专利名称：炎症因子TNFα刺激人ACAT1基因表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和基因治疗领域，更具体而言，涉及炎症条件下的人ACATl 基因表达调控研究领域。
背景技术：
动脉粥样硬化是导致冠心病、中风等心脑血管病的最危险因子。由ACAT合成的胆 固醇酯在泡沫细胞内的聚集是动脉粥样硬化病灶中形成的主要标志。 在动脉粥样硬化形成过程中，酰基辅酶A :胆固醇酰基转移酶(ACAT，
Acyl-coenzyme A :cholesterol acyltransferase， EC2. 3. 1. 26)起着重要的作用。 ACAT是人细胞内唯一催化长链脂肪酸和游离胆固醇形成胆固醇酯的酶，在生物
体内发挥重要的生理功能，是维持体内胆固醇及其脂类代谢平衡的关键酶之一。ACAT在
生命细胞游离胆固醇更新变化、维持血液胆固醇水平等平衡代谢中起关键作用，病理上与
胆固醇及其脂类代谢平衡紊乱引起的动脉粥样硬化病变、高胆固醇血症、老年性痴呆症
(Alzheimer' s disease)等疾病直接相关，是国际前沿密切关注的极重要的筛药靶标。 长期以来，筛选ACAT的特异的抑制剂成为一些制药公司竞相研究的热点。 但这些抑制剂的特异性较差，毒副作用较大。而且，由于天然形式的ACAT蛋白还
没有纯化成功，因此寻找ACAT特异有效的抑制剂还很困难。所以，开展基因水平的工作，对
深入研究ACAT的作用机制与结构功能及其与相关疾病的关系，显得极为重要，这也是目前
唯一切实可行的途径。 ACAT包括ACAT1和ACAT2。 ACATl基因(Acatl)在人体组织细胞广泛表达，而ACAT2 基因(Acat2)主要在肝肠组织细胞特异表达。 1993年，美国达特茅斯(Dartmouth)医学院Chang TY实验室首次克隆具有活性 功能的人ACATl cDNA(4011bp)，其开放阅读框编码550个氨基酸序列(Chang TY等，1993， J Biol Chem， 268 :20747-20755) 。 ACATl cDNA及其编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO :2所示。 发明人实验室对ACAT进行了系统深入的研究，发表了人ACATl基因组DNA组织 结构、启动子序列，并且发现人ACATl mRNA序列分别来自于两条不同的染色体(Li BL等， J Biol Chem， 1999,274 :11060-11071);发现与动脉粥样硬化发生密切相关的细胞因子 IFN-y和糖皮质激素地塞米松(Dex)可增强启动子活性而提高人ACATl基因的表达(Yang JB，等，J Biol Chem， 2001 ，276 :20989-20998 ;Yang L等，Cell Res， 2004， 14 :315-323)。此 外，ACAT1在动脉粥样硬化斑块中高表达，特别是在单核/巨噬细胞中(Chang TY等，1997， An皿Rev Biochem，66 :613-638 ;Miyazaki A等，1998， Arterioscler Thromb VascBiol， 18 :1568-1574)。这些表明ACATl基因功能的重要性和复杂性。 TNFa是一种广泛存在的炎症因子，在应对外界感染、参与免疫应答以及阻止肿瘤 的发生中有着重要的作用(Aggarwal BB等，1996 ;Ware CF等，1996)。 人TNFa具有26kD跨细胞膜的前体形式，被酶解而加工成为17kD含有157个氨基酸的成熟形式，被分泌到细胞外(Vilcek J等，1991)。活化的淋巴细胞、巨噬细胞、内皮 细胞和平滑肌细胞都能分泌TNF a (Libby P等，1991)。 特别值得注意的是TNF a在动脉粥样硬化斑块中高量存在(Ware CF等，1996)。 近年来有报道认为，TNFa与动脉粥样硬化的发生发展密切相关(Bran紐L等，2004)。