平菇多糖的应用

平菇多糖的应用
【专利摘要】本发明涉及医药技术领域，公开了平菇多糖在预防和/或治疗阿尔茨海默病相关方面的新应用。平菇多糖能抑制体外乙酰胆酯酶的活力，有体外抗AD作用，能够明显能降低脑内p?tau、p?GSK3、Aβ三种蛋白水平，且能改善AD大鼠的认知障碍，并降低AD大鼠脑内乙酰胆碱酯酶水平，有明显的体内抗AD作用。本发明为治疗和缓解AD扩宽了途径，具有十分重要的意义。
【专利说明】
平菇多糖的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体的说是涉及平菇多糖的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来在真菌研究中发现许多多糖物质不仅具有抗肿瘤和较高免疫作用，而且具 有良好的药理和临床利用价值，并开发成临床药物。现代科学研究已证明，食用菌多糖对机 体免疫和细胞免疫均有增强作用;对网状内皮系统有兴奋功能，对动物肝脏有保护作用;具 有广谱的抗病毒、抗肿瘤的免疫作用和对胆固醇的溶解作用。
[0003] 平菇，在生物分类学中隶属于真菌门担子菌纲伞菌目白蘑科侧耳属，是一种常见 的食用菌，其主要活性成分为平燕多糖，在我国广泛种植。平燕多糖(Pleurotus ostreatus polysaccharide，POP)是从平燕中提取的一种重要组分，它具有抗氧化，抗肿瘤，抑制癌细 胞增生，诱导细胞凋亡，诱导干扰素合成等多种功能，因而备受人们关注。目前，有关平菇多 糖的提取方法多是煎煮法(水提醇沉）、酸碱浸提法、酶解法、超声波提取法。
[0004] 阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是一种原因不明以认知功能减退为主 要临床表现的神经系统退行性疾病，主要表现为进行性智能障碍，记忆力减退，伴有人格和 情感改变。随着我国人口老龄化的日益严重，AD已越来越成为一个严重的社会问题。因此， 寻找各种途径去实现治疗和缓解AD的研究工作都十分必要也具有十分重要的意义。虽然平 菇多糖具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤的作用，但是在预防和治疗AD方面还未有相关的报道。

【发明内容】

[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供平菇多糖在制备乙酰胆碱酶抑制剂中的应用， 以此提供平菇多糖在治疗因乙酰胆碱酶过多的疾病中的应用。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供平菇多糖在制备Αβ蛋白抑制剂中的应用。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供平菇多糖在制备去tau蛋白和/或GSK3蛋白磷酸化 水平药物中的应用。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供平菇多糖在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病药物 中的应用。
[0009] 本发明上述提到的抑制剂和药物可选自颗粒剂、胶囊剂、粉针剂、片剂、口服液、丸 剂、膏剂中的一种。本发明所述平菇多糖可按照本领域中煎煮法(水提醇沉）、酸碱浸提法、 酶解法、超声波提取法进行提取获得。本发明提供一个较优的提取方案为纤维素酶酶解法 配合超声波提取法进行提取，工艺条件为酶解温度为52°C，酶解时间为57min，酶用量 0.0165g，超声时间5min，具体可参照《Box-behnken设计-响应面法优选平燕中多糖的超声 波辅助纤维素酶提取工艺》中记载的提取方法。
[0010]乙酰胆碱是胆碱型神经元的信号递质，它传导的信号和认知、学习及记忆有关，其 代谢过程和AD紧密相关。在AD的早期，胆碱功能缺乏的症状早于其他任何症状，AD特征之一 的神经元凋亡也主要发生在胆碱神经元。患有AD的人90%在神经冲动传输过程中缺乏乙酰 胆碱，所以减轻病症方法之一是抑制乙酰胆碱酶对乙酰胆碱的水解，恢复乙酰胆碱的正常 水平。本发明从体外对平菇多糖的抗AD作用进行了检测，结果表明，平菇多糖能抑制体外乙 酰胆酯酶的活力，有体外抗AD作用。
