人类分泌蛋白si-clp作为炎性调节因子的用途
【专利摘要】本发明公开了人类分泌蛋白SI-CLP作为炎性调节因子的用途。SI-CLP调控小鼠原代巨噬细胞内前炎性细胞因子IL-1β、IL-6和IL12的mRNA表达，并受IL-12和IL13的调控，能恶化胶原诱导小鼠关节炎的炎症。SI-CLP在体内作为炎性调节因子，参与炎性因子的平衡，促进类风湿性关节炎的炎症发展，SI-CLP缺失可以阻滞慢性炎症例如类风湿性关节炎慢性炎症的发展。因此，SI-CLP蛋白及其基因可以作为药物靶标应用于慢性炎症的治疗，并为慢性炎症治疗药物的筛选提供新的途径。
【专利说明】人类分泌蛋白S1-CLP作为炎性调节因子的用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物与新医药【技术领域】，特别涉及人类分泌蛋白S1-CLP作为炎性调节因子在医药研究领域的用途。
【背景技术】
[0002]巨噬细胞来源于骨髓CD34+祖细胞，发育为单核细胞，渗透至不同组织而分化为不同组织的特定类型。巨噬细胞是宿主防御反应的第一道屏障，可以通过两种不同的方式激活:一种由IFN-Y诱导的典型性激活，释放TNF-a、IL-U IL_6、IL-12、IL-15、IL-18、TGF-β等细胞因子；另一种由Th-2型细胞因子IL-4和IL-13激活，在过敏反应及寄生虫感染的防御反应中发挥重要作用，并且释放一些重要的效应分子，包括精氨酸家族、抵抗素家族分子、几丁质酶蛋白家族和intelectins蛋白家族。
[0003]类风湿性关节炎是一种以巨噬细胞浸润和关节炎症为主的慢性自我免疫性疾病。细胞因子在自我免疫性疾病、炎症等疾病中发挥着至关重要的作用，调节大部分免疫和炎症的进程。研究表明，类风湿性关节炎的发生发展与细胞因子TNF-α、IL-U IL_6、IL_8、IL-12和巨噬细胞-集落刺激因子等等相关。
[0004]巨噬细胞在类风湿性关节炎中数量大量增加，通过促进炎症发展和关节损伤参与其发生发展。巨噬细胞浸润至炎性滑膜，转变为A型滑膜细胞，被激活而释放与类风湿性关节炎慢性炎症相关的前炎性因子，促进慢性炎症的发展，并且通过不同机制加剧类风湿性关节炎软骨和骨破坏。
[0005]分泌蛋白 S1-CLP(stabilin-1 interacting chitinase-like protein)是最近被鉴定出来的几丁质酶蛋白家族或Glyco_18蛋白家族新成员，其编码基因为GL008，全长S1-CLP包含393氨基酸。通过序列比对发现，S1-CLP在进化中高度保守，人类S1-CLP与小鼠S1-CLP氨基酸序列具有90% —致性。S1-CLP的分泌由Th_2细胞因子激活，通过与胞吞/转运受体stabilin-1相互作用调节。有文献报道在呼吸道慢性炎症病人的支气管肺泡灌洗液、人类外周血白细胞和糖皮质激素治疗的病人中检测到S1-CLP蛋白的表达。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是了解S1-CLP与慢性炎症以及前炎性细胞因子之间的关系，提供一种阻滞慢性炎症例如类风湿性关节炎慢性炎症发展的方法。
[0007]考虑到S1-CLP与慢性炎性失调相关，本发明鉴定了慢性炎性失调病人例如RA病人外周血中S1-CLP的表达升高，并且利用C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠研究了S1-CLP对胶原诱导的类风湿性关节炎发病的影响。进一步检测了 S1-CLP对于前炎性细胞因子的影响，以及前炎性细胞因子对S1-CLP的影响。
[0008]本发明的研究结果显示:
[0009]1、S1-CLP作为炎性调节因子调控小鼠原代巨噬细胞内前炎性细胞因子IL-1 β、IL-6和IL-12的mRNA的表达。实验发现，S1-CLP上调C57B/L小鼠来源巨噬细胞内前炎性细胞因子IL-1 β、IL-6和IL12的mRNA表达。在C57B/L背景S1-CLP基因敲除小鼠来源巨噬细胞中，S1-CLP上调前炎性细胞因子IL-1 β，IL-6和IL12的mRNA表达。
[0010]2、小鼠原代巨噬细胞内S1-CLP作为炎性调节因子受前炎性细胞因子IL-12和IL13的调控表达上调。IL-12和IL-13均上调C57B/L小鼠来源巨噬细胞内S1-CLP mRNA的表达。
[0011]3、C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠血清中，IL-1 β、IL-6和IL-12中的蛋白质浓度降低。
