一种乙型干扰素IFN－β－cn及其突变体的制作方法

专利名称：一种乙型干扰素IFN－β－cn及其突变体的制作方法
技术领域：
本发明属于一种用基因工程技术生产的人IFN-β-cn干扰素蛋白及其突变体。
背景技术：
在急性病毒感染过程中，机体有不同的防御机制，包括细胞免疫、体液免疫以及干扰素系统、发热等非特异性因子。但干扰素系统是目前所知的机体防御反应中出现最早的，在感染的几小时内就起作用，所以称其为第一线防御系统。大多数病毒或多或少地都对干扰素的抗病毒作用敏感，因而干扰素的抗病毒作用是广谱的。当干扰素系统在急性病毒感染时被激活后，动物可以在1～3周时间内对其他病毒的重复感染有抵抗。保护性抗体比干扰素的出现要晚得多，一般在病毒感染发生后3天或更迟些时间出现于血清中，它是特异性地由病毒抗原所引起的，它也特异性地对相关抗原起作用。抗体通过与病毒结合使其转变为非感染性而发挥抗病毒作用。但是，由于抗体仅在血清和细胞外液中存在，故它对在细胞内繁殖的病毒作用不大(Samuel C.，Clinical Microbiology Review，2001，14778-809)。
干扰素不是直接与靶分子发挥作用，而首先要与靶细胞表面的特异性受体相结合，通过信号传递，引发一系列特定的生化反应，刺激细胞内多种效应蛋白质分子合成。其中某些新合成的蛋白质可以抑制病毒繁殖，从而发挥干扰素的功能。这些杀病毒蛋白包括RnaseL、PKR，MxProtein、ISG56、ADAR1/2、P200家族和RANTES。而其它新合成的蛋白质可以提高机体免疫能力。它们包括MHC I/II、Interleukin-15和iNOS(Grandvaux N，et.al.，Current Opinion in Infectious Disease，2002，15259-267)。
干扰素是一种糖蛋白。目前所知，人的干扰素主要有α、β、γ、ω、г五个型号。其中，α、β、γ三种型号为主要的干扰素，因此，科学家对它们研究较多(Michael D.，BioTechniques，2001，33S58-S65)。一般认为，两种主要的病毒干扰素，即IFN-α和IFN-β，利用相同的信号传递网络，引发一系列特定的生化反应，刺激细胞合成相同效应分子来对抗病毒。但是，近期研究结果显示，IFN-α和β的信号传递网络和所诱导的效应分子也不完全相同。IFN-β的抗病毒功能经过多年的研究已经得到证实(Samuel C.，Clinical Microbiology Review，2001，14778-809)。如果将老鼠体内的IFN-β基因切除，这样的老鼠就对病毒失去抵抗力量，尽管体内的所有IFN-α基因都正常。因此，IFN-β是机体防御病毒的必需部分，它的功能是IFN-α所无法取代的(Deonarain R，et.al.，J.Virology，2000，743404-3409)。其它研究也证明，IFN-α和IFN-β是干扰素防御系统中重要的组成部分，但它们功能和作用机制有区别。在用纤维肉瘤细胞所作的实验中，有20多个效应蛋白质分子只能由IFN-β，而不是IFN-α，刺激细胞合成(Der SD，et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，9515623-15628)。其中之一是PKR，一种激酶，它的功能是抑制病毒蛋白合成且导致病毒感染细胞自杀。另一个例子为HIF-1α，它属于转录因子，其功能是导致病毒感染细胞自杀。β-R1基因的表达也是由IFN-β控制的。它是一种趋化因子，其功能为调节体内免疫细胞的移动(Loetscher P，et.al.，J.Bio.Chem.，2001，2762986-2991)。在作用机制方面，IFN-β是通过受体α/βL传递信息的；而IFN-α主要是通过受体α/βS传递信息的(Platanias LC，et.al.，J.Bio.Chem.，1996，27123630-23633)。鉴于IFN-α和IFN-β的功能和作用机制有区别，且它们虽为防御病毒必需部分，但相互间又无法取代，这两个干扰素对不同的病毒有不同的敏感性。比如，美国USAMRIID(U.S.Army Medical Research Institute of InfectiousDiseases)发现IFN-β能抑制SARS病毒繁殖，而其它干扰素却不能。
IFN-β已在临床上应用于下列几方面●治疗多发性硬化症，可以减少复发，延缓残废进程(美国FDA网页http//www.fda.gov/cber/products.htm)。
●治疗病毒感染，包括丙型肝炎及相关肝癌(Alam J，CurrentOpinion in Biotechnology，1995，6688-691)。
●治疗肿瘤，包括尖锐湿疣，脑癌和黑素瘤(Alam J，CurrentOpinion in Biotechnology，1995，6688-691)。
人体基因具有人种差异性，即不同人种间其基因序列会有差异。这种差异在生物治疗上有重要意义，考虑到基因产品的生物活性，致免疫性及负作用，生物治疗最好用源自同种人种的基因产品，然而，在已有技术中尚无源自中国人的IFN-β基因的人工合成制品及其突变体，也未见与此相关的报道。

发明内容
本发明要解决至今尚无源自中国人的IFN-β基因的人工合成制品及其突变体，以致于在治疗相关疾病中存在治疗效果欠佳的问题，为此提供本发明的一种新的乙型干扰素IFN-β-cn及其突变体，本干扰素是用基因工程技术克隆了源自中国人的IFN-β基因，如此而命名为IFN-β-cn。
