具有增强的抗炎活性和降低的细胞毒性的多肽以及相关方法

专利名称：具有增强的抗炎活性和降低的细胞毒性的多肽以及相关方法
技术领域：
本发明涉及用于设计治疗炎性疾病的治疗多肽的新方法。
背景技术：
尽管在将近40年之前就首次确认了免疫球蛋白的细胞受体，但是在最近的十年 间才发现了它们在免疫应答中重要作用。它们在免疫应答的传入和传出期中都起到关键作 用设定B细胞激活和抗体产生的阈值，调节树突细胞的成熟和将抗体响应的高度特异性 与效应器途径(effector pathway)耦联，如吞噬作用、抗体依赖性细胞的细胞毒性及炎性 细胞的募集和激活。它们在将体液免疫系统与先天效应细胞相耦联中的重要作用使得它们 成为受到关注的用于提高或限制抗体体内活性的免疫治疗靶标。抗体和抗体-抗原复合物与免疫系统细胞之间的相互作用产生多种应答，包 括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)、吞噬作用、炎 性介质的释放、抗体的清除和抗体的半衰期(综述参见Daron，Armu Rev Immunol, 15, 203-234(1997) ；Ward禾口Ghetie，Therapeutic Immunol, 2, 77-94 (1995) ；Ravetch禾口Kinet， Annu Rev Immunol，9，457-492 (1991)，各文献均通过引用方式结合在本文中)。抗体的恒定域并不直接参与抗体与抗原的结合，而是表现出各种不同的效应子功 能。取决于它们重链恒定区的氨基酸序列，抗体或免疫球蛋白可以划分为不同的类。有5 类主要的免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些类中的几种还可以进一步划分为亚类 (同种型)，例如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4 ；IgAl和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链 恒定区分别称为α、δ、ε、Y和μ。在各种不同的人免疫球蛋白类中，人IgGl和IgG3比 IgG2和IgG4更有效地介导ADCC。抗体进行木瓜蛋白酶消化产生了两个相同的抗体结合片段(称为Fab片段，各 片段具有单个的抗原结合位点)以及剩余的“Fe”片段(其名称反应了其容易结晶的能力)。Fc区对于抗体的效应子功能是至关重要的。人IgG Fc区的晶体结构已经被确定 (Deisenhofer, Biochemistry, 20，2361-2370 (1981)，其通过引用方式结合在本文中)。在 人IgG分子中，Fc区是由木瓜蛋白酶切割N末端至Cys，226产生的。一直以来，IgG被认为通过由其Fc片段介导的相互作用来介导促炎活性和抗炎活 性。因此，尽管Fc-FcyR相互作用是造成免疫复合物和细胞毒性抗体的促炎性质的原因，但 是静脉用丙种球蛋白(IVIG)及其Fc片段是抗炎的，并且广泛地用于抑制炎性疾病。该矛 盾性质的准确机理还是未知的，但是已经有人提出IgG的糖基化对于调节IgG的细胞毒性 和炎性能力是关键的。IgG在其两条重链的每一条上的CH2域中在Asn297包含单个N连接的聚糖。共价 连接的复合糖包含核心，含N-乙酰葡糖胺(GIcNAc)和甘露糖(man)的双触角五聚糖。核心 糖结构的进一步修饰在存在可变的岩藻糖、分支GIcNAc、半乳糖(gal)和末端唾液酸(sa) 部分的情况下在血清抗体中观察到。因此已经检测到超过40种不同的糖形(glycoform)共 价连接到该单一糖基化位点上(Fujii等人，J. Biol. Chem 265，6009 (1990))。已经表明IgG 的糖基化通过维持两条重链的开放构型对于与所有FcyR的结合是至关重要的(Jefferis 和 Lund, Immune. 1 Lett. 82，57 (2002)，Sondermann 等人，J. Mol. Biol. 309，737 (2001))。 IgG糖基化对于FcyR结合的这一绝对必要条件解释了去糖基化的IgG抗体不能介导体内 引发的炎性应答(如ADCC、吞噬作用和炎性介质的释放)的原因(Nimmerjahn和Ravetch， Immunity 24，19(2006))。还观察到IgG的单个糖形可能炎性应答的调节有影响，这已经由 所报道的包含或缺少岩藻糖的IgG抗体对单个FcyR的亲和力改变以及随之它们对细胞毒 性的影响所证明(Shields 等人，J. Biol. Chem. 277, 26733 (2002), Nimmerjahn andRavetch, Science 310,1510 (2005)) 0在患类风湿性关节炎和几种自身免疫血管炎(其中已经报道 了 IgG抗体的半乳糖基化和唾液酸化的降低)的患者中已经观察到自身免疫状态与IgG抗 体的特定糖基化模式之间的联系(Parekh等人，Nature 316，452 (1985)，Rademacher等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,6123(1994), Matsumoto 等人，128，621 (2000)，Holland 等 人，Biochim.Biophys.Acta Dec 27 ； [Epub ahead ofprint] 2005)。据报道，IgG 糖形的变 化也与老化相关和在免疫时出现，尽管还未确定这些改变在体内的重要性(Shikata等人， Glycoconj. J. 15，683 (1998)，Lastra 等人，Autoimmunity 28，25 (1998))。因此，需要发展考虑到体内IVIG性质的完全不同现象的产生多肽的方法。

发明内容
本发明通过提供这样的方法和分子来满足前述需要。一方面，本发明提供了包含 至少一个IgG Fc区的分离的多肽，所述多肽与未纯化的抗体制剂相比具有改变的性质，其 中所述分离的多肽的唾液酸化比未纯化的抗体制剂的唾液酸化高。在一个实施方式中，包 含至少一个IgF Fc区的分离的多肽被至少一个a 2，6键连接到相应的末端唾液酸部分上 的半乳糖部分糖基化，且其中所述多肽与未纯化的抗体相比具有较高的抗炎活性。在一个 实施方式中，包含至少一个IgF Fc区的分离的多肽被至少一个通过a 2，6键连接到相应的 末端唾液酸部分上的半乳糖部分糖基化，且其中与未纯化的抗体制剂相比，所述多肽与Fc 激活受体的结合降低。在进一步的实施方式中，该Fc激活受体选自Fc y RIIA、Fc y RIIC和 Fc yRIIIA。
一方面，分离的多肽来自重组源。另一方面，本发明提供了药物制剂，所述制剂包含含有至少一个Fc区、具有较高 抗炎活性的多肽以及合适的载体或稀释剂。另一方面，本发明提供了调节包含Fc区的多肽的性质的方法，包括改变Fc区的多 糖链的唾液酸化。在一个实施方式中，该方法包括提供包含至少一个Fc区的多肽的未纯化源，所 述包含至少一个Fc区的多肽的未纯化源包括包含具有多糖链的至少一个Fc区的多个多 肽，所述多糖链包含通过a 2，6键连接到半乳糖部分上的末端唾液酸，和包含缺少多糖链 的至少一个Fc区的多个多肽，所述多糖链包含通过a 2，6键连接到半乳糖部分上的末端唾 液酸；和提高所述包含具有多糖链的至少一个Fc区的多个多肽与所述包含缺少多糖链的 至少一个Fc区的多个多肽的比，所述多糖链包含通过a 2，6键连接到半乳糖部分上的末端 唾液酸。在再另一方面，本发明提供了治疗炎性疾病的方法，包括向需要的受试者施用包 含多个分离的多肽的治疗组合物，该多个分离的多肽各包含至少一个IgG Fc区，其中各个 Fc区的第一部分包含具有通过2，6键连接到相应的末端唾液酸上的半乳糖部分的相应糖 链；所述治疗组合物的剂量小于包含多个分离的多肽的第二组合物的剂量，该多个分离的 多肽各包含至少一个IgG Fc区，具有包含相应糖链的相应Fc区的第二部分，所述糖链具有 通过2，6键连接到相应的末端唾液酸上的半乳糖部分；和或者第一部分比第二部分大，从 而所述治疗组合物的剂量和所述第二组合物的剂量抑制炎症的程度基本相同，或者第一部 分比第二部分大，从而所述治疗组合物抑制炎症的程度比相同剂量的所述第二组合物高。附图简述