[0012]4、C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠来源巨噬细胞的细胞培养上清中IL-1 β、IL-6蛋白质浓度降低。5、S1-CLP上调C57B/L小鼠及S1-CLP基因敲除小鼠来源巨噬细胞细胞培养上清IL-1 β、IL-6和IL-12的蛋白质浓度。
[0013]6、S1-CLP基因敲除小鼠对于胶原诱导的关节炎具有低敏感性。
[0014]7、S1-CLP加重胶原诱导关节炎小鼠的临床评分。
[0015]8、S1-CLP加重胶原诱导关节炎小鼠的关节肿胀。
[0016]9、S1-CLP加重胶原诱导关节炎小鼠的骨损伤。
[0017]基于上述研究，本发明提供分泌蛋白S1-CLP作为靶标用于筛选治疗慢性炎症的药物，以及用作慢性炎症治疗药物的药物靶标的用途。
[0018]上述以S1-CLP为药物靶标的慢性炎症治疗药物例如S1-CLP蛋白的特异性抗体，通过特异性抗体中和S1-CLP蛋白，以阻滞慢性炎症的发展。
[0019]本发明还提供S1-CLP基因作为慢性炎症治疗药物的靶标，例如敲除S1-CLP基因或通过RNA干扰技术降低S1-CLP基因的表达，从而抑制炎症的发展。S1-CLP基因还可以作为靶标用于筛选治疗慢性炎症的药物。
[0020]优选的，本发明所述慢性炎症指类风湿性关节炎。
[0021]本发明的实验表明，S1-CLP作为炎性调节因子调控小鼠原代巨噬细胞内前炎性细胞因子IL-1 β、IL-6和IL12的mRNA表达，并受IL-12和IL13的调控，能恶化胶原诱导小鼠关节炎的炎症。S1-CLP在体内作为炎性调节因子，参与炎性因子的平衡，促进类风湿性关节炎的炎症发展，S1-CLP缺失可以阻滞慢性炎症例如类风湿性关节炎慢性炎症的发展。这样研究成果为慢性炎症的治疗和药物研究提供了新的方法。S1-CLP蛋白及其基因可以作为药物靶标应用于慢性炎症的治疗，并为慢性炎症治疗药物的筛选提供新的途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1显示了 S1-CLP蛋白处理后的C57B/L小鼠原代巨噬细胞中IL-1 β、IL-6和IL-12的mRNA表达水平。
[0023]图2显示了 S1-CLP蛋白处理后的C57B/L背景S1-CLP基因敲除小鼠原代巨噬细胞中IL-1 β、IL-6和IL-12的mRNA表达水平。
[0024] 图3显示了 IL-12和IL-13处理后的C57B/L小鼠原代巨噬细胞中S1-CLP的mRNA表达水平。
[0025]图4显示C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL-1 β的蛋白质浓度降低。
[0026]图5显示C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL_6的蛋白质浓度降低。
[0027]图6显示C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL-12的蛋白质浓度降低。
[0028]图7显示S1-CLP基因敲除小鼠来源巨噬细胞的细胞培养上清IL-1 β的蛋白质浓度降低，并且S1-CLP上调野生型C57B/L小鼠以及S1-CLP基因敲除小鼠来源巨噬细胞细胞培养上清IL-1 β的蛋白质浓度。
[0029]注:图中WT指野生型C57B/L小鼠fl-CLP+指C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠(本发明下文中出现的简称所代表的意义均与此一致)。
[0030]图8显示S1-CLP基因敲除小鼠来源巨噬细胞细胞培养上清IL-6的蛋白质浓度降低，并且S1-CLP上调野生型C57B/L小鼠以及S1-CLP基因敲除小鼠来源巨噬细胞细胞培养上清IL-6的蛋白质浓度。
[0031]图9显示S1-CLP上调野生型C57B/L小鼠以及S1-CLP基因敲除小鼠来源巨噬细胞细胞培养上清IL-12的蛋白质浓度。
[0032]图10显示S1-CLP基因敲除小鼠对于胶原诱导的关节炎发病率明显低于野生型C57B/L 小鼠。
[0033]注:WT指野生型C57B/L小鼠；K0指C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠；+SI_CLP指小鼠腹腔注射S1-CLP(本发明下文中出现的简称所代表的意义均与此一致)。
[0034]图11显示S1-CLP加重C57B/L小鼠以及C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠基因敲除小鼠关节炎临床评分。