分 子水平的研究发现，TNFa能够调控多种动脉粥样硬化相关基因的表达，包括增加人血管内 皮细胞表达ICAM-1和VCAM-1而促进THP-1细胞与之黏附(Zhou Z等，2007)、提高与动脉 粥样硬化斑块破裂相关的胞外基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9)的表达 (Heidinger M等，2006)、调控细胞摄取胆固醇的清道夫受体(CD36， SRA和LOX-1)以及介 导细胞夕卜排胆固醇的ABCAl (ATP-binding cassette transporter A 1)的表达(Boyer JF 等，2007， HsuHY等，1996， Kume N等，1998， Gerbod-Giannone MC等，2006)。这些报道显示 TNF a参与了动脉粥样硬化的多个过程。 虽然，现有技术中已知人ACATl和TNFa在动脉粥样硬化斑块中含量都很高，且 在动脉粥样硬化的形成过程中起着重要的作用，但是由于基因调控和生物化学过程的复杂 性，现有技术中并未给出TNF a与ACAT1 二者之间存在任何调控关系的启示和报道。
综上所述，本领域迫切需要明确与ACAT1基因表达相关的物质，通过基因水平的 研究明确其作用靶位，深入研究ACAT的作用机制与结构功能及其与胆固醇及其脂类代谢 平衡紊乱引起疾病(尤其是动脉粥样硬化病变、高胆固醇血症、老年性痴呆症等)的关系。 这对于这些疾病的治疗和药物筛选显得极为重要，也是目前唯一切实可行的途径。
发明内容
本发明的目的正是揭示TNFa与ACAT1 二者之间的调控关系，并从基因水平上进 一步明确调控所涉及的功能性元件。 在本发明的第一方面，提供了一种TNFa剌激应答序列，其具有SEQ IDN0 :3所示 的序列，艮卩5' -CCTGGCAACCTGGGGACC A ￡￡A_3'。 在本发明的一个实施方式中，所述序列是SEQ ID N0:3所示的序列。
在本发明的另一个实施方式中，所述序列位于ACATl基因转录起始位点上游。
在本发明的一个实施方式中，所述序列为ACAT1基因转录起始位点上游 的-100 -79所示的区域。 在本发明的一个实施方式中，TNFa剌激作用于所述应答序列，并使得ACAT1基因 转录增强。 在本发明的第二方面中，提供了一种通过基因工程方法获得的含有本发明所述的 TNF a剌激应答序列的细胞。 所述的细胞可通过如下方法获得利用本发明的TNFa剌激应答序列进一步构 建相应含有该特异性区域与报告基因质粒系统，通过转染各种细胞而整合进入细胞基因组 内，进一步的反复筛选可获得稳定表达报告基因的细胞株。该细胞株具有应答TNFa剌激 的特征，进而可应用于大规模的新药筛选研究。 由此，本发明还进一步提供了一种构建可应用于大规模新药筛选的细胞的方法， 所述方法包括利用本发明的TNFa剌激应答序列构建含有该特异性区域与报告基因质粒 系统；通过转染各种细胞而使所述系统整合进入细胞基因组内；进一步的反复筛选可获得
4稳定表达报告基因的细胞株。 在本发明的第三方面中，提供了一种筛选治疗胆固醇代谢异常相关疾病的药物的 方法，所述方法包括 使候选药物和TNF a同时与含有本发明的TNF a剌激应答序列的细胞接触；
在相同条件下，使TNF a与含有本发明的TNF a剌激应答序列的细胞接触，作为阳 性对照； 测定所述细胞中ACAT1基因的表达水平； 如果用候选药物处理的细胞中ACAT1基因的表达水平与阳性对照相比有所降低，
则表明所述候选药物可用作治疗胆固醇代谢异常相关疾病的药物。 在一个优选例中，所述药物选自蛋白质药物、多肽药物、或核酸药物。 在另一优选例中，所述候选药物具有与所述TNFa剌激应答序列相对应的序列或结构。 在另一优选例中，所述细胞是通过基因工程方法获得的含有本发明所述的TNFa 剌激应答序列的细胞。 在另一优选例中，所述胆固醇代谢异常相关的疾病选自动脉粥样硬化、高胆固醇 血症或老年性痴呆症，优选所述疾病为动脉粥样硬化。 在本发明的第四方面中，提供了一种筛选治疗胆固醇代谢异常相关疾病的药物的 方法，所述方法包括 使候选药物与含有本发明的TNF a剌激应答序列的细胞接触；
测定所述细胞中ACAT1基因的表达水平； 如果用候选药物处理的细胞中ACAT1基因的表达水平与未用候选药物处理的细
