一种牡蒿均一多糖及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种牡蒿均一多糖及其制备方法和应用，所述的牡蒿均一多糖是由牡蒿全草经水提醇沉后、柱层析分离纯化得到，是由果糖通过1,2连接的末端含葡萄糖基的菊糖型果聚糖，不含糖醛酸，且重均分子量为1～20kDa。实验结果表明：本发明提供的牡蒿均一多糖能明显降低胶原诱导关节炎小鼠的脚肿胀程度和小鼠血清中的炎症因子IL?6和IL?17A水平，可望作为主要或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗类风湿性关节炎的保健食品或药物制剂，对研究开发具有临床应用价值的牡蒿物制剂具有重要意义；另外，本发明制备方法简单，可以得到高纯度的牡蒿均一多糖，适于规模化生产，实用性好。
【专利说明】
一种牡蒿均一多糖及其制备方法和应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种牡蒿均一多糖及其制备方法和应用，属于天然药物技术领域。
【背景技术】
[0002]类风湿性关节炎(RA)是一种常见的自身免疫疾病，不及时治疗的话晚期致残率高达70%，据报道我国目前的类风湿关节炎患者人数已超过500万。临床常用于治疗RA的药物主要为西药，例如:甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶以及炎症因子单抗等，虽然见效快，但是副作用也较为明显。目前，从传统中药中寻找RA的治疗药物已经成为研究热点。
[0003]牡蒿为菊科蒿属植物牡蒿的干燥全草，其味苦、微甘，性凉，始载于《名医别录》，列为下品，谓牡蒿生田野，五月、八月采”，其主要功效为清热、凉血、解毒。现代药理研究表明:牡蒿提取物具有活血、止血、抗炎、抗病毒以及抗氧化作用。中医临床常用牡蒿治疗疟疾寒热、疥疮湿疹等。
[0004]作为常见的传统中药，目前已经有许多关于牡蒿用于某些炎性疾病治疗的研究报道，例如:专利CN201410229165.6中公开了一种治疗强直性脊柱炎的中药药剂及其制备方法，专利CN 2 O I 4 I O I 3 O I 3 3.0中公开了一种治疗慢性前列腺炎的药物，专利CN201310060244.4中公开了一种治疗急性痛风性关节炎的中药组合物，但是至今未见关于牡蒿用于类风湿性关节炎治疗的研究报道。并且上述报道中都是将牡蒿与其它多味中药配伍形成组合物来实施对炎性疾病的治疗，存在配伍成分复杂、毒副作用不清晰等缺陷，使用的牡蒿也都是牡蒿全草，并不清楚牡蒿中具体发挥药效的物质基础。
[0005]研究表明:牡蒿中含有丰富的多糖、黄酮、多酚、皂苷、挥发油、萜类等物质成分。目前关于牡蒿中的多糖成分的研究报道较少，主要集中在多糖的提取分离方法上，提取的多糖属于混合型多糖，很少有关于牡蒿多糖活性作用的研究报道。尤其是，至今还没有关于从牡蒿中提取均一多糖的研究报道，更没有牡蒿均一多糖用于类风湿性关节炎治疗的研究报道。
【发明内容】
[0006]针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种牡蒿均一多糖及其制备方法和应用，以拓宽牡蒿的应用范围。
[0007]本发明所述的牡蒿均一多糖，是由牡蒿全草经水提醇沉后、柱层析分离纯化得到，是由果糖通过I，2连接的末端含葡萄糖基的菊糖型果聚糖，不含糖醛酸。
[0008]所述牡蒿均一多糖的重均分子量经HPGPC测算为I?20kDa，优选为2?5kDa，以
3.1kD最佳。
[0009]本发明所述的牡蒿均一多糖的制备方法，包括如下具体步骤:
[0010]a)取干燥牡蒿全草，对其进行水提醇沉后冷冻干燥，制得牡蒿多糖粗品；
[0011]b)对步骤a)获得的牡蒿多糖粗品用水溶解后上样于碱性阴离子交换柱，使用水进行洗脱，得到牡蒿水洗脱部位多糖；
[0012]c)将步骤b)获得的牡蒿水洗脱部位多糖上样于葡聚糖凝胶色谱柱，使用NaCl溶液进行洗脱;根据出峰位置收集有效部位，用截留分子量为100Da的透析袋透析后冷冻干燥，即得所述牡蒿均一多糖。
