leu-Ile-Pro-Asn-1 5 10 15Thr-Asn-Tyr....
18经cDNA顺序确认(见下文)，残基4后被确定为Asn。Asn残基是潜在的糖基化信号顺序(Asn-Phe-Thr)的一部分，而在蛋白质顺序中缺少Asn信号表明它的确被糖基化了。
通过顺序表明，其余肽带是溴化氰(CNBr)不完全消化的产物。它们或有以前发现的IFNAB-BPⅠ一端区域顺序，或有同样的Cb3、Cb6或Cb7的内部顺序。
实施例2尿IFNAB-BPⅠ的C-端肽的蛋白质顺序分析一份尿IFNAB-BPⅠ样品(约10微克)用二硫苏糖醇(DTT)还原，用碘乙酰胺烷基化，再用内蛋白酶Lys C(Boehringer Mannhein，德国)按150的酶与底物之比进行消化。得到的肽混合物用RP-HPLC(高效液相色谱)。在RP18柱(Aquapore RP18，Applied Biosystems，Inc.)中使用溶于0.1%三氟乙酸水溶液的乙腈梯度而分开。各肽峰共价联于Sequalon AA膜上(Millipore，Bedford MA)，再如上进行N-端顺序。其中一种肽经确定，为具有如下顺序的C-端肽Cys.Thr.Leu.Leu.Pro.Pro.Gly.Gln.Glu.Ser.Glu.Phe.Ser1 5 10 13该C-端顺序对应于4.5kb cDNA克隆(见下文)的一端，而且可根据最后两个氨基酸残基(Phe12-Ser13而不是Ser-Ala)，将其与由1.5kb cDNA编码的假定蛋白的C-端区分开。因此，从尿中分离得到的可溶性受体被鉴别为IFNAB-BPⅡ。它是由特定的4.5kbRNA独立翻译而成，而不是由细胞表面受体蜕变而成。
实施例3构建简并性有意义和反意义引物以及确定IFNAB-BP cDNA的非简并顺序肽Cb7的顺序被反向翻译成有意义引物(氨基酸1-8)和反意义引物(氨基酸27-20)。分别将含BamHI和SalI限制性核酸内切酶位点顺序的十个核苷酸和九个核苷酸各自加到引物寡核苷酸的5′端(图(A))。从Daudi和WISH细胞中抽提总RNA。最初的cDNA链通过使用反意义寡核苷酸混合物或寡聚d(T)作为引物由反转录酶产生。得到的cDNA片段再使用混合在一起的有意义和反意义简并性引物在聚合酶链反应(PCR)中扩增。在3%琼脂糖凝胶上分析PCR产物，可见来自Daudi和WISH细胞的期望的101bp带(图1B)。用BamHI和SalI限制性消化101bp片段，再克隆入pBluescript KS+(stratagene)，测序了5个克隆。两侧为有意义和反意义引物区域的顺序是不变的，并编码肽Cb7的氨基酸残基9-19的预期顺序(图1C)。人工合成了对应于非简并性内部顺序的35bp的寡核苷酸，用于筛选cDNA库。
实施例4鉴别部分IFNAB-BPⅠ的cDNA克隆用〔32P〕标记实施例3中人工合成的35bp非简并性寡核苷酸，并用于筛选人HeLa细胞的λgt11cDNA库(Clontech)。鉴别出5个阳性克隆，其中之一命名为q10，含有1.4kb的插入段。对q10克隆顺序得到一个具有开放阅读框区的顺序，在其中鉴别出信号肽细胞外区，穿膜和部分细胞内区(图2)。在q10克隆DNA所编码的细胞外区中鉴别出编码尿IFNAB-BPⅠN-端蛋白质顺序以及三个溴化氰(cNBr)肽Cb3、Cb6和Cb7顺序的DNA顺序。部分Cys和Ser残基(点线标出，图2)在蛋白质测序中被错认。然而，已知蛋白质顺序方法测不出Cys，并偶尔也会遗漏Ser残基。肽Cb6中的一个Asn残基也没有测出，表明它被糖基化了。将q10克降的DNA顺序与Genebank数据库进行比较，没发现与任何已知顺序有同一性。因此，该克隆含有一个新的DNA顺序。