图1是显示SNA+FC连接的MALDI-Tof分析的示意图。图2总结了证明唾液酸和半乳糖之间a2，6键的富集提高了 IVIG Fc片段的抗炎 性能的试验。图3总结了证明唾液酸和半乳糖之间a2，6键的去除减弱了 IVIG Fc片段的抗炎 性能的试验。图4表明细胞毒性的降低并不依赖半乳糖和唾液酸之间的连接。图5表明2，6唾液酸化的IgG Fc的体内抗炎活性仅仅是IgG Fc聚糖的特性。
具体实施例方式本发明人惊奇地发现，IgG Fc域的细胞毒性和抗炎性反应是由Fc连接的核心多 糖的不同唾液酸化造成的。IgG抗体的细胞毒性在唾液酸化时降低；相反，IVIG的抗炎活性 增加。IgG的唾液酸化表明在诱导抗原特异性的免疫应答时被调节，因此提供了一种将IgG 从处于稳态的先天性抗炎分子转变为在抗原激发时的适应性促炎物质的新型方式。Fc-唾 液酸化的IgG与巨噬细胞上的独特受体结合，其随之上调抑制性Fcy受体(Fc yR)，因而防 止自身抗体介导的病变。一般地参见Ravetch禾口 Nimmerjahn，J.Experim. Medicine 24(1) 11-15(2007)。本发明人还进一步惊奇地发现，抗炎性反应依赖于半乳糖和唾液酸部分之 间连接的性质。IVIG的抗炎活性取决于Fc上的精确聚糖结构这一观察进一步支持了本 发明人之前提出的模型(Y. Kaneko, F. Nimmerjahn, J. V. Ravetch, Science313,670 (2006)；F. Nimmer jahn, J. V. Ravetch，JExp Med 204,11(2007))特定的凝集素受体而不是标准的 Fc受体参与该途经。作为本发明基础的数据支持了 2，6唾液酸化的Fc与在调节性骨髓细 胞群上表达的其同源凝集素受体的结合导致位于炎症位点(如发炎的关节)的效应巨噬细 胞上的抑制性IgG Fc的反式上调的模型，因而提高了细胞毒性IgG结合激活FcR和引发炎 性反应所需的阈值(F. Nimmerjahn, J. V. Ravetch, Science 310，1510(2005))。因此，本文提供了建立和选择具有理想的细胞毒性和抗炎能力的IgG的有利策 略。定义在本发明的整个说明书和权利要求中，免疫球蛋白重链中残基的编号为如Kabat 等 人’ Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th EdPublic Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)中的 EU 编码，该文献通 过引用方式明确地结合在本文中。“Kabat中的EU编码”是指人IgGlEU抗体的残基编号。术语“天然的”或“母本的”是指包含Fc氨基酸序列的未修饰的多肽。母本多肽 可以包含天然序列的Fc区或具有预先存在的氨基酸序列修饰(如插入、缺失和/或取代) 的Fc区。术语“多肽”是指包含至少一个IgG Fc区的蛋白质及其片段的任何片段，包括但 不限于全长功能性蛋白质，例如，举例来说抗体(如IgG抗体)。当本发明的多肽与未纯化 的抗体制剂对比时，这一制剂通常为来自哺乳动物(例如人类供体)的血液样品、血清样品 和/或IVIG样品。该制剂可以是未分级的或部分分级的，但是通常仅包含约2-4%唾液酸 化的含Fc的蛋白质。经富集或配制成具有免疫抑制活性的本发明的组合物通常包含至少 约5%或更多(例如5-10%、10-30%、30-50%、50-100%或其范围或区间)的唾液酸化的 含Fc的蛋白质。术语“Fc区”用于限定免疫球蛋白重链的C末端区域。“Fc区”可以是天然序列Fc 区或变异Fc区。尽管免疫球蛋白重链Fc区的分界线可以发生变化，但是人IgG重链Fc区 通常定义为从Cys226位或Pro230位的氨基酸残基延伸到其羧基末端。人IgG Fc区的“CH2域”(也称为“Cy2”域)通常是从大约氨基酸231延伸到大 约氨基酸340。CH2域是独特的，因为其不与另一域紧密配对。相反，两个N-连接的分支糖 链插在完整的天然IgG分子的两个CH2域之间。据推测，糖可以提供域_域配对的替代，并 有助于稳定CH2域(Burton，Mol Immunol，22，161-206 (1985)，其通过引用方式结合在本文 中)。"CH3域”包括Fc区中C末端残基到CH2域的一段(即从IgG的大约氨基酸残基 341到大约氨基酸残基447)。术语“铰链区”通常定义为人IgGl的Glu216延伸到Pro230 (Burton (1985))。其 他IgG同种型的铰链区可以通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基放 在相同位置而与IgGl序列比对。术语“结合域”是指多肽结合另一分子的区域。对于FcR，结合域可以包括其多肽 链(例如，其a链)负责结合Fc区的一部分。结合域的一个例子是FcR链的细胞外域。“功能性Fc区”具有至少天然序列Fc区的部分“效应子功能”。示例性的“效应子 功能”包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。这些效应子功能通常 需要Fc区与结合域(例如抗体可变域)结合，并且可以使用例如本文公开的各种不同分析 方法进行评估。该术语还包括Fc片段，只要该片段包含如本文所述的糖基化的或适合糖基 化的至少一个氨基酸残基。“天然序列Fc区”包含与天然发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。如本 领域普通技术人员所理解的，“变异Fc区”由于至少一个“氨基酸的饰”而包含与天然序列 Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。优选地，变异Fc区与天然序列Fc区或母本多肽的 Fc区相比具有至少一个氨基酸取代，例如天然序列Fc区中或母本多肽的Fc区中的大约1 个_大约10个氨基酸取代，优选大约1个-大约5个氨基酸取代。本文的变异Fc区优选 与天然序列Fc区和/或母本多肽的Fc区具有至少大约80%的同源性，更优选与其具有至 少大约90%的同源性，更优选与其具有至少大约95%的同源性，再更优选与其具有至少大 约99%的同源性。术语“改变的糖基化”是指在如上定义的多肽(天然的或修饰的)中，对糖添加到 重链恒定区上进行操控以增加或减少特定的糖组分。例如，在特定细胞系(例如，举例来 说，Lec2或Lec3)中制备的多肽(例如，举例来说，抗体)可能缺少糖部分(例如岩藻糖和 唾液酸)的连接。术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。在本发明的一个实施方 式中，FcR是天然序列人FcR。在另一实施方式中，FcR(包括人FcR)结合IgG抗体(Y受 体)，并包括Fc y RI、Fc y RII和Fc y RIII亚类的受体(包括这些受体的等位基因变异体 或可选择地剪接形式)。FcyRII受体包括FCYRIIA( “激活受体”)和FCYRIIB( “抑制 受体”)，其具有相似的氨基酸序列，主要不同是其胞质域。激活受体Fc y RIIA在其胞质域 中包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。抑制受体FcyRIIB在其胞质域中包含免疫受体 酪氨酸抑制基序(ITIM)(参见综述Daron，Annu Rev Immunol，15，203-234 (1997) ；FcR 的综 述 Ravetch 禾口 Kinet, AnnuRev Immunol, 9,457-92 (1991) ；Capel 等人，Immunomethods, 4, 25-34(1994)；和 de Haas等人，J Lab Clin Med，126，330-41 (1995)，Nimmerjahn和Ravetch 2006, Ravetch Fc Receptors in Fundemental Immunology, edffilliam Paul 5th Ed.，所 有文献均通过引用方式结合在本文中)。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指其中表达FcR的细胞毒性细胞 (例如单核细胞，如自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞)识别在目标细胞上的结合抗体，继而引 起目标细胞裂解的体外或体内的细胞介导的反应。一般而言，具有激活Fc y R的任何效应 细胞可被引发以介导ADCC。一种这样的细胞(NK细胞)仅表达FcyRIII，而单核细胞(取 决于其激活状态、定位或分化)可以表达？0￥1 1、？(3￥1 11和？(3￥1 111。造血细胞上的FcR 表达总结在Ravetch和Bolland，Annu Rev Immunol, (2001)中，其通过引用方式结合在本 文中。“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。优选地，该细 胞表达至少一种类型的激活Fc受体(例如，举例来说，Fc yRIII)并且执行ADCC效应功能。 介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞和 嗜中性白细胞，PBMC和NK细胞是优选的。效应细胞可从其天然来源分离，例如如本文所述 从血液或PBMC分离。