[0013]作为优选方案，步骤a)中，先对干燥牡蒿全草用乙醇进行脱脂处理，残渣干燥后再进行水提醇沉。
[0014]作为进一步优选方案，所述步骤a)包括如下具体操作:
[0015]先对干燥牡蒿全草用乙醇回流脱脂，脱脂后的残渣经干燥后加入水进行加热提取2?5次，合并提取液，减压浓缩，离心，收集上清液，加入乙醇进行醇沉，对收集的沉淀进行真空冷冻干燥，即得牡蒿多糖粗品。
[0016]作为更进一步优选方案，脱脂所用乙醇的质量分数为50%?95%，脱脂时的料液比(g/mL)为1:5?1:20，回流脱脂I?20小时。
[0017]作为更进一步优选方案，脱脂后的干燥残渣与每次加入的水的料液比(g/mL)为1:8?1:30，加热提取的温度为60?100°C，每次提取的时间为I?5小时。
[0018]作为更进一步优选方案，醇沉时，向上清液中加入2?4倍体积的质量分数为90?100%的乙醇，边加边搅拌，至最终乙醇的质量分数为75?85%，静置12?36小时，收集沉淀物。
[0019]作为优选方案，所述步骤b)包括如下具体操作:
[0020]将制得的牡蒿多糖粗品用水溶解后上样于碱性阴离子交换柱，使用水进行洗脱，硫酸-苯酚法追踪洗脱曲线，收集含糖溶液，减压浓缩，浓缩物透析后冷冻干燥，得到牡蒿水洗脱部位多糖。
[0021 ]作为进一步优选方案，所述的碱性阴离子交换柱为DEAE-cellulose柱。
[0022]作为优选方案，所述步骤c)包括如下具体操作:
[0023]将制得的牡蒿水洗脱部位多糖用0.1?0.3mol/L的NaCl溶液溶解，离心，取上清液上样于葡聚糖凝胶色谱柱，用0.1?0.3mol/L的NaCl溶液进行洗脱，利用示差折光检测器进行检测，根据出峰位置收集有效部位;浓缩，用截留分子量为100Da的透析袋透析，冷冻干燥，即得所述的牡蒿均一多糖。
[0024]本发明所述的牡蒿均一多糖的应用，是指以所述的牡蒿均一多糖作为活性成分用于制备预防或/和治疗类风湿性关节炎的保健食品或药物制剂。
[0025]本发明所述的保健食品或药物制剂的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达体内的剂型都是可以的。比如可选自:片剂、胶囊剂、粉末、颗粒剂、糖浆、溶液、悬浮液、注射剂、酊剂、口服液、气雾剂、口含剂、冲剂、丸剂、散剂等常见剂型或纳米制剂等缓释剂型。
[0026]与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果:
[0027]本发明首次从牡蒿全草中分离纯化得到一种菊糖型均一多糖，由实验结果表明:本发明提供的牡蒿均一多糖能明显降低胶原诱导关节炎小鼠的脚肿胀程度和小鼠血清中的炎症因子IL-6和IL-17A水平，可望作为主要或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗类风湿性关节炎的保健食品或药物制剂，相对于现有技术，取得了显著性进步和出乎意料的效果;另外，本发明制备方法简单，可以得到高纯度的牡蒿均一多糖，适于规模化生产。
【附图说明】
[0028]图1是实施例1获取的牡蒿水部位多糖的葡聚糖凝胶色谱图；
[0029]图2是实施例1获取的牡蒿均一多糖的高效液相凝胶色谱图；
[0030]图3是实施例1获取的牡蒿均一多糖的红外图谱；
[0031]图4是实施例1获取的牡蒿均一多糖的碳谱图谱；
[0032]图5是实施例1获取的牡蒿均一多糖治疗胶原诱导小鼠关节炎的临床评分图；
[0033]图6是实施例1获取的牡蒿均一多糖治疗胶原诱导小鼠关节炎的脚肿胀厚度图；
[0034]图7是实施例1获取的牡蒿均一多糖治疗胶原诱导小鼠关节炎后的小鼠血清IL-17A浓度图；
[0035]图8是实施例1获取的牡蒿均一多糖治疗胶原诱导小鼠关节炎后的小鼠血清IL-6浓度图。
【具体实施方式】
[0036]下面结合附图和具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0037]实施例1:牡蒿均一多糖的制备和鉴定