本发明采用的技术方案其特殊之处在于其所含碱基序列及所推测的氨基酸序列为atg agc tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga agc agc aat ttt cag 48Met ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln1 5 10 15tgt cag aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc 96Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu20 25 30
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其中，第47位氨基酸的密码子的第一个碱基是A。
由此可以看出，IFN-β-cn的氨基酸序列和已发表的IFN-β的氨基酸序列不同在于第47位。IFN-β-cn的第47位是蛋氨酸，而IFN-β的第47位为亮氨酸。这一差别是由基因碱基序列不同而造成的。IFN-β-cn的第47位氨基酸的密码子的第一个碱基是A；而IFN-β的第47位氨基酸的密码子的第一个碱基是C。
为进一步改善IFN-β-cn，本发明将其第17位的半胱氨酸改变为丝氨酸，改良后的突变体命名为IFN-β-cn Ser17。其碱基序列及所推测的氨基酸序列为atg agc tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga agc agc aat ttt cag 48Met ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln1 5 10 15agt cag aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc 96Ser Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu20 25 30aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag att aag cag atg cag 144Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Met Gln35 40 45cag ttc cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc tat gac atg ctc cag 192Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln50 55 60aac atc ttt gct att ttc aga caa gat tca tct agc act ggc tgg aat 240Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Glu Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn65 70 75 80gag act att gtt gag aac ctc ctg gct aag gtc tat cat cag ata aac 288Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc 366His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr100 105 110agg gga aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa aga tat tat ggg agg 384Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg115 120 125att ctg cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt cac tgt gcc tgg acc 432Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu tyr Ser His Cys Ala Trp Thr130 135 140ata gtc aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac ttc att aac aga ctt 480Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu145 150 155 160aca gat tac ctc cga aac tga 501Thr Gly Tyr Leu Arg Asn165从中可以看出，IFN-β-cn的第17位氨基酸的密码子的第一个碱基T用定位突变法转变为A。与IFN-β-cn相比，IFN-β-cn Ser17的活性提高约10倍，且更容易分离纯化，更稳定，提高了它在临床应用的价值。
发明将IFN-β-cn和IFN-β-cn Ser17插入表达质粒，再转化大肠杆菌，适合于大规模工业生产。