术语“抗体”以广义含义使用，且特别地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、 多克隆抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们珠表现出希望的生物 学活性。短语抗体的“唾液酸含量”是指抗体重链的Fc区上唾液酸残基的总数和指未纯化 抗体制剂中唾液酸化的抗体与未唾液酸化的抗体的比，除非该短语在上下文中清楚地表明 是指另一含义。如本发明的目的所限定的，“抗体片段”包括完整抗体的一部分，通常包括完整抗 体的抗原结合区或可变区，或保留FcR结合能力的抗体Fc区。抗体片段的例子包括线性抗 体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段优选保留至少铰链的部分 和任选地IgG重链的CH1区。更优选地，抗体片段保留IgG重链的整个恒定区，并包括IgG 轻链。如本文使用的术语“单克隆抗体”是指从基本同源抗体的群体获得的抗体，即构成 该群体的单个抗体除了可能少量存在的可天然发生的突变以外是相同的。单克隆抗体是 高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与常规(多克隆)抗体制剂(通常包括针对不同 决定簇(表位)的不同抗体)相反，各单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单 克隆”表明从基本同源的抗体群体获得的抗体的特征，并不理解为需要通过任何特定的方 法来产生该抗体。例如，本发明使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法进行制备(该方法 首先在Kohler和Milstein，Nature，256，495-497 (1975)中描述，其通过引用方式结合在 本文中)，或者可以通过重组DNA方法进行制备(参见例如美国专利No. 4，816，567，其通过 引用方式结合在本文中)。单克隆抗体还可以通过使用例如Clackson等人，Nature, 352, 624-628(1991)和 Marks 等人，J Mol Biol，222，581-597 (1991)中描述的技术从噬菌体抗 体文库中分离，各文献通过引用方式结合在本文中。在本发明的其它实施方式中，包含至少一个IgG Fc区的多肽可与其他蛋白质片 段(包括但不限于全蛋白质)融合。本领域普通技术人员清楚地知道，许多蛋白质可以 与本发明的多肽融合，包括但不限于其他免疫球蛋白，特别是缺少其相应Fc区的免疫球 蛋白。或者，其他生物活性蛋白质或其片段也可以与本发明的多肽融合，例如美国专利 No. 6, 660, 843中所描述的，该文献通过引用方式结合在本文中。该实施方式对于将这些生 物活性蛋白质或其片段输送到表达Fc受体的细胞是特别有利的。此外，可以使用不同的标 志物，例如，举例来说，GST标签或者绿色荧光蛋白质或GFP。本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链 的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源， 而该链中的剩余部分与源自另一物种或属于另一抗体类型或亚类的抗体及这些抗体的 片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出希望的生物学活性即可(参见美国专利 No. 4,816，567 ；Morrison等人，Proc Natl Acad Sci USA，81，6851-6855 (1984) ；Neuberger 等人，Nature，312，604-608 (1984) ；Takeda 等人，Nature，314，452-454 (1985)；国际专利申 请No. PCT/GB85/00392，其各通过引用方式结合在本文中)。非人(例如鼠科动物)抗体的“人源化”形式是包含源自非人类免疫球蛋白的最 少序列的嵌合抗体。对于绝大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来 自受体的超变区的残基被来自非人物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)的具有希望的特异性、亲和力和能力的超变区的残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋 白的Fv框架区(FR)被相应的非人类残基取代。此外，人源化抗体可以包含未在受体抗体 或供体抗体中出现的残基。进行这些修饰来进一步优化抗体的性能。通常，人源化抗体包 括至少一个且通常两个可变域的基本所有，其中所有或基本所有的超变环对应于非人类免 疫球蛋白的那些超变环，并且所有或基本所有的FR残基是人免疫球蛋白序列的那些残基。 任选地，人源化抗体还包含至少免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的 恒定区(Fc)。进一步细节可以参见 Jones 等人，Nature，321，522-525 (1986) ；Riechmann 等 人，Nature，332，323-329 (1988) ；Presta,Curr Op Struct Biol，2，593-596 (1992)；美国专 利No. 5，225，539，其各通过引用方式结合在本文中。本发明的多肽可以重组产生，例如从cDNA(例如，举例来说，SEQID NO 1)重组产 生。不同实施方式的多肽包括Fc区或其功能性片段。包含至少一个IgG Fc区的多肽包括其中通过使用重组DNA技术改变编码重链恒 定区的基因而将特定的氨基酸取代、插入或缺失引入到母本序列中的那些多肽。按照如 手册(如 Molecular Cloning(Sambrook andRussel, (2001)))中描述的公知的分子生物 学技术引入这些修饰。此外，具有至少一个Fc区的多肽包括已经过选择以包含特定的糖 修饰的那些多肽，其或者通过在已知其糖基化特异性的细胞系中进行表达获得(Stanley P.等 A, Glycobiology,6,695-9 (1996) ；ffeikert S.等人，NatureBiotechnology，17， 1116-1121(1999) ；Andresen DC 禾口 Krummen L. , Current Opinion in Biotechnology, 13, 117-123(2002))，或者通过使用特定凝集素的富集或贫化或通过酶处理获得(Hirabayashi 等人，JChromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，771，67—87 (2002) ；Robertson禾口 Kennedy, Bioseparation,6,1-15(1996))。本领域已知抗体糖基化的质量和程度随所使用 的细胞类型和培养条件而不同。例如，Patel等人，Biochem J，285，839-845 (1992)已经报 道了如果抗体作为腹水或者在不含血清或含血清的培养基中产生，抗体连接的糖侧链中唾 液酸的含量显著不同。