[0011]同时，AD的主要病理特征之一是在大脑皮层和海马出现Αβ沉积聚集形成的老年斑 以及Tau蛋白过度磷酸化，形成纤维蛋白缠结。Αβ来源于份定粉样前体蛋白（ΑΡΡ)，ΑΡΡ经过两 条途径代谢:若被α分泌酶酶切，为α分泌酶途经，不产生Αβ;若被β分泌酶酶切则为β分泌酶 途径，可产生AKBACE表达的增加使β分泌酶含量增高，将会促使ΑΡΡ通过β分泌酶途径代谢， 形成ΑΚΑβ等可通过抑制ΡΙ3Κ和PKC途径而激活GSK30并使tau蛋白发生过度磷酸化、聚积， 从而导致神经元功能、结构改变，动物记忆障碍；同时抑制PI3K和PKC可持续激活GSK30; Tau 蛋白经PKA预磷酸化后更易于被GSK30磷酸化。因此，减少Αβ产生减少，抑制tau蛋白的磷酸 化，AD有可能得到有效的防治和治疗。本发明采用免疫蛋白印迹法对AD大鼠脑内与AD发生、 发展相关的三种蛋白：p-tau、p-GSK3、Ai3水平进行表达，结果表明，平菇多糖明显能降低脑 内p-tau、p-GSK3、A0三种蛋白水平。
[0012] 此外，本发明还通过跳台行为学实验、Morris水迷宫行为学实验评估平菇多糖改 善阿尔茨海默病行为学障碍的药效，结果表明，平菇多糖能改善AD大鼠的认知障碍，并降低 AD大鼠脑内乙酰胆碱酯酶水平，有明显的体内抗AD作用。
[0013] 由以上技术方案可知，本发明提供了平菇多糖在预防和/或治疗阿尔茨海默病相 关方面的新应用，为治疗和缓解AD扩宽了途径，具有十分重要的意义。
【附图说明】
[0014] 图1所示为平菇多糖对乙酰胆碱酯酶的IC5Q曲线图；
[0015] 图2所示为定位巡航实验红外热分布图；
[0016] 图3所示为空间搜索实验红外热分布图；
[0017]图4所示为免疫蛋白印迹结果。
【具体实施方式】
[0018] 本发明实施例公开了平菇多糖的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当 改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是 显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明所述应用已通过较佳实施例进行了描 述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改 动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0019] 以下就本发明所提供的平菇多糖的应用做进一步说明。
[0020] 实施例1:平菇多糖体外乙酰胆碱酯酶抑制作用研究
[0021] 1、实验方法
[0022] 采用酶标仪，建立体外乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选体系，利用体外酶活性测定方 法对乙酰胆碱酯酶抑制活性进行测定，通过IC5Q对活性成分进行评价。
[0023]酶标仪反应体系：
[0024] 样品（母液稀释10倍）/ddH2() 10uL 0· 1 mol/L PBS(PH=8.0) 50uL DTNB (5mM) 20uL
[0025] AchE (0.2U/rnL) 10uL ATCl(5mM) lOuL
[0026] 抑制率测定：
[0027] 反应体系中，96孔板内药物终浓度定为100mg/L，即母液稀释10倍后以10yL体积加 入反应体系，实验分为6组，每组设3个复孔，分别为阴性对照组(酶+缓冲液+底物），空白对 照组(底物+缓冲液），阳性对照组(加兰他敏+酶+缓冲液+底物），阳性空白对照组(加兰他敏 +缓冲液+底物），样品组(平菇多糖+酶+缓冲液+底物），样品空白对照组(平菇多糖+缓冲液+ 底物）（平菇多糖有色物在405nm处检测时会出现自身颜色干扰，因此在检测时要设置每味 平菇多糖各浓度的空白对照尽量避免假阳性现象）。首先将酶和缓冲液、药物、阳性对照物、 底物在37 °C温度下水浴30min，然后按照阳性对照物或平菇多糖、酶、缓冲液、底物的顺序依 次加入96孔板，使每个孔中的总体积为100yL，按反应体系加入，各孔的反应温度为37°C，时 间10min〇