本发明可以通过以下技术措施来实现为研究源自中国人的IFN-β基因，本发明从一位中国人体内分离得到二倍体成纤维细胞。该细胞受Poly(I)·Poly(C)刺激以合成IFN-β-cn mRNA，然后将该细胞的mRNA分离。以所分离的mRNA为模板合成cDNA。再以cDNA为模板，用PCR方法将IFN-β-cn基因放大。放大后的基因用凝胶电泳分离，再用DNA重组技术将基因插入高效表达载体pTrp中。采用定位突变方法，把IFN-β-cn第17位的半胱氨酸改变为丝氨酸，来获得IFN-β-cn Ser17。分别将含有IFN-β-cn和IFN-β-cn Ser17基因的载体pTrp转化到大肠杆菌MM294中。含有表达载体的宿主MM294经发酵来大量表达IFN-β-cn和IFN-β-cn Ser17蛋白。经分离纯化后，IFN-β-cn的比活性介于1.0-3.0×107IU/mg；IFN-β-cn Ser17的比活性介于1.0-3.5×108IU/mg。


图1是质粒载体pTrp-IFN-β-cn/pTrp-IFN-β-cn Ser17的结构，该载体基于pBR322，外加大肠杆菌的trp启动子(插入在EcoRI和ClaI之间)；IFN-β-cn或IFN-β-cn Ser17受trp启动子控制。
图2是IFN-β-cn Ser17的SDS-PAGE电泳胶图。
图3是IFN-β-cn Ser17的RP-HPLC色谱图。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作详细说明。
(一)、IFN-β-cn的制备步骤1二倍体成纤维细胞的分离二倍体成纤维细胞是从胎盘蜕膜中分离而得。胎盘蜕膜在不含钙和镁的Hanks’s Balanced Saline Solution(HBSS)中切成细片，然后在37℃的震荡水浴中用0.5％的胶原酶和0.02％的脱氧核糖核酸酶降解20分钟。将上层液于1500×g离心5分钟后，沉淀混悬在HBSS中。混悬液先后用95微米和20微米的尼龙筛过滤。将滤液于1500×g离心5分钟后，沉淀混悬在30％Percoll溶液中。该混悬液再慢慢加在60％Percoll溶液表面。于800×g离心30分钟后，除掉上清液。沉淀细胞用PBS洗涤两次后，混悬于RPMI-1640(无酚红)+0.1mM丙酮酸钠+100U/ml的青霉素+100微克/ml链霉素+10％FCS(无类固醇)。细胞在37℃及5％CO2中培养一夜，接种浓度为1×105个/cm2。第二天，换相同培养液，以后每三天换一次培养液。细胞长满后，用trypsin+EDTA分养。细胞的纯度用细胞免疫化学法测定(使用cytokeratin和vimentin的抗体)。细胞的纯度大于95％。
步骤2刺激IFN-β-cn在二倍体成纤维细胞中合成二倍体成纤维细胞在含100微克/毫升Poly(I)·Poly(C)和50微克/毫升放线菌酮(Cycloheximide)的培养液中培养3小时后就可进行RNA分离。
步骤3分离RNA用生理盐水(PBS)清洗刺激过的二倍体成纤维细胞。将该细胞裂解于3.5-4.5毫升的异硫氰酸胍(4M)，冰上反应15分钟。在该裂解液中加入1.5-2.0毫升CsCl(5.8M)后，高速离心20小时，20-24℃，114000g。将沉淀的RNA溶解于TE缓冲夜，再用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)萃取，混匀，离心，分离水相。向水相中加2倍体积的乙醇和1/10体积的乙酸钠(3M，pH5.5)，混均，离心。将沉淀的RNA溶解于DEPC处理过的水。
步骤4cDNA的合成第一条cDNA链的合成使用如下反应5-10微克上述RNA+1微克oligo(dT)+40mM焦磷酸钠+30U AMV-RT+5微升10×反应液(内含dNTP)，用水稀释总体积为50微升，37-48℃/15-60分钟。
IFN-β-cn cDNA的扩增使用如下PCR反应0.01-0.1ng第一条cDNA链+0.1-1U Taq DNA聚合酶(Promega)+0.5-1.5mM MgCl2，+20-50mM每一个dNTP(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)+10-30pmoles每一个引物+5-10微升10×Taq反应液(Promega)+H2O，总体积为50-100微升。PCR反应条件94-96℃/1-2分钟，53-55℃/1-2分钟，70-72℃/1-2分钟，1-2个循环；94-96℃/1-2分钟，36-38℃/1-2分钟，70-72℃/1-2分钟，30个循环；94-96℃/1-2分钟，36-38℃/1-2分钟，70-72℃/10-15分钟，1个循环。
PCR反应使用的两个引物的碱基序列为(HindIII和BamH1切割位用下画线表出)引物15′-TATAAGCTTATGAGCTACAACTTGCTTGG-3′引物25′-TTAGGATTCTCAGTTTCGGAGGTAACCTG-3′步骤5分离和纯化cDNA步骤4中所获cDNA用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离。将IFN-β-cn的cDNA带切出(约500bp长)。用NaI(8M+0.022M DTT)把cDNA带于50-56℃融化5-10分钟。加入玻璃细珠，室温反应5分钟，离心30秒。用乙醇(75％+TE)清洗后，玻璃细珠上的DNA用TE于50-56℃洗脱5分钟。离心30秒，取上清液。
步骤6克隆cDNA到pTrp载体用限制性内切酶切割IFN-β-cn cDNA1微克DNA+10U HindIII+10U BamH1+3微升3号反应液(10×，New England Biolabs)+3微升BSA(1mg/ml)，用水稀释总体积为30微升，在37℃反应2小时。切割后DNA片段的分离和纯化如同步骤5。