[0035]图12显示S1-CLP加重C57B/L小鼠以及C57B/L背景的S1-CLP基因敲除小鼠基因敲除小鼠关节肿胀。
[0036]图13显示S1-CLP加重C57B/L小鼠关节骨破坏。
【具体实施方式】
[0037]以下实施方案进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0038]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0039]实施例1S1-CLP提高C57B/L小鼠原代巨噬细胞中IL-1 β、IL_6和IL-12的mRNA表达
[0040]因为S1-CLP能够特异性的结合到分化的THP-1细胞和原代巨噬细胞表面，我们推测这种特异性的结合能够改变细胞的某种活性。分离小鼠后腿骨髓细胞，用密度梯度离心法分离单个核细胞，用改良型1640基本培养基加20% L929细胞培养基上清和10% FBS诱导7天,每天换液2次,7天后获得的贴壁细胞即为原代巨噬细胞,用lμg/ml S1-CLP蛋白(蛋白纯化参考文献见JB1l.Chem.2010，285，39898-39904)与贴壁的巨噬细胞孵育24小时，用PBS作为对照。收集处理后细胞，Trizol法抽提RNA。用逆转录试剂盒进行逆转录，根据操作者手册，通过 RTsystem(Promega, Madison, USA)用 IygS RNA 产生 cDNA。用 SYBRGreen qPCR kit进行定量real-time PCR(本发明中所有实施例原代巨噬细胞的获得以及定量Real-Time PCR的方法均与此相同)。
[0041]设计上下游引物(引物序列如序列表中SEQ ID N0.1和2所示)，通过定量real-time PCR对IL-1 β的mRNA表达进行定量。
[0042]设计上下游引物(引物序列如序列表中SEQ ID N0.3和4所示)，通过定量real-time PCR对IL-6的mRNA表达进行定量。
[0043]设计上下游引物(引物序列如序列表中SEQ ID N0.5和6所示)，通过定量real-time PCR对IL-12的mRNA表达进行定量。
[0044]设计actin上下游引物(引物序列如序列表中SEQ ID N0.7和8所示)，作为对照。
[0045]Real-Time PCR 条件:95°C 5 分钟；95°C 15 秒，58°C 10 秒，72°C 15 秒，50 个循环；72 0C 10 秒。
[0046]实验结果如图1所示，表明S1-CLP蛋白处理的野生型C57B/L小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞IL-1 β、IL-6和IL-12的mRNA表达水平上调。
[0047]实施例2S1-CLP提高C57B/L背景S1-CLP基因敲除小鼠原代巨噬细胞中IL-1 β、IL-6 和 IL-12 的 mRNA 表达
[0048]分离C57B/L背景S1-CLP基因敲除小鼠(购自于上海南方模式生物研究中心)后腿骨髓，用密度梯度离心法分离单个核细胞，用改良型1640基本培养基加20% L929培养基和10% FBS诱导7天，每天换液2次，7天后获得的贴壁细胞即为原代巨噬细胞，用
Iμ g/ml S1-CLP蛋白与贴壁的巨噬细胞孵育24小时，用PBS作为对照。收集处理后细胞，Trizol法抽提RNA。用逆转录试剂盒进行逆转录，通过定量Real-Time PCR对前炎性细胞因子IL-1 β ,IL-6和IL-12的mRNA表达进行定量(引物序列见序列表中SEQ ID N0.1、2、
3、4、5和6)。实验结果如图2所示，表明S1-CLP基因敲除的C57B/L小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞经S1-CLP蛋白处理后，IL-1 β、IL-6和IL-12的mRNA表达水平上调。
[0049]实施例3IL-12和IL-13上调C57B/L小鼠原代巨噬细胞中S1-CLP的mRNA表达
[0050]S1-CLP对于巨噬细胞前炎性细胞因子的调控促使我们检测S1-CLP是否受到前炎性因子的调控。分离的小鼠细胞用IL-Ιβ、IL-4、IL-12和IL-13处理48小时，收集处理后细胞，Trizol法抽提RNA。用逆转录试剂盒进行逆转录，设计引物如序列表中SEQ ID N0.9和10所示，通过定量real-time PCR检测S1-CLP表达水平变化。Real-Time PCR条件:950C 5分钟；95°C 15秒，66°C 10秒，72°C 15秒，50个循环；72°C 10秒。实验结果如图3所示，显示IL-12和IL-13明显上调S1-CLP mRNA表达。
