专利名称：抗炎症因子制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗炎症因子的制备及应用，尤其涉及一种通过免疫接种乳牛产生高敏感免疫状态并从其分泌的牛奶中制备抗炎症因子的方法及应用。
发明技术背景炎症是机体局部组织对伤害或损伤引发的保护性反应，其特征是局部组织出现典型的疼痛、发热、潮红、肿胀以及局部组织功能障碍，主要是由于局部血流增快、血管扩张，血管通透性增高，组织液渗透增加，白细胞聚集所引起，与局部炎症因子如组织胺、五羟色胺分泌增加有关。炎症本身是一种防御反应，可以促进创伤修复，但过于剧烈的炎症反应却可引起机体不舒适、疼痛、功能障碍，甚至会造成局部组织的病理损害，因此降低局部组织炎症反应是临床症状治疗的重要课题，而用于减低局部炎症因子的药物称之为抗炎症药物，常用于治疗不同疾病所引起的炎症反应。
抗炎症药物、镇痛药、退热药是由多类物质混杂的药物，化学结构不一样，作用及付反应也各不相同，肾上腺皮质激素类药物，例如醋酸可的松是最广泛应用的抗炎药物，旦白分解酶代表另一类具有抗炎症作用的药物，水杨酸类药物如阿司匹林也是常规应用的抗炎症药物之一。这些药物虽然有效，但明显的负作用影响了进一步的应用。众所周知，长期服用肾上腺皮质激素类药物会引起多种严重负作用，如向心性肥胖、多毛症、免疫功能减退、血压升高、水钠潴留等，极易引发微生物继发感染，并且感染不易控制。长期服用水杨酸类抗炎药物同样会引发各种并发症，如胃肠道不适、胃溃疡、胃炎，以及体内酸碱平衡失调、出血倾向等多种负作用。
因此，研制一种天然成份组成，有抑制炎症反应作用，但是却无毒付作用的抗炎制剂是十分必需的。
现代研究证实在高敏感免疫状态的动物体内存在一种能有效抑制炎症反应的抗炎症因子，而通过免疫接种乳牛可以诱发牛产生高敏感免疫状态，高敏感免疫状态乳牛血清中的抗炎症因子会转移至牛奶中。
美国专利(4324782)公布的技术中，介绍了一种方法，通过用变异链球菌灭活疫苗免疫接种乳牛，从其分泌的牛奶中制备出的抗体能抑制龋齿的形成。美国专利(4636384)公布的技术中，介绍了采用单独或复合细菌疫苗接种乳牛可以诱发高敏感免疫状态，其分泌的牛奶中含有可改善心血管功能的有效成分。
本发明所要解决的技术问题是，从天然食品成分中制备一种能有效抑制炎症反应，并长期服用无毒负作用的抗炎症因子。
发明内容
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案，其特征是，选择合适的抗原或抗原组合，制备单价或多价复合抗原疫苗，免疫接种经选择的健康乳牛，监测接种乳牛血清以确定其已进入高敏感免疫状态，重复追加接种足够剂量的疫苗以维持其高敏感免疫状态，测试免疫牛奶中抗炎症因子，从收集的牛奶中通过分离提纯的程序制备高纯度的抗炎症因子。
本发明的技术特征是，单独的抗原或者复合抗原都可以被用作制备接种乳牛的疫苗，抗原类型可以是细菌、病毒、孢子体、螺旋体等微生物或其他物质，只要该抗原可以引发接种的乳牛进入高敏感免疫状态。最适宜的抗原类型是细菌，最好是采用多价抗原形式的灭活细菌疫苗。
本发明的技术特征是，选择的免疫接种对象可以是乳牛或乳羊，最好是健康乳牛，接种方式可以是皮下注射、皮内注射、静脉注射、腹膜内注射、乳房内注射、口服、灌肠、肌肉注射等，只要该接种形式能使接种动物致敏，最好的接种方式是肌肉注射，如果肌肉注射不能引发高敏感免疫状态，可以同时采用静脉注射或乳房内注射联合接种，以诱发接种动物进入高敏感免疫状态。接种的剂量要足够，剂量范围从1，times，10，sup.6cells到1.times.10.sup.8cells。
本发明的技术特征是，制备相对高纯度抗炎症因子制剂的方法是，对收集的牛奶采用离心方式脱脂，用酸剂调整牛奶PH至4.5～4.9，最好4.7～4.8，加热30℃～50℃，最好40℃，加热时间20分钟～40分钟，最好30分钟，再降温至4℃静置过夜，用滤布过滤器，最好是尼龙滤布过滤器滤除凝集的酪旦白后，直接喷雾干燥，或加碱剂，调整PH至6.8～7.0后喷雾干燥成干粉，或者在加热后直接用离心机离心沉淀酪旦白，离心时间15分钟～45分钟，最好30分钟，离心速度3000～6000转/分，最好5000转/分，离心沉淀去除酪旦白后，上清液直接喷雾干燥，或调整PH至6.8～7.0后喷雾干燥成粉，喷雾干燥时温度不能超过140°F。