胞相比有所降低，则表明所述候选药物可用作治疗胆固醇代谢异常相关疾病的药物。 在一个优选例中，所述药物选自蛋白质药物、多肽药物、或核酸药物。 在另一优选例中，所述候选药物具有与所述TNFa剌激应答序列相对应的序列或结构。 在另一优选例中，所述细胞是通过基因工程方法获得的含有本发明所述的TNFa 剌激应答序列的细胞。 在另一个优选例中，所述胆固醇代谢异常相关的疾病选自动脉粥样硬化、高胆固 醇血症或老年性痴呆症，优选所述疾病为动脉粥样硬化。 在本发明的第五方面，提供了一种本发明的TNFa剌激应答序列在筛选通过结合 所述TNFa剌激应答序列来抑制ACAT1基因表达从而治疗与胆固醇代谢异常相关的疾病的 药物中的用途。 在本发明的一个实施方式中，所述胆固醇代谢异常相关的疾病选自动脉粥样硬
化、高胆固醇血症或老年性痴呆症。 在一个优选例中，所述疾病为动脉粥样硬化。 在本发明的第六方面中，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有通过本发 明的方法筛选出的药物和药学上可接受的载体。 在一个优选例中，所述药物组合物还含有治疗胆固醇代谢异常相关疾病的其它药物。
应理解的是，本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1 :炎症因子TNF a增强人血单核细胞ACATl mRNA转录。 人血单核细胞用RPMI1640+7%人AB血清培养基培养48小时，之后在同样培养基条件下，用不同浓度(如图所示)的TNFa剌激40小时，收集细胞抽提总RNA。运用定量PCR方法检测人ACATl mRNA的含量。结果显示为相对ACATl mRNA含量，ACATl基因的mRNA含量用各自的内标基因GAPDH的mRNA含量进行校正，然后以无TNF a剌激的样品作为1. 0得到ACATl基因表达的相对比例。 图2 :炎症因子TNF a增强人ACATl mRNA转录具有细胞特异性。
人单核细胞株THP-1、U937和HL60以及非单核细胞株HeLa和HEK293在各自的合适培养基中，在有或无5ng/ml TNF a剌激的条件下培养40小时，收集细胞抽提总RNA。运用定量PCR方法检测人ACATl mRNA的含量。结果显示为相对ACATl mRNA含量，ACATl基因的mRNA含量用各自的内标基因GAPDH的mRNA含量进行校正，然后以无TNF a剌激的样品作为1. 0得到ACATl基因表达的相对比例。 图3 :炎症因子TNF a增强人ACATl mRNA转录具有细胞因子特异性。
炎症因子TNFa增强人ACATl mRNA转录具有细胞因子特异性。在RPMI1640+10%FBS培养基中，用如图所示浓度的不同细胞因子M-CSF， GM-CSF， MCP-l， IL_6， IL-IO，IFN-y， IL-IP和TNFa剌激单核细胞株THP-140小时，收集各样品细胞并抽提细胞总RNA。运用定量PCR方法检测人ACATl mRNA的含量。结果显示为相对ACATl mRNA含量，ACATl基因的mRNA含量用各自的内标基因GAPDH的mRNA含量进行校正，然后以无TNF a剌激的样品作为1. 0得到ACATl基因表达的相对比例。 图4 :人ACATl基因转录起始位点上游的TNF a剌激应答区域鉴定。 图4A为带有人ACATl基因转录起始位点上游片段(-125/+34)的荧光素酶表达质
粒pM50及其含有人ACATl基因转录起始位点上游不同缺失的衍生质粒pD52、pD53、pD34和
pD35的简易图谱。 图4B为各种荧光素酶表达质粒应答TNF a剌激的荧光素酶活性分析，将图4A中对应的各荧光素酶表达质粒用DEAE-Dextran法转染THP-1细胞，转染7小时后用5ng/ml TNF a处理，40小时后收集细胞，用细胞抽提物进行荧光素酶活性分析。各样品用各自P-半乳糖苷酶活力来校正获得样品荧光素酶活力；再以没用TNFa处理的作对照，计算出相对荧光素酶活力。 图5 :应答TNF a剌激的人ACATl基因转录起始位点上游功能性顺式元件。
图中，-125 +34为人ACATl基因转录起始位点附近的一段序列，+1表示转录起始位点。在人ACATl基因转录起始位点上游存在-22bp的TNFa剌激应答区域(-100 -79，用框标出)，其中下划线部分为类NF- k B顺式元件，黑体划线i是TNF a剌激增强人ACATl基因转录应答的类NF- k B顺式元件的特征性位点。