实施例5人mRNA的Northern印迹分析从q10克隆制备放射性标记的DNA探针，并用与来自两个人细胞系Daudi和WISH的poly A+mRNA进行Northern印迹杂交。在两种情况下都观察到两条特异性带，一条对应于1.5kb，另一条对应于4.5kb。根据带的强度估计，1.5kb mRNA的量约为4.5kb mRNA的2倍。WISH细胞的RNA信号刚够看出，而Daudi细胞的RNA信号是检测出的(图3)。1.5kb mRNA被翻译成IFNAB-BPⅠ的前体，这是一个细胞表面干扰素受体。长的mRNA代表另一种不同的转录物，编码另一个与IFNAB-BPⅠ共有至少100个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质是IFNAB-BPⅡ的前体，后来表明是α/β-干扰素受体的一种可溶性形式。
实施例6鉴别IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的完整cDNA克隆用PCR方法从q10克隆的编码区域制得397bp探针，再用它来筛选构建于噬菌体λpCEV9中的人单核细胞cDNA库(Gutkind，J.S.等人，Molecu.Cell，Biol，11，1500-1507，1991)。从106个独立的噬菌体中分离到22个带1.5kb插入段的克隆以及2个带4.5kb插入段的克隆。对2个1.5kb克隆(λpCEV9-m6和λpCEV9-m24)以及2个4.5kb克隆(λpCEV9-m19和λpCEV9-m27)的全部开放阅读框进行DNA顺序分析。1.5kb克隆编码一个完整的IFNAB-BPⅠ前体，是一种细胞表面受种，具有的开放阅读框为331个密码子(图4)。得自尿IFNAB-BP的蛋白质和溴化氰(CNBr)肽顺序(点线标出，图4)都经鉴别在翻译的DNA顺序中。2个4.5kb克隆的部分顺序揭示有与存在于1.5kb克隆中相同的237个密码子的5′顺序，接着在密码子239之后为含有终止信号的不同顺序(图5)。总而言之，下列密码子是不同的密码子13(Leu而不是His);密码子108(Thr而不是Ile)以及密码子238-240(Phe-Ser-终止而不是Ser-Ala-Ser)。在两个4.5kb克隆的三种阅读框之中的任一种中，终止密码子以后看不到开放阅读框。因此，4.5kb cDNA编码截短的可溶性受体的前体即IFNAB-BPⅡ，C-端顺序与从尿中分离出的相同。编码IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ两者前体的两种mRNA来自同一基因，可能因拼接不同而产生。
实施例7构建哺乳动物表达载体和产生重组的可溶性IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ使用携带XbaI限制性位点(图6A)的人工合成的有意义和反意义引物，并用q10 DNA作为模板，在VENT DNA聚合酶存在下(Stratagene)通过PCR产生编码IFNAB-BPⅠ信号顺序和细胞外区的DNA。产生的PCR产物(图6B)用XbaI限制性消化，连入表达载体pEF-BOS，产生pEF-BOS-IFNAB-BPⅠ(图6C，参考文献46)。构建物经DNA测序确认。转化感受态大肠杆菌，分离出IFNAB-BPⅠ顺序取向正确的克隆。使用pEF-BOS-IFNAB-BPⅠ构建物转染猴COS细胞。这些细胞表达12纳克/毫升重组的可溶性IFNAB-BPⅠ，可从细胞培养的上清液中获得，并用ELISA和其抑制人α-和β-干扰素的生物学活性(抗病毒)而证实。类似地，将4.5kb克隆中的编码IFNAB-BPⅡ的DNA区域插入如上所述的针对IFNAB-BPⅠ细胞外区的哺乳动物表达载体中，并用来转化细胞。这样的细胞会产生分泌到该细胞的培养基中去的活性IFNAB-BPⅡ。