用限制性内切酶切割pTrp载体1微克DNA+10U HindIII+10UBamH1+3微升3号反应液(10×，New England Biolabs)+3微升BSA(1mg/ml)，用水稀释总体积为30微升，在37℃反应2小时。切割后DNA片段的分离和纯化如同实施例5。所需的DNA片段为载体部分，约4kbp。
IFN-β-cn cDNA插入pTrp载体50ng酶切过的IFN-β-cn cDNA+15ng酶切过的pTrp+0.5-2.0U T4 Ligase(Promega)+1.5微升Ligase反应液(10×，Promega，内含ATP)，用水稀释至总体积为15微升，在14-16℃反应12-18小时。
转化大肠杆菌将上述15微升反应物用TE稀释至总体积为60微升，然后加入100微升感受态XL1 Blue大肠杆菌(制备方法详见“分子克隆”，T.曼尼阿蒂斯等，科学出版社，1987)。在冰上反应20-40分钟，再在42℃热激1-3分钟。加入500微升LB培养液，在37℃培养1-2小时。将整个培养液均匀地铺在LB-Agar培养基上(内含100微克/毫升氨苄青霉素)，在37℃培养15-20小时。
筛选克隆从对氨苄青霉素有抗药性的XL1 Blue大肠杆菌克隆中分离和纯化质粒(制备方法详见“分子克隆”，T.曼尼阿蒂斯等，科学出版社，1987)。如上所示，将质粒用HindIII和BamH1切割，然后用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，以证实质粒载体的结构如图1所示。具有正确载体结构的质粒再进一步作碱基测序列(Sanger方法，详见“分子克隆”，T.曼尼阿蒂斯等，科学出版社，1987)，来获得IFN-β-cncDNA的碱基序列。经筛选后，其中一个正确载体pTrp-IFN-β-cn-12用于以下步骤。
步骤7发酵培养将步骤6的pTrp-IFN-β-cn-12转化到大肠杆菌MM294。挑单个菌落接种于3ml LB培养基里(内含50微克/毫升氨苄青霉素)，37℃培养12小时，然后稀释到总体积为300ml LB培养基里(内含50微克/毫升氨苄青霉素)，37℃培养12小时，此即为发酵种子液。
发酵培养基柠檬酸钠 3mMKH2PO430mM(NH4)2SO474mMMgSO4·7H2O 3mMMnSO4·H2O 46μMZnSO4·7H2O 46μMCuSO4·5H2O 1-2μMFeSO4·7H2O 74μM葡萄糖 0.5％色氨酸 350μM
盐酸硫胺 0.002％氨苄青霉素 50μg/ml发酵时，pH保持于6.5±0.1；温度保持于37±1℃；溶解氧保持于30％。发酵时间14小时。
步骤8分离纯化发酵液经4000RPM离心，菌体用PBS(0.1M磷酸钠，pH7.4，0.15MNaCl)悬浮至100-200OD(680nm)。冰浴条件下超声破碎5分钟，10000×g离心10分钟，去上清液，沉淀物用PBS+2％SDS+10mM DTT溶解，用等体积仲丁醇(2-butanol)萃取，再用冰醋酸沉淀，沉淀溶解于0.1M磷酸钠(pH7.4)+10％SDS+10mM DTT+0.5mM EDTA。分别上Sephacryl S-200和Sephadex G-75。然后进行鉴定。
(二)、IFN-β-cn Ser17的制备步骤1～步骤6与(一)中的步骤1～步骤6相同。
步骤7定位突变IFN-β-cn第17位的半胱氨酸为丝氨酸定位突变使用QuickChang试剂盒(Stratagene，目录号200518)。
反应混合物5微升10×反应液+5-50ng pTrp-IFN-β-cn-12+125ng引物1+125ng引物2+1微升dNTP+1微升Pfu Turbo(2.5U/微升)，用水稀释至总体积为50微升，再在顶部加PCR油。PCR反应条件95℃/30秒，1个循环；95℃/30秒，55℃/1分钟，68℃/5分钟，12个循环。两个引物的碱基序列为引物15′-GCAGCAATTTTCAGAGTCAGAAGCTCCTGTG-3′引物25′-CACAGGAGCTTCTGACTCTGAAAATTGCTGC-3′PCR反应完后，加1微升DpnI(10U/微升)到反应混合物，于37℃反应1小时。
取1微升DpnI处理过的反应混合物，加入到50微升感受态XL1Blue大肠杆菌，按步骤6转化大肠杆菌。
筛选克隆从对氨苄青霉素有抗药性的XL1 Blue大肠杆菌克隆中分离和纯化质粒(制备方法详见“分子克隆”，T.曼尼阿蒂斯等，科学出版社，1987)。如实施例6所示，将质粒用HindIII和BamH1切割，然后用1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，以证实质粒载体的结构如图1所示。具有正确载体结构的质粒再进一步作碱基测序列(Sanger方法，可详见“分子克隆”，T.曼尼阿蒂斯等，科学出版社，1987)，来获得IFN-β-cn Ser17DNA的碱基序列。经筛选后，其中一个正确载体pTrp-IFN-β-cn Ser17-68用于以下步骤。
步骤8发酵培养与(一)中的步骤7相同，只是用pTrp-IFN-β-cn Ser17-68代替实施例1的步骤7中的pTrp-IFN-β-cn-12。
步骤9与实施例1中的步骤8相同。
(三)、IFN-β-cn Ser17的供药剂型IFN-β-cn Ser17的供药剂型为针剂。每一针剂内含冰冻干燥粉，包括300微克(约10MIU)IFN-β-cn Ser17，15毫克人白蛋白(USP)，15毫克甘露醇(USP)。用时加入1.2毫升0.54％NaCl溶液。给药途径为皮下注射。