本发明的技术特征是，制备较高纯度抗炎症因子的方法是，收集的牛奶用离心方式脱脂，脱脂牛奶采用分子量为10,000的超微滤膜进行分离过滤，收集分子量＜10,000的上清液，直接喷雾干燥(温度＜140°F)制备干粉，或者冷冻抽干制备干粉，也可以在脱脂程序后，以1∶3生理盐水稀释扩容后采用交错切面流体超滤装置，采用10,000分子量的超微滤膜分离过滤，收集上清液，用同样设备但采用脱水浓缩程序后冷冻干燥制备干粉。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的抗炎症因子，既可以单独应用，也可以与其他抗炎症反应的有效成份联合使用，以发挥更强大的协同作用，其施用方法可以是直接服用牛奶、奶粉或高纯度抗炎症因子制剂，也可以与其他药用辅料制备成片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、冲剂、油剂、乳剂、含片等多种形式服用，还可以作为食品添加剂加工成食品食用。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的抗炎症因子制剂可以用来预防和治疗任何疾病和创伤引起的炎症反应，包括但不限于风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、急性或亚急性滑囊炎、非特异性腱鞘炎、风湿性心肌炎、天疱疮、大泡性皮肤炎、严重红斑、系统性皮肌炎、多发性脱落性皮炎、肝硬化、季节持续性皮炎、支气管哮喘、接触性皮炎、血清病、过敏性结肠炎、角膜炎、带状疱疹、虹膜炎、扩散性葡萄膜炎、视神经炎、系统性肉瘤病、溶血性贫血等，本发明方法制备的抗炎症因子制剂也可以用于减轻某些疾病的症状，包括但不限于白血病、淋巴瘤、结核病和脑膜炎等。
本发明的技术特征是，应该监测接种乳牛是否对抗原敏感，以及是否已进入高敏感免疫状态。有很多已知的方法可以检测这种敏感性，其中包括皮肤敏感性试验、测定血清中特异性抗体滴度，最好的方法是分别测试乳牛接种前后血清对多价抗原复合疫苗产生的抗体凝集反应，如果在接种后出现特异性抗体凝集反应，则证实已经进入高敏感免疫状态。
本发明的技术特征是，乳牛在首次免疫接种诱发高敏感免疫状态后，应该重复追加接种注射，以维持这种已诱发的高敏感免疫状态，重复注射应维持足够的剂量，至少应等于首次接种剂量，必要时可加大剂量，但不超过初始剂量的150％，重复接种的时间和次数取决于抗原的选择及组合，通常是每两周重复注射一次，一般可重复注射4～6次，但在这期间至少每两周监测一次血清抗体凝集反应，如果接种乳牛出现免疫耐受现象，则应停止使用该乳牛的牛奶作为原料制备抗炎症因子。
本发明的技术特征是，在从牛奶中制备抗炎症因子前，应测试牛奶中抗炎症因子的特性，可以采用“鼠掌角叉菜胶诱发水肿试验”[Winter C.A.et al“Carrageenin InducedOedema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Ant i-Inflammatory Drugs”Proc.Soc.Exp.Biol.Med.111544-547，(1962)]，这种方法是最简单和最直接的测试方法，是用于测试抗炎药物的标准方法，已经被公认对抗炎症药物有高度敏感性，这个方法是在白鼠前脚掌注射少量角叉菜胶以诱发炎症反应，数小时后鼠掌会肿胀，可以通过重量或容积测试方法检测鼠掌的肿胀程度，抗炎症药物能有效阻止其炎症反应。