实施例8构建真核生物表达载体和在鼠中表达IFNAB-BPⅠ和IFNAR使用VENT DNA聚合酶(stratagene)，并用人工合成的携带XbaI限制性位点的有意义和反意义引物，以质粒pCEV9-m6为模板，通过PCR产生编码整个IFNAB-BPⅠ的DNA。得到的PCR产物用XbaI限制消化并连入表达载体pEF-BOS，得到pEF-BOS-IFNABR。对应IFNAR(14)的cDNA采用特异性寡核苷酸通过RT(反向转录)-PCR(48)而产生。扩增产物克隆入pEF-BOS表达载体(46)的XbaI限制性位点，得到pEF-BOS-IFNAR。这些构建物经DNA测序确认。转化感受态大肠杆菌分离出IFNAB-BPⅠ和IFNAR顺序取向正确的克隆。
开发稳定表达克隆IFNAB-BPⅠcDNA的鼠细胞。用磷酸钙沉淀法(49)将pSV2 neo(2微克)和pEF-BOS-IFNABR(10微克DNA)一起共转染指数式生长的NIH-3T3细胞(1.5×106于10厘米平板)。鉴定出独立的氨基糖苷酸抗生素(G418)抗性并亚克隆。通过与针对尿IFNAB-BPⅠ的抗体的结合以及通过与125I-IFN-α2的结合，鉴别出高水平表达IFNAB-BPⅠ的克隆(表Ⅳ)。
对于与抗IFNAB-BPⅡ抗体的结合，将细胞(1×106)接种于35毫米孔中(6孔板，Costar)，培养至会合(20小时)。用含2%FBS和0.1%叠氨化钠(Wash介质)的DMEM(高葡萄糖)洗涤细胞，再与Wash介质培育20分钟。将兔抗IFNAB-BPⅡ抗体(2毫升，1500于Wash介质中)加入至洗涤过的孔中，细胞在室温培育2小时。细胞洗涤3次后，加入125I-蛋白A(2毫升，250，000每分钟计数(cpm)于Wash介质中)，再培育细胞45分钟。洗涤细胞3次，用胰蛋白酶收获细胞并计数。
对于与125I-IFN-α2的结合，将细胞接种于35毫米孔中(6孔板，Costar)，培养至会合(20小时)。用含2%FBS和0.1%叠氮化钠(Wash介质)的DMEM洗涤细胞，再与Wash介质培育20分钟。加入125I-IFN-α2(2-3×105每分钟计数(cpm)，108单位/毫克，5×107每分针计数/微克)，再在室温下培育2小时。洗涤细胞3次，用胰蛋白酶收获并计数。
在非还原条件下对阳性克隆(如369.11克隆)去垢剂处理的抽提物进行SDS-PAGE，再与上述的抗体进行免疫印迹分析，得到一条约51KDa的强带(图7)。
表达IFNAR的鼠细胞类似地用质粒pEF-BOS-IFNAR转染而形成。经人IFN-αB有效地在这些细胞中诱导抗病毒的应答能力确定470.6号克隆为IFNAR阳性。正如预期的那样，其它的Ⅰ型IFN(如人IFN-β)在470.6克隆中无活性。
表达IFNAB-BPⅠ和IFNAR的369.11和470.6克隆再用互补受体蛋白(分别为pEF-BOS-IFNAR和pEF-BOS-IFNABR)进行转染。为了稳定地共表达，表达IFNAR或IFNAB-BPI的G418抗性克隆用pSV2hygro(2微克)和上述的pEF-BOS-IFNABR或pEF-BOS-IFNAR一起转染。分离得到共表达IFNAR和IFNAB-BPI的潮霉素和G418抗性克隆并亚克隆。通过其对人IFN-αB的抗病毒的应答，鉴别出得自369.11克隆的为IFNAR阳性克隆。同时通过与抗IFNAB-BPⅡ抗体和125I-IFN-α2两者结合，鉴别出得自克隆470.6的为IFNAB-BPⅠ阳性克隆。来自369.11克隆的508.12克隆和来自470.6克隆的1306克隆与125I-IFN-α2和IFN-α/β抗体两者都结合(表Ⅳ)。此外，在抗病毒测试中它们对人IFN-αB有应答。因此，我们可下结论这些克隆既表达IFNAB-BPⅠ又表达一个功能性的IFNAR。