此外，Kunkel等人，Biotechnol Prog, 16,462-470 (2000)已经证明 用于细胞生长的不同生物反应器和培养基中溶解氧的量影响抗体连接的糖部分中半乳糖 和唾液酸的量。但是这些研究并没有解释唾液酸残基的不同水平是怎样影响抗体的体内活 性的。宿主表达系统本发明的多肽可以在能够进行N连接糖基化的宿主表达系统(即宿主细胞)中 表达。通常，这类宿主表达系统可以包括细菌、真菌、植物、脊椎动物或无脊椎动物表达系 统。在一个实施方式中，宿主细胞是哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CH0)细胞系(例 如 CH0-K1 ；ATCCCCL-61)、绿猴细胞系(COS)(例如 COS 1 (ATCC CRL-1650)、COS 7 (ATCC CRL-1651))、小鼠细胞(例如NS/0)、幼仓鼠肾(BHK)细胞系(例如，ATCC CRL-1632或 ATCC CCL-10)或人细胞(例如 HEK293(ATCC CRL-1573)或 293T(ATCC CRL-11268))或任何 其他合适的细胞系，例如可以从公开保藏机构(如American Type Culture Collection, Rockville,Md)获得的。此外，可以使用昆虫细胞系(如磷翅类(L印idoptora)细胞系，例 如Sf9)、植物细胞系、真菌细胞系(如酵母，如举例来说，酿酒酵母、毕赤酵母、汉逊酵母属) 或基于杆菌(如枯草杆菌或大肠杆菌)的细菌表达系统。本领域普通技术人员知道，在一 些情况下可能需要对宿主细胞进行修饰以确保发生N连接糖基化和聚糖成熟而产生通常
11在人IgG的Fc域上发现的复合双触角的糖。治疗制剂可以通过混合具有理想纯度的本发明的多肽和任选的生理学可接受的载体、赋形 剂或稳定剂(参见如 Remington' s Pharmaceutical Sciencesl6th edition, Osol, A. Ed. (1980))来制备冻干制剂或水溶液形式的包含含有至少一个IgG Fc区的多肽的治疗制剂 用于储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，且 包括缓冲剂(如磷酸、柠檬酸和其他有机酸)、抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)、防腐 剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵(hexamethonium chloride)；苯扎氯铵、 氯化苄乙氧铵；苯基醇、丁醇或苄醇；烷基对羟苯甲酸酯如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸 丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间-甲酚)、低分子量(少于大约10个残基) 多肽、蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯酮)、氨 基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸)、单糖、二糖或其他糖类包 括葡萄糖、甘露糖或糊精)、螯合剂(例如EDTA)、糖(例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇)、 成盐反离子(如钠)、金属螯合物(如Zn-蛋白质螯合物)和/或非离子表面活性剂(如 TWEEN , PLUR0NICS 或聚乙二醇(PEG))。本文的制剂还可以根据待治疗的特定适应症的需要包含多于一种的活性化合物， 优选具有不会对彼此产生不利影响的互补活性的那些活性化合物。这类分子适当地以对预 期目的有效的量组合存在。活性成分还可以封闭在例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊 (例如羟基甲基纤维素或明胶微胶囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，在胶质药物递 送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在乳剂中。这类技 术公幵在 Remington' sPharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A. Ed. (1980)中。在优选的实施方式中，用于体内施用的制剂是无菌的。本发明的制剂可以方便地 灭菌，例如通过无菌过滤膜的过滤。还可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适的例子包括包含修饰的抗体的固体疏水性 聚合物的半透性基质，该基质是以成形颗粒的形式，如薄膜或微胶囊。缓释基质的例子包括 聚酯、水凝胶(如，聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(参见例如 美国专利No. 3，773，919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸y乙基酯的共聚物、非降解的乙烯-醋酸 乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPR0N DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮 丙瑞林构成的注射微球)和聚-D-(-)_3-羟丁酸。尽管聚合物(例如乙烯-醋酸乙烯酯和 乳酸-乙醇酸)使得分子的释放超过100天，但是某些水凝胶在较短的时间内释放蛋白质。 当包封的抗体在体内长时间保留时，它们可能由于在37°C暴露在潮湿中而变性或聚积，从 而造成生理活性的丧失或可能的免疫原性改变。取决于涉及的机理，可以设计合理的策略 进行稳定。例如，如果发现聚积机理是通过硫醇_ 二硫化物互变形成分子间S-S键，则可以 通过修饰巯基、从酸性溶液冻干、控制水分含量、使用合适的添加剂和开发特定的聚合物基 质组成来获得稳定。包含至少一个IgG Fc区的唾液酸化多肽的产生本发明的多肽可以进一步纯化或修饰，从而它们与未修饰的和/或未纯化的抗体 相比具有增加量的唾液酸。已有多种方法可以实现该目的。在一种方法中，未纯化多肽(例如，举例来说，IVIG)的源通过包含已知结合唾液酸的凝集素的柱子。本领域普通技术人员 知道，不同的凝集素相对于半乳糖和唾液酸之间的a-2，3键对a_2，6键显示出不同的亲 和力。因此，选择特定的凝集素使得能够富集在唾液酸与半乳糖之间具有希望的键类型的 抗体。在一个实施方式中，从西洋接骨木(Sambuccusnigra)分离凝集素。本领域普通技术 人员知道，西洋接骨木凝集素(SNA)对通过a (2-6)键连接到半乳糖或N_乙酰半乳糖胺 上的唾液酸是特异性的(Shibuya等，J. Biol. Chem.，262 1596-1601 (1987))。相反，山槐 (Maakiaamurensis) ( “MAA”)凝集素结合通过a (2-3)键连接到半乳糖上的唾液酸(Wang 等，J Biol Chem.，263 :4576_4585 (1988))。因此，具有希望的半乳糖和唾液酸之间的键的包含至少一个IgG Fc区的多肽的部 分将会保留在柱子中，而缺乏这种键的部分将会通过柱子。包含至少一个IgG Fc区的多肽 的唾液酸化的部分可以通过具有不同严格性条件的另一冲洗步骤洗脱出来。因此，有可能 获得本发明的多肽的制剂，其中唾液酸的含量与正常含量相比升高。此外，可以利用唾液酸 转移酶和例如在美国专利No. 20060030521中描述的唾液酸供体的酶反应。用于本发明的方法中的唾液酸转移酶的合适的非限制性例子是ST3Gal III (其也 称为a-(2,3)唾液酸转移酶(EC 2. 4. 99. 6))和a-(2,6)唾液酸转移酶(EC 2. 4. 99. 1)。