[0038]K1牡蒿均一多糖的制备
[0039]a)取剪碎的干燥牡蒿全草2kg，加入20L质量分数为75%的乙醇回流脱脂(以除去低极性的成分)，回流脱脂10小时后，过滤，得不溶于乙醇的残渣，干燥残渣，然后加入沸水，回流提取两次，每次4h，第一次提取的料液比为1:12(8卩:lKg残渣，使用12L水)，第二次提取的料液比为1:10(8卩:IKg残渣，使用1L水)；过滤，合并两次提取液，浓缩，加入质量分数为95 %的乙醇，边加边搅拌，至最终乙醇的质量分数为75 %，静置醇沉24小时，过滤，收集沉淀并挥去残留乙醇;对沉淀进行离心，离心后加适量蒸馏水复溶，于-80 °(:冷冻干燥，制得牡蒿多糖粗品76.7g，得率约为全草质量的3.84% ;
[°04°] b)取制得的牡蒿多糖粗品10g，加150mL蒸馈水溶解，离心(lOOOOrpm，1min)，吸取上清液上样于DEAE-cellulose柱，使用蒸馏水进行洗脱，使用硫酸-苯酚法检测每管糖含量并于酶标仪上450nm处检测，绘制洗脱曲线，收集含糖溶液，减压浓缩，浓缩物用截留分子量为100Da的透析袋透析后冷冻干燥，制得牡蒿水洗脱部位多糖；
[0041 ] c)取制得的牡蒿水洗脱部位多糖120mg用0.2mol/L NaCl溶液溶解，离心，取上清液上样于葡聚糖凝胶色谱柱，用0.2mol/L NaCl溶液进行洗脱;利用示差折光检测器检测，同步软件记录样品出峰情况(见图1)，根据出峰位置收集有效部位;减压浓缩，浓缩物用截留分子量为100Da的透析袋透析后冷冻干燥，即得所述的牡蒿均一多糖(简称MWP)。
[0042]1.2对制备的牡蒿均一多糖的鉴定分析
[0043]1.2.1纯度和分子量测定
[0044]采用高效液相凝胶色谱(HPGPC)法:色谱柱为KS-804和KS-802串联;检测器为示差检测器;流动相为0.2mol/L的氯化钠水溶液;柱温:40°C ;流速:0.8mL/min;进样体积:20yL。
[0045]取分子量已知的DextranP-系列标准葡聚糖P-5、P-10、P-20、P-50、P-100、P_200、P-400和P-800各2mg，分别用流动相0.2mol/L的氯化钠水溶液配制成2mg/mL的溶液；以1000rpm离心1min;取上清液，每次进样20yL ；以分子量的对数值对保留时间做标准曲线。
[0046]取待测样品2mg，用流动相0.211101/]^的氯化钠水溶液配制成2mg/mL的溶液；以1000rpm离心1min;取上清液，进样20yL，进行高效液相凝胶色谱测试。
[0047]根据测定的样品保留时间，可从标准曲线中求得样品的平均分子量。
[0048]标准曲线的绘制处理及分子量计算由GPC软件自动完成。
[0049]图2为得到的牡蒿均一多糖(MWP)的高效液相凝胶色谱(HPGPC)图，图上的单一对称峰说明其为均一多糖。
[0050]GPC软件测得牡蒿均一多糖(MWP)的平均分子量为3.lkDa。
[0051]1.2.2结构鉴定
[0052]I)糖组成分析:
[0053]用还原水解法进行糖组成分析:取多糖样品Img用3ml2M TFA溶液溶于安瓿瓶中，封口，121°C水解2h，取出，减压蒸干，再加甲醇蒸干三次以完全出去TFA;水解后残余物加入30mg NaBH4和2mL水，室温还原反应过夜；加少量冰醋酸以除去过量的NaBH4，旋蒸至粘稠液体，加入甲醇-冰醋酸(体积比5:1)3?5mL，蒸干三次，再加甲醇蒸干两次，得到粉末，放入烘箱中于105 °C烘15min以除去水分，加入3mL乙酸酐，于烘箱中反应Ih，趁热加入ImL水终止反应，用2mL氯仿萃取乙酰化产物，水洗三次，氯仿层用无水硫酸钠干燥后用GC-MS分析(各单糖标准品执行乙酰化及以后步骤)。
[0054]色谱条件如下:
[0055]安捷伦7890B-5970A气质联用仪(Agilent)；
[0056]色谱柱:HP_5MSco Iumn (length, 60m X 0.25mm； thickness of liquid phase，0.25ym)；