表Ⅳ 各种细胞中IFNAB-BPⅠ的表达结合 结合IFNAB-BPII125I-IFN-α2抗体细胞 每分钟计数(cpm) 每分钟计数(cpm)470.6(IFNAR) 236 90369.11(IFNAB-BPI) 4243 12,500508.12(IFNAB-BPI 7728 70,240和IFNAR)a1306(IFNAR和 3369 32,000IFNAB-BPI)ba 来自Clone 369.11b 来自Clone 470.6实施例9确定鼠细胞中表达的IFNAB-BPⅠ和IFNAR的亲合性对表达IFNAR或IFNAB-BPⅠ的克隆测试其与125I-人IFN-α2的结合，结合数据用Scatchard分析评估。将细胞(1×106)接种于35毫米孔中(6孔板，Costar)，培养至会合(20小时)。用含2%FBS和0.1%叠氮化钠(Wash介质)的DMEM洗涤细胞，再与同种介质培育20分钟，加入125I-IFN-α2(2-3×105每分钟计数(cpm)。108单位/毫克，5×107每分钟计数(cpm)/微克)以及指定浓度的未标记的IFN-α2，于室温培育2小时。用Wash介质克隆洗涤细胞3次，用胰蛋白酶收获并计数。结合数据用LIGAND程序(50)分析。
仅表达IFNAR的细胞(470.6克隆)并不表现任何与125I-IFN-α2的特异性结合(图8A)，因此，没有得到假设的结合位点的Kd值。与470.6克隆相反，在表达单独IFNAB-BPI的细胞(369.11克隆)中获得了高亲合力的、特异的和可饱和的结合。该结合的Kd值于23℃时为3.6×10-9M(表Ⅴ)。
125I-IFN-α2与508.12细胞(表达IFNAB-BPI和IFNAR两者)的结合用Scatchard分析评估，结果与369.11克隆(仅表达IFNAB-BPI)的结果进行比较。一旦其表达IFNAB-BPI和IFNAR，可获得饱和性的结合且与IFN-α2的亲合力增加约10倍(图8)，接近在Daudi细胞中受体的亲合力(Kd分别为4.0×10-10M对1.6×10-10M)。该结果表明IFNAR和IFNAB-BPI在配体结合中有协调作用。
表Ⅴ各种宿主细胞的结合特性(配体＝125I-IFN-α2)细胞(受体) 每个细胞的结合位点 20℃时的Kd(M)人Daudi 4900±11% 1.6×10-10470.6(IFNAR) 0 (-)369.11(IFNAB- 80,000±11% 3.6×10-9BPI)508.12(IFNAB-BPI 59,000±10% 4.07×10-10和IFNAR)实施例10确定尿IFNAB-BPⅡ的亲合性用制造商提供的自动程序将人IFN-α2固定于BIAcore(Pharmacia，瑞典)的传感片上，固定约30非摩尔(fmol)的IFN-α2。将在磷酸盐缓冲液(PBS)中稀释成若干种浓度(28-112纳摩尔(nM))的尿IFNAB-BPⅡ通过传感程序片，并且记录下结合和解离的程度(在PBS中)。根据得到的数据，计算出Kd值为3.12×12-9M(图9)。因此，尿IFNAB-BPⅡ的亲合力非常接近于在宿主细胞中表达的IFNAB-BPⅠ的亲合力。
实施例11在大肠杆菌、酵母和昆虫细胞中表达IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ
IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ也产生在其它重组细胞如原核细胞比如大肠杆菌，或其它真核细胞如酵母和昆虫细胞中。已有共知的用于构建合适的携带编码IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ及它们的活性片段DNA的载体的方法，也有已知的适合用于转化大肠杆菌和酵母细胞或感染昆虫细胞以产生重组IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的方法。为了在酵母细胞中表达，切出编码IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ的DNA(实施例5和6)，将其插入适合转染酵母细胞的表达载体。为了在昆虫细胞中表达，将编码IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ的DNA插入杆状病毒，再用该重组的杆状病毒感染昆虫细胞。为了在E.coli中表达，编码IFNAB-BPI和IFNAB-BPⅡ的DNA用适当的寡核苷酸进行定点诱变，从而将起始密码子ATG刚好插于成熟IFNAB-BPⅠ(图2)或IFNAB-BPⅡ的第一个密码子之前。或者，该DNA也可采用适当的有意义和反意义引物用PCR法制备。得到的cDNA构建物再用本领域共知的技术(35)插入到适当的构建好的原核生物表达载体中。