a-(2,3)唾液酸转移酶催化唾液酸转移到Gal-0 ，3GlcNAc或Gal-3 ， 4GlcNAc 糖苷的 Gal 上(参见如 Wen 等人，J. Biol. Chem. 267 :21011 (1992) ；Van den Eijnden等人，J. Biol. Chem. 256 3159 (1991))，并负责糖肽中天冬酰胺连接的寡糖的唾液 酸化。唾液酸通过形成两个糖之间的a-键连接到Gal上。糖之间的键(连接)是在NeuAc 的2-位和Gal的3-位之间。可以从大鼠肝脏分离该特定的酶(Weinstein等人，J. Biol. Chem. 257 13845 (1982))；人 cDNA(Sasaki 等人(1993)J. Biol. Chem. 268 :22782_22787 ； Kitagawa & Paulson(1994)J. Biol. Chem. 269 1394-1401)和基因组(Kitagawa 等人 (1996) J. Biol. Chem. 271 :931_938)DNA序列是已知的，从而有助于通过重组表达产生该 酶。a-(2,6)唾液酸转移酶的活性产生6_唾液酸化的寡糖，包括6_唾液酸化的半乳 糖。名称“a_(2，6)唾液酸转移酶”是指将唾液酸连接到受体多糖的第六个原子上的唾液 酸转移酶家族。可以从不同组织分离得到a-(2，6)唾液酸转移酶的不同形式。例如该酶 的一种特定形式ST6Gal II可以从大脑或胎儿组织中分离出来(Krzewinski-Recchi等人， Eur. J. Biochem. 270,950 (2003))。此外，本领域普通技术人员知道，可以控制细胞培养条件来改变唾液酸化速率。例 如，为了增加唾液酸含量，降低生产率并将克分子渗透压浓度一般地维持在适于特定宿主 细胞培养的下限。大约250m0sm-大约450m0sm的克分子渗透压浓度适于更高的唾液酸含 量。这一细胞培养条件和其他合适的细胞培养条件描述在例如美国专利No. 6，656，466中。 Patel等人，Biochem J，285，839-845 (1992)已经报道了，如果抗体作为腹水或者在不含血 清或含血清的培养基中产生，抗体连接的糖侧链中唾液酸的含量显著不同。此外，Kimkel等 人，Biotechnol. Prog.，16，462-470 (2000)已经表明，使用不同的生物反应器进行细胞生长 和培养基中溶解氧的量影响抗体连接的糖部分中半乳糖和唾液酸的量。在另一实施方式中，宿主细胞(例如，举例来说，永生化人胚胎视网膜细胞)可以 通过引入可操作地与启动子(例如，举例来说，CMV启动子)连接的编码唾液酸转移酶(例如，举例来说，a-2，3-唾液酸转移酶或a-2，6唾液酸转移酶)的核酸进行修饰。a-2， 3-唾液酸转移酶可以是人a -2，3-唾液酸转移酶，称为SIAT4C或STZ(GenBank登录号 L23767)且在如美国专利No. 20050181359中描述。编码唾液酸转移酶的核酸可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法引入宿 主细胞。引入外源核酸序列的合适的方法还在Sambrook和Russel，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (3rd Edition), ColdSpring Harbor Press，NY，2000 中有所描述。这些 方法包括但不限于物理转移技术(例如，举例来说，显微注射或电穿孔)、转染(例如，举例 来说，磷酸钙转染)、使用例如脂质体的膜融合转移和病毒转移(例如，举例来说，使用DNA 或逆转录病毒载体的转移)。包含至少一个IgG Fc区的多肽可以从培养上清液中回收，且如果需要的话，可以 进行一个或多个纯化步骤，例如，举例来说，离子交换或亲和色谱。合适的纯化方法是本领 域普通技术人员很清楚的。本领域普通技术人员可以理解，上述的唾液酸化方法的不同组合可以导致产生具 有非常高唾液酸化水平的包含至少一个IgG Fc区的多肽。例如，可以如上所述在过表达唾 液酸转移酶的宿主细胞中表达包含至少一个IgG Fc区的多肽，然后通过例如在酶反应中唾 液酸化这些多肽、再使用含凝集素的柱子进行亲和色谱而进一步富集这些多肽的唾液酸化 的部分。类似地，酶反应之后进行亲和色谱可以用于包含至少一个IgGFc区的多肽的IVIG 源。为了检验在包含至少一个IgG Fc区的多肽上糖基化的程度，可以纯化这些多肽并 在还原条件下在SDS-PAGE中进行分析。可以通过将分离的多肽与特定的凝集素反应来确 定糖基化，或者可选地，如本领域普通技术人员所知道的，可以使用HPLC然后再使用质谱 鉴别糖形(Wormald，MR 等人，Biochem 36:1370(1997))。为了更加详细地描述本发明，下面给出几个非限制性的说明性实施例。
实施例实施例1.唾液酸含量增加的IVIG显示细胞毒性降低为了确定IgG的特定糖形是否参与调节抗体的效应子功能，对特定的Asn297-连接 的糖在介导确定的IgG单克隆抗体的细胞毒性中的作用进行了研究。使用质谱来分析如原 先所描述的(6)在293细胞中表达为IgGl、2a或2b开关变异体(switch variant)的源 自6A6杂交瘤的抗血小板抗体，从而确定它们特定的糖组成和结构。这些抗体包含最少的 唾液酸残基。通过西洋接骨木凝集素亲和色谱富集含唾液酸的种类产生唾液酸含量富集了 60-80倍的抗体。比较唾液酸化的和非唾液酸化的6A6-IgGl和2b抗体介导血小板清除的能 力表明，唾液酸化和体内活性反相关。6A6IgG抗体的唾液酸化使其生物活性降低40-80%。为了确定该活性下降的机理，就各小鼠FcYR对这些抗体和其同源抗原进行表面 等离子体共振结合。如Nimmerjahn 和 Ravetch，Science 310,1510(2005)中所描述的进行表面等离 子体共振分析。简而言之，在其糖侧链中包含高和低水平唾液酸残基的6A6抗体变异体被 固定在CM5传感器芯片的表面上。在室温下于HBS-EP运行缓冲液(10mM Hepes, pH 7.4， 150mM NaCl，3. 4mMEDTA和0. 005%表面活性剂P20)中通过流动池注入不同浓度的可溶性Fey受体，流速为30ul/分钟。可溶性Fc受体注入3分钟，且到结合分子的解离观察7分 钟。自动减去对照流动池的背景结合。进行对照试验以排除质量传输限制。通过对结合和 解离相的同时拟合以及对数据组中所有的曲线的全拟合(global fitting)从传感图数据 (sensorgram data)中获得亲和常数。1 1朗缪尔结合模型很好地拟合观察到的传感图 数据并用于所有试验中。与它们的非唾液酸化形式相比，这些抗体的唾液酸化形式对它们各自的激活FcyR 的结合亲和力观察到降低了 5-10倍，而没有观察到对抗原的结合亲和力的变化。由于 IgG2b以较高亲和力与其激活受体FcyRIV结合，当与IgGl结合其激活受体FcyRIII相比 时，唾液酸化的作用是使IgG2b与其激活受体FcyRIV的结合亲和力与未唾液酸化的IgGl 与其激活受体FcYRlII的结合亲和力相当。这一激活受体结合中的量差异的这种作用使得 唾液酸化的IgG2b显示出与未唾液酸化的IgGl相当的体内活性。同样，IgGl的唾液酸化 降低了其对于激活受体FcyRlll的原已很低的结合亲和力7倍，因而产生了生理学失活的 抗体。因此，IgG的Asn297连接聚糖结构的唾液酸化降低了对亚类限制性激活FcyR的结合 亲和力，并因此降低了它们的体内细胞毒性。为了确定IgG的N连接聚糖的唾液酸化参与调节其体内炎性活性现象的普遍性， 我们下一步研究了 N连接聚糖对IVIG的抗炎活性的作用。当以高剂量(l_2g/kg)静脉内 施用时，从5-10，000个供体的混合血清中获得该纯化的IgG部分广泛使用的治疗炎性疾 病的治疗剂(Dwyer, N. Engl. J. Med. 326，107 (1992))。该抗炎活性是Fc片段的性质，且在 ITP、RA和肾毒性肾炎中是保护性的(Imbach等人，Lancet 1,1228(1981), Samuels son等 人，Science 291,484(2001), Bruhns 等人，Immunityl8，573 (2003)，Kaneko 等人，J. Exp. Med. 203(3) 789-97 (2006)) 现提出该抗炎活性的共同机理包括在效应巨噬细胞上诱导抑制性FcyRIIB分子 的表面表达，因此提高了细胞毒性IgG抗体或免疫复合物通过引发激活FcyR来诱导效应细 胞反应所需的阈值(Nimmerjahn 和 Ravetch，Immunity24,19(2006))。