[0051]实施例4S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL-1 β的浓度明显降低
[0052]S1-CLP对于前炎性细胞因子的相互调控作用促使我们检测S1-CLP基因敲除小鼠中血清中前炎性细胞因子的表达情况。对S1-CLP基因敲除小鼠及野生型小鼠进行眼眶取血。血液凝固后13000rpm离心15min，收集上清，-80°C保存待用。通过定量ELISA对前炎性细胞因子进行定量，并且与野生型小鼠比较。血清中的前炎性细胞因子所有操作均按照操作说明书进行。血清稀释10倍以后用相同方法检测。实验结果如图4所示，与野生型小鼠相比，S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL-1 β的浓度明显降低。
[0053]实施例5S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL_6的浓度明显降低
[0054]S1-CLP对于前炎性细胞因子的相互调控作用促使我们检测S1-CLP基因敲除小鼠中血清中前炎性细胞因子的表达情况。对S1-CLP基因敲除小鼠及野生型小鼠进行眼眶取血。血液凝固后13000rpm离心15min，收集上清，-80°C保存待用。血清中的前炎性细胞因子通过定量ELISA进行定量，并且与野生型小鼠比较。实验结果如图5所示，与野生型小鼠相比，S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL-6的浓度明显降低。
[0055]实施例6S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL-12的浓度明显降低
[0056]S1-CLP对于前炎性细胞因子的相互调控作用促使我们检测S1-CLP基因敲除小鼠中血清中前炎性细胞因子的表达情况。对S1-CLP基因敲除小鼠及野生型小鼠进行眼眶取血。血液凝固后13000rpm离心15min，收集上清，-80°C保存待用。血清中的前炎性细胞因子通过定量ELISA进行定量，并且与野生型小鼠比较。实验结果如图6所示，与野生型小鼠相比，S1-CLP基因敲除小鼠血清中IL-12的浓度明显降低。
[0057]实施例7S1-CLP基因敲除小鼠骨髓来源巨噬细胞培养上清中IL-1 β浓度明显降低，并且S1-CLP处理明显提高野生型C57B/L小鼠和S1-CLP基因敲除小鼠巨噬细胞培养上清中IL-1 β的浓度。
[0058]本发明分析S1-CLP对于炎症的影响。分离并诱导培养野生型C57B/L小鼠和S1-CLP基因敲除小鼠骨髓来源巨噬细胞，7天后用lyg/mL S1-CLP蛋白处理24小时，收集细胞培养上清，通过定量ELISA对前炎性细胞因子进行定量，并且与野生型小鼠比较。实验结果如图7所示，S1-CLP敲除后，细胞上清中产生的IL-1 β浓度明显降低，用S1-CLP处理明显提高IL-1 β的浓度。
[0059]实施例8S1-CLP基因敲除小鼠骨髓来源巨噬细胞培养上清中IL_6浓度明显降低，并且S1-CLP处理明显提高野生型C57B/L小鼠和S1-CLP基因敲除小鼠巨噬细胞培养上清中IL-6的浓度。
[0060]本发明分析S1-CLP对于炎症的影响。分离并诱导培养野生型C57B/L小鼠和S1-CLP基因敲除小鼠骨髓来源巨噬细胞，7天后用lyg/mL S1-CLP蛋白处理24小时，收集细胞培养上清，通过定量ELISA对前炎性细胞因子进行定量，并且与野生型小鼠比较。实验结果如图8所示，S1-CLP敲除后，细胞上清中产生的IL-6浓度明显降低，用S1-CLP处理明显提高IL-6的浓度。
[0061]实施例9用S1-CLP处理小鼠骨髓来源巨噬细胞，明显提高野生型C57B/L小鼠和S1-CLP基因敲除小鼠巨噬细胞培养上清中IL-12的浓度。
[0062]本发明分析S1-CLP对于炎症的影响。分离并诱导培养野生型C57B/L小鼠和S1-CLP基因敲除小鼠骨髓来源巨噬细胞，7天后用lyg/mL S1-CLP蛋白处理24小时，收集细胞培养上清，通过定量ELISA对前炎性细胞因子进行定量，并且与野生型小鼠比较。实验结果如图9所示，S1-CLP处理小鼠骨髓来源巨噬细胞，明显提高培养上清中IL-12的浓度。
[0063]实施例10S1-CLP基因敲除小鼠对胶原诱导的关节炎具有低发病率