[0057]程序升温:起始温度为120°C，3°C/min速度升温至190°C后，再以2°C/min的速度升至250°C并停留5min。
[0058]检测结果:所述牡蒿多糖的GC-MS结果显示出两个峰，经过与标准单糖(包括果糖)的比对以及文献查阅，推测其可能由果糖以及葡萄糖组成。
[0059]2)红外光谱分析:取样品Img于置有五氧化二磷的干燥器中真空干燥过夜，KBr压片，进行红外光谱分析。
[0060]结果:图3为得到的牡蒿均一多糖(MWP)的红外图谱，图中3371.97的宽峰为O-H伸缩振动峰，2926.70为C-H吸收峰，以上两个峰为多糖的特征峰；1642.13处的峰为O-H弯曲振动峰，1414.69为O-H面内弯曲振动峰，1033.48为C-O伸缩振动峰，591.41为O-H面外变形振动峰。
[0061]3)碳谱分析:取样品30mg置于放有五氧化二磷的干燥器中真空干燥过夜，加入400PLD2O溶解，室温下测其13C-NMR谱。
[0062]结果:图4为得到的牡蒿均一多糖MWP的碳谱图谱，图中，其异头碳区域104.93、104.48和 93.77ppm 分别对应 0-Fruf-(2—和—I )-Fruf-(2—的 C-2 以及 Glcp-( I —的 C-1 信号。—I)-Fruf-(2^中的C-1、C-2、C-3、C-4、C-5和C-6信号分别对应62.38、78.48、75.38、82.54和63.58ppm。
[0063]结合上述分析可知:本发明实施例1中制备的牡蒿多糖是一种由果糖通过I，2连接的末端含葡萄糖基的菊糖型果聚糖，是均一多糖，不含糖醛酸。
[0064]实施例2:关节炎小鼠的体内药效学实验
[0065]I)胶原诱导关节炎小鼠模型的建立:
[0066]动物:6?8周龄，雌性DBA/1小鼠12只，饲养于上海中医药大学实验动物中心。
[0067]试剂:牛二型胶原(cΠ )，完全弗氏佐剂(CFA)，不完全弗氏佐剂(IFA)购自美国Chondrex公司。
[0068]方法:第一次免疫于DBA/1小鼠尾基底部皮内注射含有10ygCII的CFA的乳浊液100yL，记为第I天，并在第22天进行一次增强免疫，注射含有10yg CII的IFA的乳浊液100μL，观察小鼠的临床表现。
[0069]评分:每两天评分一次，由两个独立的观察者完成;评分标准:O分，无红斑和水肿；I分，红斑和轻度水肿，局限于足中段(跗骨)或踝关节;2分，红斑和轻度水肿，从踝关节延伸到足中段;3分，红斑和轻度水肿，从踝关节延伸到跖关节;4分，红斑和严重水肿，包围了踝关节、足及足趾;对每个小鼠的四肢分别评定计算总分，最高分为16分。
[0070]分组:模型组，灌胃给予蒸馏水(溶剂)；给药组，灌胃给予MWP，剂量为200mg/kg/只；从小鼠初步出现关节红肿开始，每天给药，直至动物处理。
[0071]结果:图5为得到的牡蒿均一多糖(MWP)治疗胶原诱导小鼠关节炎的临床评分图，由图5可见:给药组小鼠的关节炎评分明显低于模型组，说明MWP对于胶原诱导小鼠关节炎有一定的治疗作用。
[0072]2)脚肿胀程度使用游标卡尺量取后脚脚掌厚度。
[0073]结果:图6为得到的牡蒿均一多糖(MWP)治疗胶原诱导小鼠关节炎的脚肿胀厚度图，由图6可见:与评分结果相应的，给药组小鼠的脚肿胀也轻于模型组。
[0074]3)血清中炎症因子IL-6和IL-17A使用Elisa试剂盒依据使用说明进行测定，购自^0eb1sciense^W| ο
[0075]小鼠摘除眼球取血后，离心，吸取上层血清用于检测炎症因子水平。
[0076]结果:图7为得到的牡蒿均一多糖MWP治疗胶原诱导小鼠关节炎后的小鼠血清IL-17A浓度图；图8为得到的均一多糖MWP治疗胶原诱导小鼠关节炎后的小鼠血清IL-6浓度图；从图中可见:给药组小鼠血清中的IL-6与IL-17A的水平均明显低于模型组，说明MWP可以显著降低小鼠血清中炎症因子IL-6和IL-17A的水平，进而说明MWP对于胶原诱导小鼠关节炎有一定的治疗作用。