本发明的技术特征是，收集致敏乳牛分泌的牛奶制备抗炎症因子，视所需要的纯度可以采用多种制备方式，牛奶脱脂后可以制备含抗炎症因子的牛奶或直接制备奶粉，在此处理过程中，应注意抗炎症因子的热敏感特性，任何处理工艺中温度均不能超过140°F，采用巴氏消毒法时，温度也不应超过140°F。直接喷雾干燥可制备富含抗炎症因子的奶粉，喷雾干燥过程中的温度也不应超过140°F。制备的奶粉可以直接服用，也可以添加到其他食品中联合应用。应用于抗炎症反应的用途时，服用剂量可以从100ml～10L/天，最好在0.5L/天。
本发明的有益效果是，采用天然成份作为抗炎症因子不仅可以有效抑制炎症，还能避免其他抗炎症药物的毒负作用，与现有技术相比，更适合慢性炎症患者长期服用。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明实施例1免疫接种及抗体滴度检测选用大肠杆菌(Escherichia Coli，American Type Culture StrainNo.13076)，用标准细菌培养基在37℃温度下培养48小时，60℃持续2小时灭活细菌，离心收集细菌，用双蒸馏水冲洗五次，用生理盐水稀释成最终浓度为4.times.10.sup.8cells，选择健康乳牛，在臀部肌肉注射5ml，然后每周注射一次，连续注射四周，共注射5次，在第五周未，收集接种乳牛的牛奶，采用抗体凝集反应测定抗大肠杆菌抗体，以未免疫注射前的乳牛的牛奶作为对照，表1为检测结果。
表1免疫接种前后牛奶抗大肠杆菌滴度对比免疫接种前 免疫接种后05,000表1结果显示，在免疫接种后抗大肠杆菌抗体滴度显著升高，证明免疫接种诱发了高免疫敏感状态。
实施例2制备复合细菌疫苗从美国菌种培养中心(American Type Culture Collection)获得下列菌种金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus，ATCC#.11631)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis.155)、酿脓葡萄球菌1型(streptococcus pyogenes.Typel.8671)、3型(Type3.10389)、5型(type5.12347)、8型(Type8.12349)、12型(type12.11434)、14型(type14.12972)、18型(type18.12357)、22型(type22.10403)、产气杆菌(Aerobacteraerogenes.884)、大肠杆菌(Escherichia Coli.11126)、肠炎(沙门)杆菌(Salmonellaenteritidis 13076)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa 7700)、肺炎杆菌(KlebsiellaPneumoniae.9590)、鼠伤寒(沙门)杆菌(Salmonella typhimurium.13311)、出血杆菌(Haemophilus typhimurium.9333)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris 13315)、志贺痢疾杆菌(Shigella dysenteriae.13313)、肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae.6303)、变异链球菌(Strep.sanguinis10556)、小链球菌(Strep.Mitis.6249)、出血链球菌(Strep.Sanguinis.10556)、唾液链球菌(Strep.Salivarius.13419)、缺乳链球菌(Strep.Agalactiae.13813)。每种细菌接种按照规定，采用合适的培养液，在37℃恒温下培养48小时，观察培养是否正常，如果细菌在培养基中生长良好，用离心机分离培养液，细菌用无菌生理盐水冲洗五次，用60℃温度灭活2小时，杀死所有细菌，从已灭活的细菌中采集样本继续在培养基中培养(37℃下培养2小时)，确认无细菌存活，收集的细菌冷冻干燥成为细菌粉，上述每种粉称取1g，用500ml生理盐水混悬，并反复稀释，直至配制成浓度为2.times.10.sup.8bacterial cells/ml的溶液，(在660nm上显示1.0光密度单位)。