实施例12构建IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的重组融合蛋白产生含有融合于免疫球蛋白G1(IgG1)重链恒定区的IFNAB-BPⅡ或IFNAB-BPⅠ的配体结合区域的蛋白质可以按如下进行IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ的DNA用适当的寡核苷酸进行定点诱变，从而将单一的限制性位点刚好引入编码配体结合细胞外区的顺序之前和之后。或者，这样的DNA可采用特地设计的带限制性位点的引物，用PCR制备。另一个带IgG1重链恒定区的质粒，如pRKCO 42Fcl(47)，经过类似的定点诱变，从而在尽可能靠近IgG1重链Asp216之处引入同样单一的限制性位点，在这种方法可以翻译出融合蛋白。通过单一限制性位点处的消化制得含有5′不翻译顺序和编码IFNAB-BPⅡ或IFNAB-BPⅠ配体结合区域的一个双链DNA片段。诱变过的pRKCD42Fcl经类似地消化产生一个含质粒顺序和IgG1顺序的大片段。连接这两个片段产生一个新的质粒，它编码一个由IFNAB-BPⅡ或IFNAB-BPⅠ的配体结合区域以及IgG1重链约227个C-端氨基酸(绞链区和重链恒定区2和3(CH2或CH3)区域)组成的多肽前体。可以用适当的限制性酶消化从质粒中分离出编码融合蛋白的DNA，再插入到有效的原核或真核生物表达载体中。
实施例13构建IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ与IFNAR的重组融合蛋白产生含有融合于IgG1重链恒定区的IFNAB-BPⅡ或IFNAB-BPⅠ的细胞外区的蛋白质，可以如实施例12中那样进行。类似地可以产生融合于IgG1轻链恒定区的IFNAR的细胞外区的蛋白质。编码融合于IgG1重链恒定区的IFNAB-BPⅠ的配体结合区域或融合于IgG1重链恒定区的IFNAB-BPⅡ的真核生物表达载体和编码融含于IgG1轻链恒定区的IFNAR的细胞外区的真核生物表达载体一起共转染适当的哺乳动物宿主细胞。阳性转染子会分泌一种复合蛋白，由IgG1恒定区、替代IgG1轻链可变区的IFNAR的细胞外区，以及替代IgG1重链可变区的IFNAB-BPⅡ或IFNAB-BPⅠ的配体结合区域组成。
在另一例子中，重链和轻链的恒定区被转换，即将IFNAR的细胞外区融合于IgG2重链恒定区同时将IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ的配体结合区域融合于IgG2轻链恒定区。
根据实施例9，与IFNAB-BPⅠ或IFNAB-BPⅡ的亲合力相比，预期的这些融合蛋白亲合力高约10倍。
实施例14制备抗IFNAB-BP的多克隆抗体最初用5微克尿IFNAB-BP的纯制剂与Freund完全佐剂混合成乳浊液皮下注射兔三周后再用5微克制剂的Freund非完全佐剂混合液进行皮下注射。再按10天间隔，用制剂的磷酸盐缓冲液溶液注射四次。在最后一次免疫后10天将兔放血。抗体水平发展之后，接着使用已用IFNAB-BP(1微克/毫升)于4℃涂覆过夜的96孔PVC板，在磷酸盐缓冲液(PBS)中进行固相放射免疫测定(sRIA)。此板再在PBS中用牛血清白蛋白(BSA，5%)、Tween20(Sigma美国，0.05%)于4℃阻断过夜。板再与5倍系列稀释的兔抗血清于室温反应4小时，洗涤后与125I-蛋白A(105每分钟计数(cpm)/孔)在PBS中于室温反应45分钟。再次洗涤板，切下各孔并计数。比对照抗血清高10倍计数的最大稀释的倒数为效价。5次注射后的效价大于160，000。