具体实施例方式
本发明人经过长期而深入的研究发现炎症因子TNF a可特异性地增强人ACATl基因转录，且TNF a是通过人ACAT1基因转录起始位点上游的功能性顺式元件对ACAT1的转录起到剌激作用。这些研究结果表明了TNFa与动脉粥样硬化早期病变一泡沫细胞形成直接相关，因而显示本发明为胆固醇代谢异常疾病提供更为直接的潜在筛药靶标。在此基础上，本发明人完成了本发明。 如本文所用，"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由构成"、"基本上由构成"、和"由构成"；"主要由构成"、"基本上由构成"和"由构成"属于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。 如本文所用，术语"TNF a剌激应答序列"和"TNF a剌激应答区域"可互换使用，均表示具有SEQ ID N0:3所示序列的区域。TNFa可作用于本发明的所述剌激应答序列，并使得ACAT1基因转录增强。该序列优选位于ACAT1基因转录起始位点上游(例如ACAT1基因转录起始位点上游的-100 -79所示的区域)。 如本文所用，术语"ACAT"是酰基辅酶A :胆固醇酰基转移酶(Acyl-coenzymeA :cholesterol acyltransferase)的縮写。ACAT1基因(Acatl)作为ACAT中的一类在人体
组织细胞广泛表达，且与胆固醇及其脂类代谢平衡紊乱引起疾病具有密切联系。 具体而言，本发明人首先发现，在动脉粥样硬化斑块存在的炎症因子TNFa特异
性增强人单核细胞分化过程中ACAT1基因表达。TNFa处理分化过程中的人血来源单核细胞和人源单核细胞株(THP-l、 U937和HL60)，均可检测到显著增强ACAT1基因的转录；而TNFa处理非单核细胞株(HeLa和HEK293)，对人ACATl基因转录无明显影响。这些结果表明，TNFa增强人ACATl基因转录具有细胞特异性，提示TNFa特异性增强分化过程中的人单核细胞ACAT1基因转录而提高ACAT1的表达与酶活性，从而导致大量胆固醇酯合成堆积而形成动脉粥样硬化早期病变 一 泡沫细胞。 本发明人进一步发现，在动脉粥样硬化斑块存在的其它细胞因子如M-CSF、GM-CSF、MCP-1、IL-1 P 、IL-6、IL-10和IFN-y (Alain T等，2006)的单一性处理，均未观察到明显增强人单核细胞ACAT1基因转录。这些结果表明，TNFa增强人ACAT1基因转录具有细胞因子特异性，提示TNFa在动脉粥样硬化斑块形成过程发挥特异的病理效应。
本发明人还进一步证明了 TNF a剌激是通过人ACAT1基因转录起始位点上游的应答序列，而发挥增强人单核细胞ACAT1基因转录功能作用。通过人ACAT1基因转录起始位点上游不同缺失的荧光素酶报告基因质粒转染表达分析，发明人发现人ACATl基因转录起始位点上游存在一个22bp的TNFa剌激应答区域(-100 -79)。它的具体序列见图5的标记框内序列(SEQ IDN0:3，5' -CCTGGCAACCTGGGGACCACCA-3')，其中下划线部分为类NF- k B顺式元件；与NF- k B顺式元件的通用序列(5' -GGGRNNYYCC-3' ， R为嘌呤、N为任何碱基、Y为嘧啶)相比，黑体划线i是TNF a剌激增强人ACAT1基因转录应答的类NF- k B顺式元件的特征性位点(图5)。这些说明，炎症因子TNFa剌激人ACATl基因转录，是通过对应的功能性顺式元件而导致特异的动脉粥样硬化病理效应。 综上所述本发明的发现，发明人证明了 TNFa与动脉粥样硬化早期病变 一 泡沫细胞形成直接相关，因而显示本发明为胆固醇代谢异常疾病提供更为直接的潜在筛药靶标。同时，将促进深入阐明有关胆固醇代谢平衡生理功能与病理变化机理，可为相关临床、药物研究等提供理论依据和重要基础。总之，本发明的上述几方面发现，不但为治疗胆固醇代谢异常疾病(如动脉粥样硬化引起的冠心病、中风等疾病)提供新的途径，而且在基础理论研究上具有重要意义。 利用发明人发现的人ACAT1基因转录起始位点上游存在的这个22bpTNF a剌激应答区域(-100 -79)，可进一步构建相应含有该特异性区域与报告基因质粒系统，通过转染各种细胞而整合进入细胞基因组内，进一步的反复筛选可获得稳定表达报告基因的细胞株。该细胞株具有应答TNFa剌激的特征，进而可应用于大规模的新药筛选研究。