IFN-β-cn和IFN-β-cn Ser17鉴定结果(1)SDS-PAGE图2是IFN-β-cn Ser17的SDS-PAGE电泳胶图，表明纯化后的IFN-β-cn Ser17只出现单一条带；SDS-PAGE胶用固绿染后，再作定量扫描，这样估计的纯度≥99％。IFN-β-cn的SDS-PAGE电泳胶图和IFN-β-cn Ser17的一致。
(2)RP-HPLC图3是IFN-β-cn Ser17的RP-HPLC色谱图，经对各峰作定量计算后，确定IFN-β-cn Ser17的纯度≥99％。IFN-β-cn的RP-HPLC色谱图和IFN-β-cn Ser17的一致。
(3)氨基酸分析氨基酸分析结果如表1所示表1 IFN-β-cn Ser17的氨基酸组成

注Ser，Trp，Cys和Pro的平均值按24小时数据计算。Cys的分析是由过甲酸氧化后进行得。
此氨基酸组成和基因序列推导的氨基酸组成一致。和IFN-β-cnSer17一样，IFN-β-cn的氨基酸组成和基因序列推导的氨基酸组成一致。
4)N-端测序IFN-β-cn Ser17的氨基酸N-端序列，共测序头30个氨基酸，结果如表2所示
表2 IFN-β-cn Ser17的氨基酸N-端序列

注实验用的样品总量为35nmol；Ser主要PTH-dehydroserine的形式回收；Cys主要以PTH-cystine的形式确认该结果和基因序列推导的氨基酸末端序列一致。注意基因序列推导的第一位氨基酸蛋氨酸已被大肠杆菌的MAP酶切除。和IFN-β-cnSer17一样，IFN-β-cn的N-端序列和基因序列推导的氨基酸末端序列一致。
(5)比活性通过细胞病变抑制法(Cytopathic Effect Inhibition Assay)测定生物活性，IFN-β-cn的比活性介于1.0×107-3.0×107IU/mg；IFN-β-cn Ser17的比活性介于1.0×108-3.5×108IU/mg。IFN-β-cn Ser17比IFN-β-cn的活性约高10倍左右
权利要求
1.用生物技术合成的一种乙型干扰素IFN-β-cn，其特征在于含有如下碱基序列和氨基酸序列，其中第47位氨基酸的密码子的第一个碱基是Aatg agc tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga agc agc aat ttt cag 48Met ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln1 5 10 15tgt cag aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc 96Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu20 25 30aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag att aag cag atg cag 144Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Met Gln35 40 45cag ttc cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc tat gac atg ctc cag 192Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln50 55 60aac atc ttt gct att ttc aga caa gat tca tct agc act ggc tgg aat 240Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Glu Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn65 70 75 80gag act att gtt gag aac ctc ctg gct aag gtc tat cat cag ata aac 288Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn85 90 95cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc 366His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr100 105 110agg gga aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa aga tat tat ggg agg 384Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg115 120 125att ctg cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt cac tgt gcc tgg acc 432Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu tyr Ser His Cys Ala Trp Thr130 135 140ata gtc aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac ttc att aac aga ctt 480Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu145 150 155 160aca gat tac ctc cga aac tga 501Thr Gly Tyr Leu Arg Asn165