实施例2. IVIG的唾液酸化降低了小鼠关节炎模型中IVIG的抗炎作用小鼠C57BL/6 禾口 NOD 小鼠是从 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)购得的。 FcyRIIB+小鼠在本发明人的实验室中产生，并与C57BL/6背景本底12代。C57BTO背景(K/ B)的 KRN TCR转基因小鼠是由 D. Mathis 和 C. Benoist(Harvard Medical School,Boston, MA)赠送，并与NOD小鼠配种以产生K/BxN小鼠。6_10周大的雌性小鼠用于所有的试验，并 在洛克菲勒大学动物中心饲养。血清如原先所描述的(Bruhns等人，Immunity 18,573(2003))制备。简单地说，血 清从由K/BxN小鼠(6-12周大)收集的血液中分离出来。将几周收集的血清合并在一起， 等分冷冻以用于本文描述的所有试验中。1.5X稀释的K/BxN血清的一次静脉注射(每克小 鼠4 yl合并的K/BxN血清)诱导关节炎。通过临床检验对关节炎进行评分。将所有四只 爪子的指数相加0[未影响的]、1 [一个关节肿胀]、2[多于一个关节肿胀]和3[整个爪 子严重肿胀]。在K/BxN血清注射之前一小时注射IVIG。一些小鼠接受缺乏6A6-IgG2b抗 体的5 ii g血小板，并使用Advia 120血液学系统(Bayer)在处理后0、4和24小时确定血 小板计数。所有的试验符合联邦法律和学院指导方针的，并且由洛克菲勒大学(纽约，NY) 批准。
抗体和可溶性Fc受体6A6抗体开关变异体是通过瞬时转染293T细胞然后再如所描述的用蛋白质G进 行纯化产生的(Nimmerjahn和Ravetch，Science 310,1510 (2005)) 唾液酸富集的抗体变 异体是通过使用西洋接骨木凝集素(SNA)琼脂糖(Vector Laboratories,Burlingame,CA) 的凝集素亲和色谱从这些抗体制剂中分离出来的。唾液酸含量的富集是通过凝集素印迹 确认的(见下文)。人静脉内免疫球蛋白(IVIG，5%于10%麦芽糖中，色谱纯化的)是从 Octapharma(Hemdon,VA)购得的。按照所描述的进行人IVIG的消化(Kaneko Y.等人，Exp. Med. 203(3) :789_97 (2006))。简而言之，IVIG在37°C用0. 5mg/ml的木瓜蛋白酶消化1小 时，并通过添加2. 5mg/ml碘代乙酰胺(iodoasetamide)终止消化。在HiPr印26/60S-200HR 柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上将生成Fab和Fc的片段与非消化的IVIG分离，然后 再用蛋白质G柱(GE Healthcare)和蛋白质L柱(Pierce，Rockford，IL)纯化Fc和Fab片 段。片段纯度是通过使用抗人IgG Fab或Fc特异性的抗体(Jackson ImmunoResearch，West Grove, PA)的免疫印迹检测的。纯度经判断大于99%。F4/80抗体来自Serotec (Oxford， UK)。Ly 17. 2抗体来自Caltag(Burlingame,CA)。绵羊抗肾小球基底膜(GBM)抗血清(肾 毒性血清，NTS)是由M.P.Madai0 (宾夕法尼亚大学，费城，PA)赠送。包含C末端六组氨酸 标签的可溶性Fc受体是通过293T细胞的瞬时转染产生的，并如厂商(Qiagen)所建议的用 Ni-NTA琼脂糖从细胞培养上清液中纯化。IVIG用神经氨酸苷酶处理，并通过质谱分析产生的制剂的组成和结构。在神经氨 酸苷酶处理之后，没有残留可检测的含唾液酸的聚糖。然后测试这些IgG制剂防止通过KxN 血清的被动转移诱导的小鼠关节炎症(IgGl免疫复合物介导的炎性疾病模型)的能力。神 经氨酸苷酶的去唾液酸化在KXN血清诱导关节炎模型中消除了 IVIG制剂的保护效应。该 活性的丧失并不是非唾液酸化IgG制剂的血清半衰期降低的结果，也不是IgG的单体组成 或结构完整性改变的结果。使用PNGase去除所有聚糖具有相似的效果并消除IVIG的体内 保护效应。实施例3.具有增强的唾液酸含量的IVIG部分减轻了小鼠关节炎模型中的炎症具有增加的唾液酸含量的IVIG的制备由于唾液酸看起来是IVIG的抗炎活性所需要的，因此对于该抗炎活性的高剂量 需求(lg/kg)的基础可能是总IVIG制剂中唾液酸化IgG的限制浓度。IVIG在SNA-凝集素 亲和柱上分级以获得唾液酸修饰的聚糖结构富集的IgG分子。测试这些唾液酸富集的部分与未分级的IVIG相比在KxN血清转移关节炎模型中 的保护效果。对于SNA结合部分观察到保护增强10倍，因而与lg/kg未分级的IVIG相比， 0. lg/kg的SNA富集的IVIG可获得相当的保护。SNA富集部分的血清半衰期和IgG亚类分 布与未分级的IVIG相当。唾液酸化的效应对IgG是特异性的；唾液酸化的N连接糖蛋白 (如具有类似的双触角复合糖结构的胎球蛋白或铁传递蛋白)在IgG的等摩尔浓度下不具 有统计学显著的抗炎活性。最后，唾液酸化的IVIG制剂的保护作用机理与未分级的IVIG 相似，其取决于FcyRIIB表达，并导致效应巨噬细胞上该抑制受体的表达增加。实施例4.具有增加的唾液酸含量的IVIG抗炎应答的增强是由Fc域上N连接聚 糖的唾液酸化介导的由于IVIG中的多克隆IgG还可以包含可被唾液酸化的轻链或重链可变域上的0和N连接聚糖，我们确认SNA富集的IgG制剂的抗炎活性增加是由Fc上N连接糖基化位点 的唾液酸化增加产生的。Fc片段是从未分级的和SNA分级的IVIG产生的，并测试它们的 体内活性。如对完整的IgG所观察到的，当与由未分级的IVIG产生的Fc片段比较时，SNA 纯化的Fc片段的体内保护作用提高。相反，Fab片段在该体内测定中未显示抗炎活性。因 此，IVIG抗炎活性的高剂量要求可以归因于总制剂中存在的唾液酸化IgG的较小贡献。因 此通过唾液酸结合凝集素色谱富集这些部分提高了抗炎活性。使用IgG抗体的被动免疫的这些结果表明，IgG从促炎物质转换为抗炎物质的能 力受Fc域上N连接聚糖的唾液酸化程度的影响。实施例5.由IgG唾液酸化介导的抗炎活性的增加在主动免疫反应中出现古德帕斯丘病(Goodpasture，s Disease)的鼠模型在该模型中，小鼠首先用绵羊IgG和助剂一起致敏，四天后注射绵羊抗小鼠肾小 球基底膜制剂(肾毒性血清，NTS)。简而言之，使用于CFA中的200i!g绵羊IgG(SeroteC) 经腹膜内对小鼠预免疫，然后在四天后再静脉注射每克体重2. 5iU NTS血清。抗GBM抗 血清注射之后四天，从非处理的对照小鼠中收集血液，并通过蛋白质G(GE Healthcare, Princeton, NJ)和琼脂糖结合的绵羊IgG柱(通过在NHS活化琼脂糖柱(GE Healthcare, Princeton, NJ)上共价偶联绵羊IgG产生)的亲和色谱纯化血清IgG。预致敏后用NTS进行处理以诱导小鼠IgG2b抗绵羊IgG抗体(NTN免疫的)(Kaneko Y.等人，Exp. Med.，203 =789(2006)) 小鼠IgG2b抗体与NTS抗体一起沉积在肾小球中，并 通过IgG2b介导的浸润巨噬细胞上FcyRIV的激活产生急性和暴发性炎性反应。没有预致 敏的情况下，没有观察到炎症，表明小鼠IgG2b抗绵羊IgG抗体是炎性反应的介质。为了确定是否产生促炎IgG的主动免疫与唾液酸化的改变相关，来自预免疫和 NTS免疫小鼠的血清IgG和IgM通过SNA凝集素结合对唾液酸含量进行表征。与未免疫对 照相比，免疫小鼠中总IgG唾液酸化平均降低40%。该效应对IgG是特异性的；IgM的唾液 酸化在免疫之前和之后相当。在分析来自小鼠血清的绵羊特异性IgG部分时，唾液酸化中 的这一差别更加明确，表明与预免疫的IgG相比唾液酸化降低50-60%。这些结果由MALDI-T0F-MS 分析得到确认。通过 CSDGlycotechnology Core Resource (San Diego, CA)进行单糖组成分析。