实施例 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 实施例l.细胞培养、刺激和总RNA (Total RNA)的制备及定量PCR(aPCR)分析
1.细胞及其培养 人血单个核细胞购自上海市血液中心，其中单核细胞的分离根据(ChengW，等1995)的方法进行。人血单核细胞用RPMI 1640+7X人AB血清培养基(lOOii g/ml卡那霉素、50U/ml链霉素和2g/L碳酸钠)培养。 THP-1、U937和HL60细胞系购自ATCC(美国马塞诸塞州，Manassas, USA)，用RPMI1640+10% FBS培养基(100 ii g/ml卡那霉素、50U/ml链霉素和2g/L碳酸钠)培养。
HeLa和HEK293细胞系购自ATCC，用DMEM+10% FBS培养基(100 ii g/ml卡那霉素、50U/ml链霉素和2g/L碳酸钠)培养。 上述细胞的培养条件均为95%湿度，5% C02，37°C。
2.细胞的剌激 将分离到的人单核细胞在RPMI 1640+7X人AB血清培养基中贴壁培养48小时，然后加入不同浓度的TNFa (分别为0，2. 5， 5， 10， 20ng/ml)剌激40小时，并收集细胞以抽提RNA。 细胞特异性实验中，单核细胞株THP-1、 U937和HL60以及非单核细胞株HeLa和HEK293用5ng/ml TNF a剌激40小时，并收集细胞以抽提RNA。 细胞因子特异性实验中，用不同浓度的细胞因子30或90ng/ml的M-CSF，80或240ng/ml的GM-CSF， 10或30ng/ml的MCP-1， 5或15ng/ml的IL-6， 10或30ng/ml的IL-IO，10或30ng/ml的IFN- y ， 5或15ng/ml的IL-1 P禾P 5或15ng/ml的TNF a分别剌激THP-1细胞40小时，并收集细胞以抽提RNA。 3.总RNA (Total RNA)的制备及定量PCR(qPCR)分析 在剌激细胞40小时后，用Invitrogen公司的Trizol Reagent抽提细胞总RNA (total RNA)，测定260nm的光吸收，计算其浓度。cDNA的合成采用20 y 1体系(4 y g总RNA为模板，O. 5iig寡(dT)12—18为引物，4111 2.5,1/L dNTP，4iU 5X第一链缓冲液(first strand buffer)，由1 ii 1 (200U/ii 1，购自Promega公司)莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(moloney murine leukemia virus reversetranscriptase， Promega)进行逆转录反
8应。在50 ill PCR反应体系中进行定量PCR反应，该体系中含有liil逆转录合成的cDNA
模板，10mM Tris-HCl， pH8. 3，50mM KC1， 1. 5mM MgCl2，0. 5mM dNTP，O. 5mM各对引物和5U的
Taq DNA聚合酶(TAKARA)。定量PCR(qPCR)所采用的仪器为Brilliant SYBR GreenqPCR
Master Mix禾口 Mx3005PTM定量PCR仪(Stratagene)。 扩增人源ACAT1基因产物的引物为 SEQIDN0:4:5' -GATGAAGGAAGGCTGGTGC-3';禾口 SEQIDN0:5:5' -GGAAGCTGGTGGCAGTGTAT-3'。 扩增人源GAPDH基因产物的引物为 SEQIDN0:6:5' -ACCCACTCCTCCACCTTTG-3';禾口 SEQIDN0:7:5' -CTGTAGCCAAATTCGTTGTCAT—3'。 人ACAT1 mRNA含量用内标基因GAPDH的mRNA校正，然后以无TNF a剌激的样品作为1. O，得到ACAT1基因表达的相对比例。