抗体水平发展后也可由抗血清阻断人IFN-α2抗病毒活性的能力测出。96孔板上预先形成的单层人WISH细胞与两倍系列稀释的抗血清于37℃一起培育1小时，在第一孔中起始稀释度为1250。再加入IFN-α2(10单位/毫升，浓度)于37℃一小时后，细胞受到水泡性口炎病毒的攻击。在7次免疫后的中和效价为120，000抗病毒单位/毫升。
实施例15制备抗IFNAB-BP的单克隆抗体首先用2微克纯化的IFNAB-BP与Freund完全佐剂混合成乳浊液注射雌性Balb/c小鼠(3个月大小)。三周后，皮下注射IFNAB-BP的Freund非完全佐剂混合液。按10天间隔，再皮下注射IFNAB-BP的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液三次。经sRIA测定(见实施例9)，获得的结合效价为160，000。在融合之前4天和3天将最终激发剂量腹腔注射具有最高结合效价的小鼠。使用NSO/1骨髓瘤细胞系和从作为融合对象的动物脾和淋巴结制得的淋巴细胞，进行融合。融合细胞被分布于微培养板中，在添加HAT和15%马血清的DMEM中选择杂交瘤。将发现能产生抗IFNAB-BP抗体的杂交瘤用限制稀释法亚克隆，并注入已接触降植烷以产生腹水的Balb/c小鼠中。用商品化的ELISA试剂盒(Amersham，英国)定出抗体的同型。
筛选产生抗IFNAB-BPⅠ单克隆抗体的杂交瘤的过程如下用反向固相放射免疫测定法(IRIA)测试杂交瘤上清液中是否存在抗IFNAB-BP抗体。在PVC微效价板(Dynatech Laboratories，Alexandria，VA)上涂覆亲合纯化过的山羊抗鼠血清(F(ab)2分段(F(ab)2)抗体(Jackson Labs，美国)(10微克/毫升，100微升/孔)。在4℃培育过夜后，用含牛血清白蛋白(BSA)(0.5%)和Tween20(0.05%)的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，并在洗涤溶液中于37℃至少阻断反应2小时。加入杂交瘤培养物上清液(100微升/孔)，然后板在37℃培育4小时。再用洗涤溶液洗三次，加入125I-IFNAB-BP(100微升，105每分钟计数(cpm)，再于4℃培育16小时。板再洗涤3次，切下各孔，用γ计数器计数。比阴性对照值高至少5倍的计数样品被认为是阳性的(表Ⅵ)。选出5个阳性克隆，将其亚克隆供进一步研究，并定性分析。所有克隆都是IgG1同型。
表Ⅵ产生抗IFNAB-BP单克隆抗体的克隆。
实施例16IFNAB-BP与单克隆抗体的亲合层析使用抗IFNAB-BP抗体通过亲合层析纯化IFNAB-BP。在本实施例中克隆抗体5.73号被用于亲合层析。用50%饱和(NH4)2SO4沉淀、再经针对磷酸盐缓冲液(PBS)的整体性透析纯化含由杂交瘤5.73号分泌的单克隆抗体的腹水液。按制造商所规定的那样，将约10毫克免疫球蛋白结合于1毫升Affigel 10(Bio-Rad，美国)上。
在4℃，0.25毫升/每分钟流速条件下，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤柱，直至在洗出液中检测不到蛋白质。用25毫摩尔M柠檬酸缓冲液，pH2.2(8×1柱体积组份)，洗脱出IFNAB-BP，再立刻用1摩尔Na2CO3中和。洗脱组份SDS-PAGE的银染分析表明有一个分子量为40，000的主带。该制剂的进一步纯化用分子大小排阻层析完成。