实施例3用复合疫苗免疫接种乳牛选择健康乳牛，用实施例1配制的复合细菌疫苗免疫接种乳牛，采用肌肉注射方式，在臀部肌肉注射5ml疫苗，每隔二周相同剂量追加注射一次，共重复追加五次，在第一次注射后5天，采集接种乳牛的牛奶，采用放射免疫法测定复合抗原的抗体滴度，并与未免疫接种前采集的牛奶进行对比，发现免疫接种后复合抗原的抗体滴度增加百倍，证明接种乳牛处于高敏感免疫状态。
实施例4制备抗炎症因子制剂收集20公升免疫接种乳牛的牛奶，用脂肪分离机去脂，脱脂奶用中空纤维分离器(分子量为10,000)分离过滤牛奶，流速在自动计量器上的读数为80，入口压力为30psi，出口压力为25psi，收集分离过滤液，直接送入冷冻干燥装置，制备为干粉。
实施例5测试抗炎症作用取实施例4制备的抗炎症因子制剂20mg溶解于生理盐水中，注射于已采用角叉菜胶注射液引发肿胀等炎症反应的小鼠前掌，每只前掌注射1％角叉菜胶溶液0.1ml，在注射抗炎症因子后两个小时测量前掌厚度，并与注射前相比较，结果显示抗炎症因子有明确的消除炎症作用。
权利要求
1.本发明涉及一种抗炎症因子的制备及应用，尤其涉及一种通过免疫接种乳牛产生高敏感免疫状态并从其分泌的牛奶中制备抗炎症因子的方法及应用，其特征是，选择合适的抗原或抗原组合，制备单价或多价复合抗原疫苗，免疫接种经选择的健康乳牛，监测接种乳牛血清以确定其已进入高敏感免疫状态，重复追加接种足够剂量的疫苗以维持其高敏感免疫状态，测试免疫牛奶中抗炎症因子，从收集的牛奶中通过分离提纯的程序制备高纯度的抗炎症因子。
2.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，单独的抗原或者复合抗原都可以被用作制备接种乳牛的疫苗，抗原类型可以是细菌、病毒、孢子体、螺旋体等微生物或其他物质，只要该抗原可以引发接种的乳牛进入高敏感免疫状态，最适宜的抗原类型是细菌，最好是采用多价抗原形式的灭活细菌疫苗。
3.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，选择的免疫接种对象可以是乳牛或乳羊，最好是健康乳牛，接种方式可以是皮下注射、皮内注射、静脉注射、腹膜内注射、乳房内注射、口服、灌肠、肌肉注射等，只要该接种形式能使接种动物致敏，最好的接种方式是肌肉注射，如果肌肉注射不能引发高敏感免疫状态，可以同时采用静脉注射或乳房内注射联合接种，以诱发接种动物进入高敏感免疫状态，接种的剂量要足够，剂量范围从1，times，10，sup.6 cells到1.times.10.sup.8cells。
4.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，应该监测接种乳牛是否对抗原敏感，以及是否已进入高敏感免疫状态，有很多已知的方法可以检测这种敏感性，其中包括皮肤敏感性试验、测定血清中特异性抗体滴度，最好的方法是分别测试乳牛接种前后血清对多价抗原复合疫苗产生的抗体凝集反应，如果在接种后出现特异性抗体凝集反应，则证实已经进入高敏感免疫状态。
5.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，乳牛在首次免疫接种诱发高敏感免疫状态后，应该重复追加接种注射，以维持这种已诱发的高敏感免疫状态，重复注射应维持足够的剂量，至少应等于首次接种剂量，必要时可加大剂量，但不超过初始剂量的50％，重复接种的时间和次数取决于抗原的选择及组合，通常是每两周重复注射一次，一般可重复注射4～6次，但在这期间至少每两周监测一次血清抗体凝集反应，如果接种乳牛出现免疫耐受现象，则应停止使用该乳牛的牛奶作为原料制备抗炎症因子。