[0077]综上所述可见:本发明从中药牡蒿中分离纯化出的新型菊糖型牡蒿均一多糖，能明显降低胶原诱导关节炎小鼠的脚肿胀程度和小鼠血清中的炎症因子IL-6和IL-17A水平，对胶原诱导小鼠关节炎有一定的治疗作用，可望作为主要或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗类风湿性关节炎的保健食品或药物制剂，相对于现有技术，取得了显著性进步和出乎意料的效果，对研究开发具有临床应用价值的牡蒿物制剂具有重要意义。
[0078]最后需要在此指出的是:以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种牡蒿均一多糖，其特征在于:是由牡蒿全草经水提醇沉后、柱层析分离纯化得至|J，是由果糖通过I，2连接的末端含葡萄糖基的菊糖型果聚糖，不含糖醛酸，且重均分子量为I?20kDa。2.—种制备权利要求1所述的牡蒿均一多糖的方法，其特征在于，所述方法包括如下具体步骤: a)取干燥牡蒿全草，对其进行水提醇沉后冷冻干燥，制得牡蒿多糖粗品； b)对步骤a)获得的牡蒿多糖粗品用水溶解后上样于碱性阴离子交换柱，使用水进行洗脱，得到牡蒿水洗脱部位多糖； c)将步骤b)获得的牡蒿水洗脱部位多糖上样于葡聚糖凝胶色谱柱，使用NaCl溶液进行洗脱;根据出峰位置收集有效部位，用截留分子量为100Da的透析袋透析后冷冻干燥，即得所述牡蒿均一多糖。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤a)中，先对干燥牡蒿全草用乙醇进行脱脂处理，残渣干燥后再进行水提醇沉。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤a)包括如下具体操作:先对干燥牡蒿全草用乙醇回流脱脂，脱脂后的残渣经干燥后加入水进行加热提取2?5次，合并提取液，减压浓缩，离心，收集上清液，加入乙醇进行醇沉，对收集的沉淀进行真空冷冻干燥，即得牡高多糖粗品。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:脱脂所用乙醇的质量分数为50%?95 %。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:加热提取的温度为60?100°C，每次提取的时间为I?5小时。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:醇沉时，向上清液中加入2?4倍体积的质量分数为90?100%的乙醇，边加边搅拌，至最终乙醇的质量分数为75?85%，静置12?36小时。8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤b)包括如下具体操作:将制得的牡蒿多糖粗品用水溶解后上样于碱性阴离子交换柱，使用水进行洗脱，硫酸-苯酚法追踪洗脱曲线，收集含糖溶液，减压浓缩，浓缩物透析后冷冻干燥，得到牡蒿水洗脱部位多糖。9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤c)包括如下具体操作:将制得的牡蒿水洗脱部位多糖用0.1?0.3mol/L的NaCl溶液溶解，离心，取上清液上样于葡聚糖凝胶色谱柱，用0.1?0.3mol/L的NaCl溶液进行洗脱，利用示差折光检测器进行检测，根据出峰位置收集有效部位;浓缩，用截留分子量为100Da的透析袋透析，冷冻干燥，即得所述的牡蒿均一多糖。10.—种权利要求1所述的牡蒿均一多糖的应用，其特征在于:以所述的牡蒿均一多糖作为活性成分用于制备预防或/和治疗类风湿性关节炎的保健食品或药物制剂。
【文档编号】A61P19/02GK105949336SQ201610304006
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】王顺春, 李宁, 施松善, 施晨晨, 苏娟, 刘睿敏
【申请人】上海中医药大学