实施例17IFNAB-BPⅡ的ELISA测试用抗IFNAB-BP单克隆抗体46.10号(Ig组份，120微升/孔，10微克/毫升于磷酸盐缓冲液(PBS)中)涂覆微效价板(Dynatech或Maxisorb，由Nunc制造)于4℃过夜。用含牛血清白蛋白(BSA)(0.5%)、Tween20(0.05%)和NaN3(0.02%)的磷酸盐缓冲液(PBS)(阻断溶液)洗涤板，并在同样溶液中于37℃阻断过夜。测试样品在含0.1%NP40和0.65摩尔NaCl的阻断溶液中经一系列二倍稀释(从14开始)，然后加到孔中(100微升/孔)于37℃放置4小时。再用含0.05%Tween20磷酸盐缓冲液(PBS)(PBS/Tween)洗涤板3次，再加入兔抗IFNAB-BPⅡ血清(11000于个含NaN3的阻断溶液中，100微升/孔)，进一步于4℃培育过夜。板用PBS/Tween(100微升/孔)洗涤3次，加入山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP，Jackson Labs，110，000于PBS/Tween中，10微升/孔)的结合物，于室温放置2小时。用PBS/Tween洗涤板3次，通过向每个孔中加入100微升新制备的ABTS溶液(2，2′-连氮基-双(3-乙基苯基噻唑啉-6-磺酸，Sigma，10毫克;6.4毫升H2O;2.2毫升0.2摩尔Na2HPO4;1.4毫升0.2摩尔柠檬酸;1微升H2O2)作为底物显色。显色30分钟后，加入100微升/孔的0.2摩尔柠檬酸停止反应。用自动ELISA读数仪于405nm处对板读数，对非特异性读数，波长修正为630nm。该测定检出的下限为30皮克/毫升(图10)。
上述具体实施例的描述揭示了本发明的一般性质，从而使其他技术人员通过应用目前的知道，为了各种应用能容易地修饰和/或改动这些具体实施例而没有背离本发明的一般构思，因而这些改动和修饰应是属于这些公开例子的等价事例的范围和内涵之中。应理解，此处所采用的措辞或术语是为了便于描述，而不起限制作用。
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权利要求
1.一种DNA分子，其特征在于，它编码一种选自IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ、它们的前体、IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的融合蛋白和突变蛋白，它们的功能衍生物及它们的活性片段的IFN-α/β结合蛋白。
2.一种DNA分子，其特征在于，它能在严紧条件下与权利要求1的DNA分子杂交，而且它编码的蛋白质具有与IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ、它们的融合蛋白和突变蛋白、功能衍生物或它们的活性片段相同或相似的生物学活性。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，转录时，它提供一种选自下列的mRNA分子约1.5kb mRNA分子，其翻译时提供一种IFNAB-BPⅠ前体;和约4.5kb mRNA分子，其翻译时提供IFNAB-BPⅡ。
4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的DNA分子，其特征在于，编码IFNAB-BPⅠ蛋白质、前体、融合蛋白、突变蛋白、功能衍生物或活性片段。
5.如权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，具有图2所示的顺序。
6.一种DNA分子，其特征在于，含有编码成熟IFNAB-BPⅠ的顺序。
7.如权利要求1-3中任一权利要求所述的DNA分子，其特征在于，它编码IFNAB-BPⅡ蛋白质、前体、融合蛋白、突变蛋白、功能衍生物或活性片段。
8.一种DNA分子，其特征在于，含有编码成熟IFNAB-BPⅡ的顺序。