[0064]本发明为了更好地了解S1-CLP在类风湿性关节炎中的作用，用鸡胶原诱导小鼠类风湿性关节炎模型。鸡II型胶原溶解于0.1M醋酸，使用前终浓度为4mg/mL。在免疫小鼠前，鸡II型胶原用等体积的完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant, 4mg/mL)乳化。总共20只8-9周龄的C57BL/6J小鼠(10雄和10雌)和20只8-9周龄C57BL/6J背景的S1-CLP基因敲除小鼠尾根部注射溶解于CFA的鸡CI10.lmL，7天后用重新乳化的鸡CI10.05mL加强免疫。同时，20只8_9周龄的C57BL/6J小鼠(10雄和10雌)用PBS注射作为对照。第一次免疫后5-9周，每一组用半数(10只)的老鼠注射纯化的S1-CLP蛋白150 μ g，另外一半(10只)注射PBS作为对照。小鼠在第二次免疫后开始临床计分。对S1-CLP基因敲除小鼠的发病率进行评估，并且与野生型小鼠进行比较。累计发病率以及临床评分在第二次免疫以后开始计算。实验结果如图10所示，数据显示S1-CLP基因敲除小鼠的累计发病率明显低于野生型小鼠。
[0065]实施例1lS1-CLP基因敲除小鼠对胶原诱导的关节炎具有低的临床评分
[0066]通过临床评分对小鼠关节炎严重程度进行评估。临床评分在第二次免疫以后开始计算。关节肿胀按照如下标准:评分标准:0，无红肿；1，脚趾和踝关节轻微肿胀；2，脚趾和踝关节中度肿胀；3，脚趾和踝关节严重肿胀；4，整个脚趾、关节完全肿胀。每只老鼠4只脚计算，总分16分。
[0067]为明确S1-CLP的作用，半数(10/20)的胶原诱导关节炎小鼠通过腹腔注射S1-CLP，另外一半(10/20)用PBS处理作为对照。与对照组相比，S1-CLP处理加剧了胶原诱导关节炎小鼠的关节炎炎症。对关节肿胀进行临床计分发现S1-CLP基因敲除小鼠的关节炎严重程度明显低于野生型小鼠，并且S1-CLP能加重胶原诱导关节炎小鼠关节炎的临床评分(见图11)。
[0068]实施例12胶原诱导S1-CLP基因敲除关节炎小鼠的关节肿胀严重程度低于野生型小鼠
[0069]S1-CLP基因敲除关节炎小鼠的关节肿胀严重程度低于野生型小鼠，为进一步明确S1-CLP的作用，半数(10/20)的胶原诱导关节炎小鼠通过腹腔注射S1-CLP，另外一半(10/20)用PBS处理作为对照。与对照组相比，S1-CLP处理加剧了胶原诱导关节炎小鼠的关节炎肿胀(见图12)。
[0070]实施例13S1-CLP基因敲除小鼠的骨损伤严重程度低于野生型小鼠
[0071]为明确S1-CLP的作用，半数(10/20)的胶原诱导关节炎小鼠通过腹腔注射S1-CLP，另外一半(10/20)用PBS处理作为对照。X_ray检测放射性技术检测胶原诱导小鼠骨质破坏情况。放射性条件:MIKASA HF100H unit (MIKASA，Tokyo，Japan)，曝光参数42kV，2mA, 32msο实验结果如图13所示，可以看到原代小鼠具有明显的骨破坏，并且在S1-CLP处理后骨破坏加重，而S1-CLP基因敲除小鼠不明显。
【权利要求】
1.S1-CLP蛋白的用途，其特征在于，以S1-CLP蛋白作为治疗慢性炎症的药物的靶标。
2.S1-CLP蛋白的用途，其特征在于，以S1-CLP蛋白作为靶标筛选治疗慢性炎症的药物。
3.S1-CLP基因的用途，其特征在于，以S1-CLP基因作为治疗慢性炎症的药物的靶标。
4.S1-CLP基因的用途，其特征在于，以S1-CLP基因作为靶标筛选治疗慢性炎症的药物。
5.如权利要求1~4任一所述的用途，其特征在于，所述慢性炎症是类风湿性关节炎。
6.一种治疗慢性炎症的药物，其特征在于，所述药物以S1-CLP蛋白或其基因作为药物靶标。
7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物包含S1-CLP蛋白的特异性抗体。
8.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物包含S1-CLP基因的干扰RNA。
9.如权利要求6~8任一所述的药物，其特征在于，所述慢性炎症是类风湿性关节炎。
【文档编号】C07K14/52GK104130324SQ201310157501
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年5月2日 优先权日:2013年5月2日
【发明者】郑晓峰, 肖卫纯, 孟赓, 赵艳梅 申请人:北京大学