4.实验结果与结论 炎症因子TNF a对分离到的人血单核细胞ACAT1 mRNA转录的作用结果如图1所示。结果显示用TNFa处理分化过程中的人血来源单核细胞，可检测到显著增强ACATl基因的转录。 细胞特异性实验中，炎症因子TNFa对不同细胞的ACAT1 mRNA转录的作用结果如图2所示。结果显示TNFa处理分化过程中的人源单核细胞株(THP-1、U937和HL60)，均检测到显著增强ACAT1基因的转录。而TNF a处理非单核细胞株(HeLa和HEK293)，对人ACAT1基因转录无明显影响。 上述结果表明TNFa增强人ACAT1基因转录具有细胞特异性，提示TNFa特异性增强分化过程中的人单核细胞ACAT1基因转录而提高ACAT1的表达与酶活性，从而促进大量胆固醇酯合成堆积而形成动脉粥样硬化早期病变 一 泡沫细胞。 细胞因子特异性实验中，不同细胞因子(M-CSF， GM-CSF， MCP-l， IL_6， IL_10，IFN- y ， IL-1 P禾P TNF a )对单核细胞株THP-1的ACAT1 mRNA转录的作用如图3所示。
结果显示在动脉粥样硬化斑块存在的其它细胞因子如M-CSF、 GM-CSF、 MCP-l、IL-1 P 、 IL-6、 IL-10和IFN-y (Alain T等，2006)的单一性处理，均未观察到明显增强人单核细胞ACATl基因转录，而TNFa则可显著提高ACAT1的表达与酶活性。这些结果表明，TNFa增强人ACATl基因转录具有细胞因子特异性，提示TNFa在动脉粥样硬化斑块形成过程发挥特异的病理效应。 实施例2.荧光素酶报告基因表达质粒的构建 根据现有技术的记载构建带有人ACAT1基因转录起始位点上游片段(-125/+34)的荧光素酶表达质粒pM50(Yang JB等，2001)。进一步利用PCR使该表达质粒5'-端缺失，从而产生一系列分别包含有-100/+34和-78/+34的人ACAT1基因转录起始位点上游不同缺失的荧光素酶表达质粒。 以pM50质粒为模板，分另U 以弓l 物(SEQ ID NO:8:5 ' _AAAGGTACCACTGGCAACCTG_3 ')禾口 (SEQ ID N0:9:5 ' -AAAGGTACCATAGGATGCTCAGCC-3 ')为正向引物，以通用引物GLP2 (SEQ ID NO : 10 :5' -CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA-3')为反向引物，进行PCR扩增。产物经过双酶切后，接
9入pGL-2E载体(购自Promega公司)的Kpn I和Nhe I位点，分别获得目标质粒pD52和pD53。 包含3'-端缺失的人ACATl基因转录起始位点上游片段(-125/-79)的荧光素酶表达质粒的构建同样以pM50质粒为模板，以通用引物GLPl(SEQ ID NO:11 :5 ' -TGTATCTTATGGTACTGTAACTG-3 ')为正向引物，以引物(SEQ ID NO :12 :5' -AAAGCTAGCTGGTGGTCCCCA-3')为反向引物进行PCR扩增。产物经过双酶切后，接入pGL-2E载体的Kpn I和Nhe I位点，获得目标质粒为pD34。 其中，有 一 段特殊的3 ' _端缺失的人ACAT1基因转录起始位点上游片段(-125/-101)由合成的两段互补的寡核苷酸链(SEQ ID NO :13 :5' -CAAGGGGCGGGGAGGTGGGCGGAG-3'，和SEQ ID NO :14 :5' -CTAGCTCCGCCCACCTCCCCGCCCCTTGGTAC-3')退火而成，随后接入pGL_2E载体的Kpn I和Nhe I位点，获得目标质粒为pD35。 上述质粒的简易图谱如图4A所示。 实施例3. DNA转染和人ACAT-1某因转录表汰活件分析 用DEAE-Dextran法转染THP-1细胞，按照Mackman等描述的方法修改进行(Mackman N等，1991 ;Yang JB等，2001)。