[0028] 抑制率（％) = (0D阴性对照组-0D空白对照组)-(0D样品组-0D样品空白对照组)/ (0D阴性对照组-0D空白对照组）X 100%
[0029] 采用SPSS 10.0统计软件进行数据处理。实验结果以均数土标准差（r:ts)表示， Student' s t-test进行组间比较。P〈0.05为差异有统计学意义。
[0030] 2、实验结果
[0031] 通过表1和图1，可以得出平菇多糖抑制率呈一趋势上升，当升至最高时，不再上 升，呈下降趋势，得到抑制率在〇. 〇〇625g/mL(相当于生药量45.12mg/mL)时最大，此时抑制 率最大为72.41 %，即在此浓度时为最佳抑制状态，抑制率最大，IC5〇为3.01mg/mL(相当于生 药量21.73mg/mL)。从体外对平菇多糖的抗AD作用进行了筛选，结果表明，平菇多糖能抑制 体外乙酰胆酯酶的活力，有体外抗AD作用。
[0032] 表1平菇多糖对乙酰胆碱酯酶的抑制率
[0033]
[0034] 实施例2:平菇多糖改善阿尔茨海默病行为学障碍的药效学研究
[0035] 1、大鼠造模及分组
[0036] Wistar大鼠，雄性，体重180_220g，购自吉林大学白求恩医学院动物实验中心，许 可证号：SCXK(吉）2013-0001。适应性饲养一周后，随机分为3组，即：空白组，模型组及平菇 多糖组。除空白组外，其余2组均腹腔注射D-半乳糖60mg/kg和灌胃A1C1 3 200mg/kg造模，每 天1次，连续60d。第30d开始空白组和模型组按10mL/kg给予双蒸水，平菇多糖组按2g生药/ kg灌胃给予受试药，每日一次，连续30d。
[0037] 2、跳台行为学实验
[0038]末次给药后，进行大鼠跳台实验。实验时首先将大鼠放在SDT-8跳台实验视频分析 系统铜栅上适应5min，然后通以36V电流，以大鼠双足同时接触铜栅为触电，视为错误反应， 记录大鼠的错误次数作为学习成绩，训练后，重新再次进行实验，将大鼠置于塑料 跳台上适应5min，然后通以36V电流，记录第1次跳下平台的潜伏期和5min内的跳下平台的 错误次数，若大鼠停留在平台上超过5min，其潜伏期以300s计。
[0039] 3、Morris行为学实验
[0040] 分为适应性实验、定位巡航实验和空间搜索实验。
[0041] 适应性实验:实验前一天，将大鼠面朝池壁放入水中游泳120s后除湿放回笼中，进 行适应。
[0042] 定位航行实验：在迷宫（直径120cm，高50cm)内注入一定量水，水温控制在24 ± 2 °C。选取4个入水点，并将迷宫等分为4个象限。在其中任一象限正中放置透明塑料平台（直 径10cm)，没于水下2cm，并在实验过程中保持其位置不变。水中加入脱脂奶粉使大鼠不能见 到平台。将大鼠分别从各象限入水点面朝池壁顺次放入水中，记录其在120s内寻找并爬上 平台的时间，即为逃避潜伏期，爬上平台后允许大鼠在平台上停留20s，间隔60s后进行下一 次测试。如果大鼠在120s内未能找到平台，则将其引上平台并停留20s，记录其潜伏期为 120s。实验连续进行5天。
[0043]空间探索实验:定位航行实验结束24h后，取出平台，在原平台所在象限的相对象 限入水点将大鼠放入水中，采集其120s内穿越有效区域的次数及原平台所在象限路程/总 路程等实验参数。
[0044] 4、体内乙酰胆碱酯酶活力的测定 [0045] (1)样品的处理