糖蛋白样品用SDS和2_巯基乙醇变性，并 用PNGase F消化。释放的混合N-聚糖通过反相HPLC和固相萃取进行纯化，然后N-聚糖 的暴露的羟基被甲基化。得到的衍生化糖再次通过反相HPLC纯化，并进行MALDI-T0F-MS 分析。免疫前和免疫后IgG的分析确认了 N-聚糖结构的改变对末端唾液酸部分是特异 性的。在肾小球中沉积的小鼠IgG2b抗绵羊抗体之前表明负责携带FcyRIV的浸润巨噬细 胞的接入(engagement)，与预免疫的对照相比显示出降低的唾液酸含量。实施例6. IVIG中唾液酸和半乳糖之间的连接的分析进行SNA+(西洋接骨木凝结素)IVIG Fc连接的顺序Maldi-Tof分析来确定如上所 述在ITP、RA和肾毒性肾炎模型中保护性的唾液酸化的IgG Fc部分的结构。对Maldi-Tof 中产生的聚糖峰进行分离，进一步分级，并重新分析直到获得半乳糖_唾液酸结构。具有体 内抗炎活性的富集半乳糖_唾液酸的结构的足迹直方图(footprint histogram)(图1A) 与唾液酸键标准品a 2-3唾液乳糖(图1B)和a 2-6唾液乳糖(图1C)的直方图相比。标准品的特征峰由分别对应a 2_3(图1B)或a 2_6(图1A和1C)的箭头标明，且与从样品获 得的峰相比较。实施例7.通过体外糖基化富集a 2-6键的IVIG Fc片段提高了 IVIG的抗炎性能。如图2A所示，IVIG Fc片段的聚糖Maldi-Tof MS分析显示不以半乳糖作为末 端(峰GO)、以一个半乳糖作为末端(峰G1)、以两个半乳糖作为末端(峰G2)或以唾液 酸作为末端(由标明“末端唾液酸”的括弧表示)的结构。为了确定2，3或2，6唾液酸化 的IgG Fc的体内活性，样品用唾液酸酶进行处理，然后再用半乳糖转移酶将GO(没有半乳 糖)和G1(单个半乳糖)转化成G2(完全半乳糖基化)，以增加潜在的唾液酸化位点。如 图2B所示，超半乳糖基化是通过比较通过ECL测量的末端半乳糖的相对带强度比和考马斯 (Coomassie)上样对照进行确认。使用a 2-6唾液酸转移酶(“ST6Gal”)或a 2-3唾液酸 转移酶(“ST3Gal”)进行体外唾液酸化(图2C)，并使用SNA对a 2_6键(上部)或使用 ECL对a 2-3键(中间)和对考马斯(底部)的凝集素印迹分析来进行确认。为了评价体 外唾液酸化的Fc抑制炎症的能力(图2D)，小鼠接受0. 66mg的a 2-6唾液酸化Fc (黑三 角)或0. 66mg的a 2-3唾液酸化的Fc (红三角)。一小时之后，施用0. 2ml的K/BxN血清， 并在接下来的7天中观察足垫肿胀(临床评分)。观察到2，6唾液酸化的IgG Fc片段的抗 炎活性，但是没有观察到2，3唾液酸化分子的抗炎活性。这些结果与以上所示的数据一致， 并表明优先的2，6唾液酸-半乳糖键参与唾液酸化IgG的抗炎活性。实施例8.去除a 2-6而非2，3唾液酸键消除了 IVIG的免疫抑制性质使用连接特异性的唾液酸酶(SA)来处理IVIG，并通过凝集素印迹(图3A)确认消 化。上图显示出IVIG中a 2-6键(左道)和a2-3SAtx IVIG (中间道)的阳性西洋接骨木 凝集素(SNA)染色，但是在a2-3，6SA tx IVIG(右道)中并未显示出阳性染色。中间图是 a 2-3唾液酸键(MAL I)的点印迹，仅对于胎球蛋白阳性对照显示为阳性染色；每个点上样 100 Pg蛋白质。下图显示考马斯上样对照。在印迹和凝胶中显示10 yg/道。为了检验特 异性去除唾液酸部分的效应，小鼠在施用200iaK/BxN血清之前给予lg/kg的IVIG制剂。 如图3B所示，在一周的时间内在施用K/BxN的血清的小鼠(白圈)中观察到脚垫肿胀，如 临床评分所测量的。IVIG处理的小鼠显示出最小的肿胀(黑三角)，使用a2-3SA tx IVIG 处理的小鼠(白三角)也是这样，而接受a 2-3，6SA tx IVIG的小鼠(方形)没有受到对 脚垫肿胀的保护。实施例9.细胞毒性降低不依赖于唾液酸和半乳糖之间连接的性质本发明人之前已经证明，与IgG的Fc域结合的N连接聚糖的唾液酸化造成FcR结 合降低，导致A/I比例的降低(Kaneko等人，Science 313，670 (2006))，该比例是由IgG Fc 结合单个激活(A)或抑制(I)IgG Fc受体的亲和常数得到的值。已经表明，该比例是特定 IgG Fc 的体内细胞毒性的指征(F. Nimmerjahn, J. V. Ravetch, Science 310，1510(2005))。 因此，Fc唾液酸化降低了 IgG抗体在诱导的血小板减少症模型和体外ADCC模型中的细胞毒 性(Kaneko 等人，Science 313，670 (2006)，Scallon 等人，Mol. Immunol 44,1524(2007))。 因此，本发明人开始确定是否FcR结合和细胞毒性的这种降低受到唾液酸_半乳糖键的影 响。原先已经证明导致血小板消耗的单克隆抗血小板IgG2b抗体如上所述在体外进行唾液 酸化，并测试其体内活性。在血小板减少症的体内模型中(图4)，体外末端2，3和2，6唾 液酸化的IgG Fc都降低了该抗血小板抗体6A6-IgG2b的细胞毒性，这与之前的研究一致(Kaneko 等人，Science 313，670 (2006)，Scallon 等人，Mol. Immunol 44,1524(2007))。因 此，Fc唾液酸化对IgG抗体的细胞毒性的作用并不依赖于与倒数第二个半乳糖的连接的特 异性。相反，唾液酸化的IgG Fc片段的抗炎活性(本发明人已经证明依赖于标准IgG Fc 受体的性质(F. Nimmer jahn, J. V. Ravetch, Science 310，1510 (2005) ；F. Nimmer jahn, J. V. Ravetch,J Exp Med 204,11(2007)))对2，6唾液酸-半乳糖键显示出明显的优先性， 如图3B所示。这些结果进一步支持本发明人之前的观察，即IVIG的抗炎性质是通过不参与 与标准Fc y R结合的独特途径介导的，这与之前接受的模型截然相反(Park-Min等人， Immunity 26,67(2007) ；Siragam 等人，Nat Medl2，688 (2006))。实施例10. 2，6唾液酸化的IgG Fc的体内抗炎活性仅仅是IgG Fc聚糖的性质为了完全证明2，6唾液酸化的IgG Fc的体内抗炎活性仅仅是IgG Fc聚糖的性质 而不是由可能在异源的IVIG Fc制剂中发现的其他组分产生的，使用源自293T细胞中表达 的cDNA(SEQ ID NO. 1)的同源重组人IgGl Fc底物(rRc)来重演唾液酸化的IVIG Fc的抗 炎活性。纯化的重组人IgGl Fc片段是如上所述通过0 1，4半乳糖基化，然后再进行2，6唾 液酸化而体外工程化的聚糖(图5A)。该制剂进行纯化并在体内分析之前通过凝集素印迹 和MALDI-T0F分析进行表征(图5A)。通过凝集素印迹对具有ECL的末端半乳糖(上图)、 具有SNA的a 2，6唾液酸(中间图)确认糖基化，且考马斯上样对照显示于底图中。在K/BxN血清之前一小时向小鼠施用IVIG、SNA+IVIG Fc或唾液酸化的rFc (2，6ST rFc)，然后在接下来的几天内监测足垫肿胀。如图5B所示，2，6唾液酸化的重组人IgGl Fc 片段显示出与IVIG衍生的唾液酸富集Fc片段(SNA+IVIG Fc)或体外2，6唾液酸化的IVIG 衍生Fc片段(2，6ST IVIG Fc)相当的抗炎活性。每组4_5只小鼠的临床评分的平均值和 标准差进行作图，*表示通过Kruskal-Wallis Anova，再进行Dunn’ s post hoc确定的p < 0. 05。这些制剂中的各个制剂在30mg/kg时是有效的，这与天然IVIG所需的 1，000-2，000mg/kg 形成对比(表 1)。表1.在关节炎模型中导致相同程度的炎症抑制的含Fc片段的制剂的不同剂量。
本文中引用的所有专利和非专利出版物通过引用方式结合在本文中，就好像这些
专利和非专利出版物的每篇均通过引用方式全文结合在本文中。此外，尽管本发明根据具
体实施例和实施方式进行了描述，但是应该理解，这些实施例和实施方式仅仅是本发明的