9.一种可复制的表达载体，其特征在于，含有如权利要求1-8中任一所述的DNA分子，并能在转化子宿主细胞中表达任一所述的IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ、它们的前体、融合蛋白、突变蛋白、功能衍生物、活性片段，且它们具有与所述的IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ、其融合蛋白和突变蛋白、功能衍生物或活性片段相同或相似的生物学活性。
10.如权利要求9所述的可复制的表达载体，其特征在于，含有如权利要求3所述的DNA分子并且能在所述转化子宿主细胞中表达选自IFNAB-BPⅠ和IFNAB-BPⅡ的IFNAB-BP。
11.如权利要求9所述的可复制的表达载体，其特征在于，它是质粒pEF-BOS-IFNAB-BPⅠ而且能够在所述转化子宿主细胞中表达IFNAB-BPⅠ分子。
12.用如权利要求9-11中任一所述的表达载体转化的宿主细胞。
13.如权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于是原核细胞。
14.如权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于是真核细胞。
15.如权利要求14所述的宿主细胞，其特征在于，该真核细胞是猴COS细胞。
16.如权利要求15所述的宿主细胞，其特征在于，该猴COS细胞用如权利要求11所述的表达载体转化。
17.一种产生重组IFNAB-BP的方法，其中重组IFNAB-BP选自IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ，它们的融合蛋白、突变蛋白、功能衍生物和活性片段，其特征在于，包括培养如权利要求12-16之一所述的转化的宿主细胞，和回收IFNAB-BP。
18.一种IFN-α/β结合蛋白及该结合蛋白的盐，其特征在于，结合蛋白选自IFNAB-BPⅠ、IFNAB-BPⅡ、它们的突变蛋白、融合蛋白、功能衍生物和活性片段。
19.如权利要求18所述的IFN-α/β结合蛋白，其特征在于，由权利要求1-8之一所述的DNA分子编码。
20.如权利要求18所述的IFN-α/β结合蛋白，其特征在于，由含于如权利要求9-11之一所述的可复制表达载体中的DNA顺序编码。
21.如权利要求18所述的IFN-α/β结合蛋白，其特征在于，由如权利要求12-16之一所述的宿主细胞表达和产生。
22.一种药物组合物，其特征在于，含有如权利要求18-21之一所述的IFN-α/β结合蛋白。
23.如权利要求22所述的药物组合物，其特征在于用于调节IFN-α或IFN-β活性。
24.如权利要求23所述的药物组合物，其特征在于，用于阻断或抑制IFN-α或IFN-β活性。
25.一种抗IFNAB-BP的抗体。
26.如权利要求25所述的抗体，其特征在于，是多克隆抗体。
27.如权利要求25所述的抗体，其特征在于，是单克隆抗体。
28.如权利要求25-27之一所述的抗体，其特征在于，是抗IFNAB-BPⅠ的抗体。
29.如权利要求26-27之一所述的抗体，其特征在于，是抗如权利要求18所述的IFN-α/β结合蛋白的抗体。
30.如权利要求26-27之一所述的抗体，其特征在于，是抗如权利要求19所述的IFN-α/β结合蛋白的抗体。
31.如权利要求27-29之一所述的抗体，其特征在于，是抗IFNAB-BPⅡ的抗体。
32.如权利要求25-31之一所述的抗体，其特征在于，用于免疫测定。
33.如权利要求25-31之一所述的抗体，其特征在于，用于免疫纯化。
全文摘要
本发明提供了IFN-α/β结合蛋白，它们能调节α-干扰素亚型以及β-干扰素的活性。还提供了编码这些蛋白质的DNA分子的克隆过程、在宿主细胞中的表达及针对这些蛋白质的抗体。
文档编号C07K16/00GK1109505SQ9510019
公开日1995年10月4日 申请日期1995年2月7日 优先权日1994年2月7日
发明者巴蒂亚·科恩, 达妮埃拉·诺维克, 梅纳赫姆·鲁宾斯坦 申请人:依达研究发展有限公司