[0046]行为学实验结束后，麻醉动物，取血，冰台快速取大脑，放入玻璃皿中，玻璃皿加入 少量冰冷的生理盐水漂洗，用干净的滤纸吸去大脑组织表面的水分和血液。精密称重，放入 小烧杯中。加入少量冰冷的生理盐水，用眼科剪尽快剪碎组织块。将剪碎的组织倒入玻璃匀 浆器中，再用少许冰冷生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆器中进行冰 浴匀浆。然后再加入冷冻的生理盐水，按脑组织重量与匀浆总体积1:10的比例，稀释混匀。 将制备好的10%脑勾衆以3000印111/111；[11离心15111；[11，取上清待测。取出的血以2500印111/111；[11离 心lOmin，取上层血清。测时将血清用生理盐水按1:9稀释。
[0047] (2)脑组织蛋白含量的测定
[0048]采用考马斯亮蓝试剂盒测定脑组织蛋白含量。
[0049] (3)AchE活力的测定
[0050]用改良Ellman比色法测定AchE的活力，按乙酰胆碱脂酶测定试剂盒的方法测定。 设标准管组、不加药测定管组、受试化合物测定管组(加药组），每组均设空白对照管和测定 管，大鼠脑组织匀浆液和血清取样量为每管30yL。反应体系混匀，37°C准确反应6min，然后 终止反应，混匀放置15min，在412nm波长测定各管吸光度。
[0051 ] 血清中AchE活力(U/mL) = (A测定管-A对照管)/(A标准管-A空白管）X标准管浓度 (lymol/mL)/蛋白量(mg/mL)。
[0052] 5、数据统计方法
[0053] 采用SPSS 10.0统计软件进行数据处理。实验结果以均数土标准差(I±s)表示， Student' s t-test进行组间比较。P〈0.05为差异有统计学意义。
[0054] 6、实验结果
[0055] (1)平菇多糖对大鼠跳台行为学障碍的药效学研究
[0056]与空白组比较，模型组大鼠的初次错误次数及24h错误次数均明显增加，24h错误 潜伏期缩短，P〈〇. 05或p〈0.01，表明AD模型造模成功；与模型组比较，平菇多糖组大鼠学习 成绩(初次错误次数）明显减少，P〈〇.05;与模型组比较，平菇多糖组大鼠24h错误次数明显 减少，p〈0.05，出现错误的潜伏期明显延长，p〈0.05，见表2。
[0057] 表2平菇多糖对AD大鼠记忆获得和记忆巩固障碍的影响（$±S,n = 10)
[0059] 与空白组比较，郎〈0 · 05，##p〈0 · 01;与模型组比较，*p〈0 · 05。
[0060] (2)平菇多糖对大鼠 Morris水迷宫行为学障碍的药效学研究(定位巡航实验）
[0061] 从定位巡航红外热分布图（图2)可以看出，空白组动物很快就可以找到目标所在 位置(第三象限），而模型组动物主要在外围活动，活动区域在各象限分布无显著差异，表明 模型组大鼠学习记忆能力和记忆获得能力受损。平菇多糖组动物也可以很快找到目标所在 区域，活动范围较模型组相比显著缩小。上述结果表明平菇多糖组可以明显改善AD大鼠学 习记忆能力。
[0062]与空白组比较，模型组大鼠5d内潜伏期内均增加，p〈0.05或P〈0.01，5d平均潜伏期 明显增加，P〈〇.01，表明模型组大鼠学习记忆行为能力明显受损。与模型组比较，平菇多糖 组大鼠5d内潜伏期内均减少，其中以前3d变化明显，P〈0.05或P〈0.01，5d平均潜伏期明显增 加，P〈0.05，表明平菇多糖能改善AD大鼠的记忆能力，见表3。
[0063]表3各组动物连续5天逃避潜伏期(s)
[0064]
[0065] 与空白组比较，##P〈0 · 01;与模型组比较，*P〈0 · 05，林P〈0 · 01。
[0066] (3)平菇多糖对大鼠 Morris水迷宫行为学障碍的药效学研究(空间搜索实验）
[0067]空间探索红外热分布图（图3)可以看出，空白组大鼠在原平台所在第三象限（原象 限）出现的频率较多，而模型组动物主要在外围活动，活动区域在各象限分布无显著差异， 上述结果表明模型组大鼠记忆巩固能力受损。与模型组比较，平菇多糖组大鼠在原象限出 现的频率较高，活动范围较模型组相比显著缩小。