转染时，先用PBS洗涤细胞两次，然后使每4X 106个细胞在lml STBE(25mM Tris-HCl， pH7. 4， 5mM KCl，0.7mM CaCl2， 137mM NaCl，0.6mMNa2HP04， 0. 5mM MgCl2)中与1. 5 ii g样品DNA、0. 75 ii g内标DNA、 150 ii g DEAE-Dextran混匀，并在37。C下作用15分钟。离心去上清，用PBS洗涤两次，去除残留的DEAE-Dextran，然后加入12ml RPMI 1640 (含10% FBS)培养7小时后，用5ng/ml TNF a按实施例1所述方法进行处理，培养40小时后收集细胞。 将所收集的细胞用预冷PBS洗两次，然后加入200 iU裂解缓冲液，混匀后静置3 0分钟，4 °C ， 12 ， 000r p m离心5分钟，取出上清液即为细胞抽提物。荧光素酶活性分析时，取60 iil细胞抽提物，加60 iil荧光素酶分析缓冲液(luciferase assay buffer,Promega公司)，混匀，于1分钟内计数荧光粒子。所用荧光粒子计数器(Auto Lumat BG-Pluminometer， MGM instrument Inc.)为PE公司产品。 取30 ill细胞抽提物，加入30 ill 13 _半乳糖苷酶分析缓冲液(P-galactosidaseassay buffer, clontech)，在室温下反应60分钟。用荧光粒子计数器(Auto LumatBG-P luminometer, MGM instrument Inc.)测定IO秒钟内的粒子数。[O104]相对荧光素酶活力的计算公式为
^ 口 #AJA^lffl^、V^+I 样品荧光粒子计数样叩灭光素酶活力一 样品p半錯魏活力计数
相对荧光素酶活力=ff5liil^(倍)
对照荧光素酶活力 测定时同一批样品之间的P-半乳糖苷酶基因转染效率(P-半乳糖苷酶活力O.D.^/对应的蛋白量)的波动应小于15%，每一实验作三份平行样品。转染含人ACAT1基因转录起始位点上游的不同片段的荧光素酶报告基因质粒的样品组，以没用TNF处理的样
10CN 101787365 A 相对荧光素酶活力。 实验结果如图4B所示，其中-100 -79区域的缺失，使得TNFa的剌激增强效应
消失，而其它区域的缺失均不影响TNFa的剌激增强效应。该结果表明人ACAT1基因转录
起始位点上游存在一个22bp的TNFa剌激应答区域(-100 -79)。 实施例4.人ACAT1某闵转录起始份点卜.游的TNFa刺激应答区域的鉴定应用实施例2中构建的系列含5' _端缺失和3'-端缺失的人ACATl基因转录
起始位点上游不同缺失的荧光素酶表达质粒转染THP-1细胞，按实施例3的方法处理后测
定得到各质粒转染细胞应答TNFa剌激的情况。 结合序列缺失与荧光素酶检测结果，确定人ACAT1基因转录起始位点上游-100 -79的22bp是应答TNF a剌激的效应区域(如图5)。它的具体序列见图5的标记框内序列(SEQ ID N0:3，5' -CCTGGCAACCTGGGGACC A CCA-3')，其中下划线部分为类NF- k B顺式元件。与NF- k B顺式元件的通用序列(5' -GGGRNNYYCC-3' ， R为嘌呤、N为任何碱基、Y为嘧啶)相比，黑体划线4是TNF a剌激增强人ACAT1基因转录应答的类NF- k B顺式元件的特征性位点(图5)。 以上结果表明，炎症因子TNFa剌激人ACAT1基因转录，是通过对应的功能性顺式元件而促进特异的动脉粥样硬化病理效应。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 序列表 〈110〉中国科学院上海生命科学研究院
〈120〉炎症因子TNFa剌激人ACAT1基因表达
〈130>090343
〈160>14
〈170>PatentIn version 3.3
〈210>1
〈211>3407
〈212>DNA
〈213>寡核苷酸
〈220〉 〈221>CDS 〈222>(64). (1713)
11
〈400>1 AOgcttcccggctctgccctcttggccgaagt gcccgctgcc gggegeggge ctcagacaat