2.如权利要求1所述的干扰素，其特征该干扰素是从中国人的IFN-β基因克隆的。
3.一种如权利要求1所述的干扰素在第17位的突变体，其特征是其第17位的半胱氨酸可被剪除或被另一个氨基酸所取代。
4.如权利要求3所述的突变体，其特征是所述的氨基酸为丝氨酸。
5.如权利要求4所述的突变体，其特征是含有如下碱基序列和氨基酸序列atg agc tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga agc agc aat ttt cag 48Met ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln1 5 10 15agt cag aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc 96Ser Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu20 25 30aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag att aag cag atg cag 144Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Met Gln35 40 45cag ttc cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc tat gac atg ctc cag 192Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln50 55 60aac atc ttt gct att ttc aga caa gat tca tct agc act ggc tgg aat 240Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Glu Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn65 70 75 80gag act att gtt gag aac ctc ctg gct aag gtc tat cat cag ata aac 288Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn85 90 95cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc 366His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr100 105 110agg gga aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa aga tat tat ggg agg 384Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg115 120 125att ctg cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt cac tgt gcc tgg acc 432Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu tyr Ser His Cys Ala Trp Thr130 135 140ata gtc aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac ttc att aac aga ctt 480Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu145 150 155 160aca gat tac ctc cga aac tga 501Thr Gly Tyr Leu Arg Asn165
6.用于治疗疾病的剂型，其特征是该剂型中含有如权利要求1和/或4所述的IFN-β-cn。
7.如权利要求6所述的剂型，其特征是所述的疾病是与IFN-β有关的疾病，包括病毒感染，细胞生长失调及免疫疾病。
8.一种含有如权利要求1所述碱基序列的重组质粒载体，其特征是该载体为采用了trp启动子的pBR322质粒。
9.一种由权利要求8所述的质粒载体转化的大肠杆菌MM294。
10.一种含有如权利要求4所述的碱基序列的重组质粒载体，其特征是该载体采用了trp启动子的pBR322质粒。
11.一种由权利要求10所述的质粒载体转化的大肠杆菌MM294。
全文摘要
本发明公开了从一位中国人的二倍体成纤维细胞内分离得到的一个新的乙型干扰素IFN－β－cn，以及它的基因序列和氨基酸序列。IFN－β－cn的47位为蛋氨酸，而IFN－β的47位为亮氨酸，这一差异不影响生物活性。本发明还公开了IFN－β－cn的突变体，即第17位的半胱氨酸改变为丝氨酸。该发明详细描述了IFN－β－cn及其突变体的克隆过程，表达载体，表达宿主，分离纯化和鉴定方法。这为大量生产及临床应用创造了良好条件。
文档编号A61P31/00GK1613872SQ200310113979
公开日2005年5月11日 申请日期2003年11月5日 优先权日2003年11月5日
发明者刘美星, 莫一平 申请人:浙江大学生物技术有限公司