[0068]与空白组比较，模型组大鼠在有效区域的运动时间、运动距离及进入有效区域的 次数均减少，其中以有效区域运动距离和进入次数减少尤为明显，P〈〇.05;模型组大鼠在第 三象限（原象限）的运动路程明显减少，P〈〇.05,进入原象限的百分比明显减少，P〈0.05;模 型组大鼠在原象限的运动时间明显减少，P〈〇.05,进入原象限的时间占总时间的百分比明 显减少，P〈0.05,进一步表明模型造模成功。与模型组比较，平菇多糖组大鼠进入有效区域 对的运动时间、距离次数均有所增加，P〈〇.05,在原象限的游泳时间和游泳路程，均有所增 加，表明平菇多糖组能增加 AD大鼠的认知能力，见表4。
[0069]表4各组动物空间搜索实验数据
[0070] 与空白组比较，#P〈0 · 05，##P〈0 · 01;与模型组比较，*P〈0 · 05。
[0071] (4)平菇多糖对AD大鼠脑内乙酰胆碱酯酶含量的影响
[0072] 与正常组比较，模型对照组大鼠的脑内乙酰胆碱酯酶水平明显增加，p〈0.01;与模 型组比较，平菇多糖组脑内乙酰胆碱酯酶水平明显降低，p〈〇.05,表明平菇多糖能抑制脑内 乙酰胆碱酯酶水平，见表5。
[0073] 表5平菇多糖对AD大鼠脑内乙酰胆碱酯酶的影响士s,n = 10)
[0075] 与空白组比较，##P〈0 · 01，##P〈0 · 01;与模型组比较，*P〈0 · 05。
[0076] 7、结论
[0077]跳台实验和Morris水迷宫实验从行为学评价平菇多糖的体内抗AD作用，表明平菇 多能增加 AD大鼠记忆获得、巩固能力，改善认知障碍;平菇多糖还能降低脑内乙酰胆碱酯酶 含量，有明显的体内抗AD作用。
[0078]实施例3:平菇多糖对AD大鼠脑内相关蛋白表达的影响
[0079]采用免疫蛋白印迹法对分别为空白组、模型组、平菇多糖组(分组参照实施例2)三 组大鼠脑脑组织中p-tau、p-GSK3、Αβ三种蛋白水平进行表达，以GATOH作为内参蛋白，使用 image J图像处理软件进行灰度分析。
[0080]与空白组比较，模型组Αβ水平及tau、GSK3磷酸化水平增加;与模型组比较，平菇多 糖可降低大鼠脑内Αβ水平以及tau、GSK3磷酸化水平，即通过影响Αβ代谢等相关通路，改善 AD大鼠的认知障碍，结果见图3。
[0081 ] 通过采用免疫蛋白印迹法测定AD大鼠脑中p-tau、p-GSK3、Ai3三种蛋白水平含量的 变化，结果表明，平菇多糖明显能降低脑内与AD发生发展相关的重要蛋白Tau、GSK3的磷酸 化水平、降低Αβ蛋白水平，其抗AD机制可能与影响Αβ代谢等相关通路有关。
[0082]以上所述只是用于理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明进行若干改进和修饰， 这些改进和修饰也落入本发明权利的保护范围。
【主权项】
1. 平菇多糖在制备乙酰胆碱酶抑制剂中的应用。2. 根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述抑制剂为颗粒剂、胶囊剂、粉针剂、片剂、 口服液、丸剂、膏剂中的一种。3. 平菇多糖在制备Αβ蛋白抑制剂中的应用。4. 根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述抑制剂为颗粒剂、胶囊剂、粉针剂、片剂、 口服液、丸剂、膏剂中的一种。5. 平菇多糖在制备去tau蛋白和/或GSK3蛋白磷酸化水平药物中的应用。6. 根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物为颗粒剂、胶囊剂、粉针剂、片剂、口 服液、丸剂、膏剂中的一种。7. 平菇多糖在制备治疗和/或预防阿尔茨海默病药物中的应用。8. 根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述药物为颗粒剂、胶囊剂、粉针剂、片剂、口 服液、丸剂、膏剂中的一种。
【文档编号】A61K31/715GK105902560SQ201610297756
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】张艳, 金刚, 曲小姝, 杨秀东, 张扬, 周鸿立
【申请人】吉林化工学院