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14
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<212〉DNA 〈213〉寡核苷酸
〈400>5
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〈210>10 〈211〉23
18〈212>DNA 〈213〉寡核苷酸
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〈210>11 〈211>23 〈212>DNA 〈213〉寡核苷酸
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〈400>13
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<210>14 〈211>32 〈212>DNA 〈213〉寡核苷酸
〈400>14
ctagctccgc ccacctcccc gccccttggt ac 3权利要求
一种TNFα刺激应答序列，其具有SEQ ID NO3所示的序列。
2. 如权利要求1所述的TNFa剌激应答序列，其特征在于，所述序列是SEQID NO :3所 示的序列。
3. 如权利要求l所述的TNFa剌激应答序列，其特征在于，所述序列位于ACATl基因转 录起始位点上游。
4. 如权利要求l所述的TNFa剌激应答序列，其特征在于，所述序列为ACATl基因转录 起始位点上游的-100 -79所示的区域。
5. 如权利要求l-4中任一项所述的TNFa剌激应答序列，其特征在于，TNF a剌激作用于所述应答序列，并使得ACATl基因转录增强。
6. —种通过基因工程方法获得的含有权利要求l-5任一项所述的TNFa剌激应答序列的细胞。
7. —种筛选治疗胆固醇代谢异常相关疾病的药物的方法，所述方法包括 使候选药物和TNF a同时与含有权利要求1-5中任一项所述的TNF a剌激应答序列的细胞接触；在相同条件下，使TNFa与含有权利要求1-5中任一项所述的TNF a剌激应答序列的 细胞接触，作为阳性对照；测定所述细胞中ACATl基因的表达水平；如果用候选药物处理的细胞中ACATl基因的表达水平与阳性对照相比有所降低，则表 明所述候选药物可用作治疗胆固醇代谢异常相关疾病的药物。
8. —种筛选治疗胆固醇代谢异常相关疾病的药物的方法，所述方法包括 使候选药物与含有权利要求1-5中任一项所述的TNF a剌激应答序列的细胞接触； 测定所述细胞中ACATl基因的表达水平；如果用候选药物处理的细胞中ACATl基因的表达水平与未用候选药物处理的细胞相 比有所降低，则表明所述候选药物可用作治疗胆固醇代谢异常相关疾病的药物。
9. 权利要求l-5中任一项所述的TNFa剌激应答序列在筛选通过结合所述TNF a剌激应答序列来抑制ACATl基因表达从而治疗与胆固醇代谢异常相关的疾病的药物中的用途。
10. 如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述胆固醇代谢异常相关的疾病选自动 脉粥样硬化、高胆固醇血症或老年性痴呆症。
全文摘要
本发明涉及炎症因子TNFα刺激人ACAT1基因表达。具体而言，本发明涉及一种TNFα刺激应答序列，其具有SEQ ID NO3所示的序列，即5′-CCTGGCAACCTGGGGACCACCA-3′。本发明还进一步涉及包含本发明序列的构建细胞、该序列在药物筛选中的用途、筛选药物的方法以及包含筛选所得药物的药物组合物。本发明为胆固醇代谢异常疾病提供更为直接的筛药靶标，为深入阐明有关胆固醇代谢平衡生理功能与病理变化机理、临床、药物研究等提供了重要基础。
文档编号C12N15/11GK101787365SQ20091004583
公开日2010年7月28日 申请日期2009年1月23日 优先权日2009年1月23日
发明者宋保亮, 李伯良, 杨新颖, 熊缨, 陈佳, 雷磊 申请人:中国科学院上海生命科学研究院