6.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，收集致敏乳牛分泌的牛奶制备抗炎症因子，视所需要的纯度可以采用多种制备方式，牛奶脱脂后可以制备含抗炎症因子的牛奶或直接制备奶粉，在此处理过程中，应注意抗炎症因子的热敏感特性，任何处理工艺中温度均不能超过140°F，采用巴氏消毒法时，温度也不应超过140°F，直接喷雾干燥可制备富含抗炎症因子的奶粉，喷雾干燥过程中的温度也不应超过140°F，制备的奶粉可以直接服用，也可以添加到其他食品中联合应用，应用于抗炎症反应的用途时，服用剂量可以从100ml～10L/天，最好在0.5L/天。
7.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，制备相对高纯度抗炎症因子制剂的方法是，对收集的牛奶采用离心方式脱脂，用酸剂调整牛奶PH至4.5～4.9，最好4.7～4.8，加热30℃～50℃，最好40℃，加热时间20分钟～40分钟，最好30分钟，再降温至4℃静置过夜，用滤布过滤器，最好是尼龙滤布过滤器滤除凝集的酪旦白后，直接喷雾干燥，或加碱剂，调整PH至6.8～7.0后喷雾干燥成干粉，或者在加热后直接用离心机离心沉淀酪旦白，离心时间15分钟～45分钟，最好30分钟，离心速度3000～6000转/分，最好5000转/分，离心沉淀去除酪旦白后，上清液直接喷雾干燥，或调整PH至6.8～7.0后喷雾干燥成粉，喷雾干燥时温度不能超过140°F。
8.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，制备较高纯度抗炎症因子的方法是，收集的牛奶用离心方式脱脂，脱脂牛奶采用分子量为10,000的超微滤膜进行分离过滤，收集分子量＜10,000的上清液，直接喷雾干燥(温度＜140°F)制备干粉，或者冷冻抽干制备干粉，也可以在脱脂程序后，以1∶3生理盐水稀释扩容后采用交错切面流体超滤装置，采用10,000分子量的超微滤膜分离过滤，收集上清液，用同样设备但采用脱水浓缩程序后冷冻干燥制备干粉。
9.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，本发明方法制备的抗炎症因子，既可以单独应用，也可以与其他抗炎症反应的有效成份联合使用，以发挥更强大的协同作用，其施用方法可以是直接服用牛奶、奶粉或高纯度抗炎症因子制剂，也可以与其他药用辅料制备成片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、冲剂、油剂、乳剂、含片等多种形式服用，还可以作为食品添加剂加工成食品食用。
10.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，本发明方法制备的抗炎症因子制剂可以用来预防和治疗任何疾病和创伤引起的炎症反应，包括但不限于风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、急性或亚急性滑囊炎、非特异性腱鞘炎、风湿性心肌炎、天疱疮、大泡性皮肤炎、严重红斑、系统性皮肌炎、多发性脱落性皮炎、肝硬化、季节持续性皮炎、支气管哮喘、接触性皮炎、血清病、过敏性结肠炎、角膜炎、带状疱疹、虹膜炎、扩散性葡萄膜炎、视神经炎、系统性肉瘤病、溶血性贫血等，本发明方法制备的抗炎症因子制剂也可以用于减轻某些疾病的症状，包括但不限于白血病、淋巴瘤、结核病和脑膜炎等。
全文摘要
本发明涉及一种抗炎症因子的制备及应用，尤其涉及一种通过免疫接种乳牛产生高敏感免疫状态并从其分泌的牛奶中制备抗炎症因子的方法及应用，其特征是，选择合适的抗原或抗原组合，制备单价或多价复合抗原疫苗，免疫接种经选择的健康乳牛，监测接种乳牛血清以确定其已进入高敏感免疫状态，重复追加接种足够剂量的疫苗以维持其高敏感免疫状态，测试免疫牛奶中抗炎症因子，从收集的牛奶中通过分离提纯的程序制备高纯度的抗炎症因子。
文档编号A61P29/00GK1557468SQ20041001584
公开日2004年12月29日 申请日期2004年1月15日 优先权日2004年1月15日
发明者高春平 申请人:高春平