原理和应用的说明。因此，可以理解的是，可以对举例说明的实施方式做出多种改变，且可
以在不偏离如下面的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下采用其他的配置。
权利要求
一种包含至少一个IgG Fc区的分离的多肽，所述多肽与未纯化的抗体制剂相比具有改变的性质，其中所述分离的多肽的唾液酸化比未纯化的抗体制剂的唾液酸化高。
2.如权利要求1所述的分离的多肽，其中所述至少一个IgFFc区被至少一个半乳糖部 分糖基化，该半乳糖部分通过α 2,6键连接到相应的末端唾液酸部分上，且其中所述多肽 与未纯化的抗体制剂相比具有较高的抗炎活性。
3.如权利要求1所述的分离的多肽，其中所述至少一个IgFFc区被至少一个半乳糖部 分糖基化，该半乳糖部分通过α 2,6键连接到相应的末端唾液酸部分上，且其中与未纯化 的抗体制剂相比，所述多肽与选自Fc y RIIA、Fc y RIIC和Fc Y RIIIA的Fc激活受体的结合 降低。
4.如权利要求1所述的分离的多肽，包含人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc区，所述多肽 与未纯化的抗体相比具有较高含量的所述通过α 2，6键连接到相应的末端唾液酸部分上 的至少一个半乳糖部分。
5.如权利要求1所述的分离的多肽，来自天然存在的抗体源或重组抗体源。
6.如权利要求1所述的分离的多肽，其中所述未修饰的抗体包含IVIG。
7.如权利要求1所述的分离的多肽，其从重组源产生且缺少Fab区，其中所述至少一个 IgG Fc区被两个半乳糖部分糖基化。
8.如权利要求1所述的分离的多肽，由包含SEQID NO 1的核酸序列编码。
9.如权利要求1所述的分离的多肽，源自具有在蛋白质的多糖链中至少一种半乳糖部 分和相应的末端唾液酸之间产生α 2，6键的增强的活性的细胞系。
10.如权利要求1所述的分离的多肽，通过用α2-6唾液酸转移酶处理进行修饰。
11.一种调节包含Fc区的多肽的性质的方法，包括改变Fc区的多糖链的唾液酸化。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述性质包括比未纯化的抗体更高的抗炎活性。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述改变唾液酸化的步骤包括提供包含至少一个Fc区的多肽的未纯化源，所述包含至少一个Fc区的多肽的未纯化 源包括个包含具有多糖链的至少一个Fc区的多个多肽，所述多糖链包含通过α 2，6键连 接到半乳糖部分上的末端唾液酸，和包含缺少多糖链的至少一个Fc区的多个多肽，所述多 糖链包含通过α 2，6键连接到半乳糖部分上的末端唾液酸；和提高所述包含具有多糖链的至少一个Fc区的多个多肽与所述包含缺少多糖链的至少 一个Fc区的多个多肽的比，所述多糖链包含通过α 2，6键连接到半乳糖部分上的末端唾液 酸。
14.如权利要求11所述的方法，其中通过在表达系统中表达包含核酸序列的载体来提 供所述包含至少一个Fc区的多肽的未纯化源，其中所述核酸序列被翻译成IgG抗体。
15.如权利要求11所述的方法，其中所述提高包含具有多糖链的至少一个Fc区的多个 多肽与包含缺少多糖链的至少一个Fc区的多个多肽的比的步骤是通过去除包含缺少多糖 链的至少一个Fc区的多肽实现的，所述多糖链包含通过α 2，6键连接到半乳糖部分上的末 端唾液酸。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述去除是通过选自HPLC、凝集素亲和色谱、高ρΗ 阴离子交换色谱及其任意组合的方法实现的。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述凝集素亲和色谱是使用对半乳糖部分和末端唾液酸之间的α2，6键的亲和力比对α _2，3键的亲和力低的凝集素进行的。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述提高包含具有多糖链的至少一个Fc区的多个 多肽与包含缺少多糖链的至少一个Fc区的多个多肽的比的步骤是通过富集包含具有多糖 链的至少一个Fc区的多肽的所述未纯化源实现的，所述多糖链包含通过α 2，6键连接到半 乳糖部分上的末端唾液酸。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述富集是通过选自HPLC、凝集素亲和色谱、高ρΗ 阴离子交换色谱及其任意组合的方法实现的。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述凝集素亲和色谱是使用对半乳糖部分和末端 唾液酸之间的α2，6键的亲和力比对α _2，3键的亲和力高的凝集素进行的。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述富集是通过使用酶进行化学反应实现的，所 述酶在连接到包含至少一个Fc区的多肽上的糖和末端唾液酸之间建立α 2，6键。
22.—种治疗炎性疾病的方法，所述炎性疾病选自关节炎、血小板减少症和肾炎，该方 法包括向患者施用治疗有效剂量的权利要求1所述的多肽。
23.一种治疗炎性疾病的方法，包括向需要治疗的受试者施用包含多个分离的多肽的 治疗组合物，所述多个分离的多肽各包含至少一个IgG Fc区，其中各个Fc区的第一部分包含具有通过2，6键连接到相应的末端唾液酸上的半乳糖部分 的相应糖链；所述治疗组合物的剂量小于包含多个分离的多肽的第二组合物的剂量，该多个分离的 多肽各包含至少一个IgG Fc区，具有包含相应糖链的相应Fc区的第二部分，所述糖链具有 通过2，6键连接到相应的末端唾液酸上的半乳糖部分；和或者第一部分比第二部分大，从而所述治疗组合物的剂量和所述第二组合物的剂量抑制炎 症的程度基本相同，或者第一部分比第二部分大，从而所述治疗组合物抑制炎症的程度比相同剂量的所述第二 组合物高。
24.一种包含含有Fc区的糖蛋白的组合物，其中所述组合物配制成包含足以在哺乳动 物中获得免疫抑制活性的量的唾液酸化糖蛋白。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述组合物包含的唾液酸化糖蛋白的量为约 5%或更多。
26.如权利要求24所述的组合物，其中所述组合物包含的唾液酸化糖蛋白的量为约 10%或更多。
27.如权利要求24所述的组合物，其中所述组合物包含的唾液酸化糖蛋白的量为约 30%或更多。
28.如权利要求24所述的组合物，其中所述组合物包含的唾液酸化糖蛋白的量为约 5% -约 30%。
29.如权利要求24所述的组合物，其中所述唾液酸化糖蛋白包含一个或多个末端唾液 酸残基或其类似物。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述末端唾液酸残基通过α2，6键连接到糖蛋白上。
31.一种IVIG衍生的组合物，配制成包含约5% -约30%量的唾液酸化的含Fc的糖蛋白，其中所述唾液酸化的糖蛋白包含通过α 2，6键连接到糖蛋白上的一个或多个末端唾液酸残基。
32.—种重组Fc糖蛋白或其片段，包含通过α 2，6键连接到糖蛋白上的至少一个末端 唾液酸残基或其类似物。
33.一种重组Fc糖蛋白，包含在Asn 297处的N连接的糖，其中所述糖具有双触角的 GlnNac2、Man3、GlcNAc2、Gal2结构，所述结构具有通过α 2，6键连接的一个或多个末端唾液酸残基。
34.包含前述权利要求中任一项所述的含Fc的糖蛋白，其中所述Fc区是IgG或其亚类。
35.一种包含权利要求24所述的糖蛋白的药物制剂。
36.一种通过使用权利要求35所述的药物制剂治疗受试者的炎性疾病的方法。
全文摘要
本发明提供了包含至少一个IgG Fc区的多肽，其中所述至少一个IgG Fc区被至少一个半乳糖部分糖基化，该半乳糖部分通过α2，6键连接到相应的末端唾液酸部分上，且其中所述多肽与未纯化的抗体相比具有较高的抗炎活性。
文档编号A61K39/395GK101896202SQ200880120908
公开日2010年11月24日 申请日期2008年12月12日 优先权日2007年12月14日
发明者F·尼默雅恩, J·拉韦施, 金子佳贤 申请人:洛克菲勒大学