专利名称：一种胎盘因子及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种胎盘因子及其制备方法与应用。
背景技术：
移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)是造血干细胞移植后常见的合并症，是限制移植成功的主要障碍。当前所应用的免疫抑制剂(如糖皮质激素、FK506、环孢素A及骁悉等)以及去除移植物中T细胞的各种方法虽然可以减轻GVHD，但是上述这些方法却提高了机会性感染、白血病复发和移植失败的发生率，并且还伴随有药物毒副作用。因此，寻找控制GVHD的新方法一直是血液学界关注的重要问题，也是移植免疫学研究的热点与难点之一。
胎儿与母体是不同的个体但却能共存而不发生免疫排斥，这一现象提示我们胎盘中可能含有某种成分可以使胎儿和母体产生免疫耐受。国内学者以人胎盘组织为原料，从胎盘中提取了小分子的多肽类物质即胎盘因子(placenta factor，PF)。目前，PF的提取方法主要有两种。一是透析法胎盘剪碎，高速匀浆，经反复冻融(-30℃至40℃反复3次)、高速离心(3000r/min，25min)后，取上清液透析48小时，过滤除菌得到PF；二是超滤法胎盘剪碎，加2倍生理盐水，组织匀浆，经高速离心(8000r/min，20min)，取上清液进行超滤得到PF。理化性质研究发现PF外观呈微黄色透明液体，蛋白质定性反应呈阴性，是一种小分子多肽类物质的混合物，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实其分子量为3000-5000D。进一步的生物学活性研究发现，PF在体外可以促进T淋巴细胞表面绵羊红细胞受体的恢复、促进PHA诱导的T淋巴细胞增殖、促进淋巴细胞分泌IL-2及淋巴细胞表面IL-2受体的表达；动物体内实验亦发现PF可以增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能、增强NK细胞对肿瘤细胞K562的杀伤、增强PHA诱导的T淋巴细胞增殖能力。同时一些学者将其用于治疗恶性肿瘤、病毒性肝炎、支气管哮喘及变应性鼻炎等病也获得了良好的疗效。
发明内容
本发明的目的是提供一种胎盘因子及其制备方法。
本发明所提供的胎盘因子，可按照以下方法制备1)将胎盘剪碎，进行离心力为1770～2991.3g(10000～13000转/min)的组织匀浆，将得到的匀浆液置于25-40℃水浴中孵育0.5～2.5小时后，在4-10℃13.28～398.25g(800～1500转/min)离心20～40分钟，取上清液；
2)将步骤1)得到的上清液进行截留分子量为10KD的超滤，得到的超滤产物即为胎盘因子。
所述胎盘组织可在生理盐水中匀浆。
所述组织匀浆的离心力优选为2548.8g(12000转/min)。
所述匀浆液优选置于37℃水浴中孵育1小时。
所述匀浆液孵育后在4-10℃113.28g(800转/min)离心30分钟。
所述胎盘为人胎盘。
上述方法中，还包括将步骤2)得到的胎盘因子进行灭菌处理的步骤，如将超滤产物进行220μm孔径的过滤除菌。
本发明制备的PF外观呈微黄色透明液体，pH 6.5～7.5，蛋白质定性呈阴性，Bradford法测定多肽质量为5.7～6.9mg/g鲜重胎盘，SDS-PAGE法测定结果表明本发明制备的PF主要含有两种成分，分子量分别为9.187KD及4.794KD。
本发明的另一个目的是提供一种预防和/或治疗移植物排斥及移植物抗宿主病的药物。
本发明所提供的预防和/或治疗移植物排斥及移植物抗宿主病的药物，它的活性成分为本发明制备的胎盘因子。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。
所述预防和/或治疗移植物排斥及移植物抗宿主病的药物可通过注射方法导入机体。
在本发明的制备方法中，增加了37℃孵育的步骤，并降低了离心转速(由以往的高速离心(如8000转/分钟)降至800转/分钟)，这与以往的方法不同。本发明的PF外观呈微黄色透明液体，pH 6.5～7.5，蛋白质定性呈阴性，Bradford法测定多肽质量为5.7～6.9mg/g鲜重胎盘，这与以往文献报道相似。但SDS-PAGE显示本发明制备的PF主要含有两种成分，分子量分别为9.187KD及4.794KD，这与既往文献报道不同(以往报道的PF是分子量小于5KD的多肽混合物)。这可能是因为37℃孵育及低速离心更有利于保留PF中分子量较高的活性成分。另外通过对其生物学活性的研究，也证实本发明制备的PF具有与以往不同的生物学活性。其在体内体外对T淋巴细胞均具有强大的免疫抑制作用，PF体内应用后，并没有明显的T淋巴细胞去除作用，而是通过降低T细胞的增殖和活化能力、诱导CD4+CD25+调节性T细胞及CD8+CD28-抑制性T细胞的产生、调节Th1/Th2细胞因子的分泌等多种途径诱导机体免疫耐受，其作用强于传统的免疫抑制剂环孢素A。同时，PF可以提高体内NK细胞及NKT细胞的数量，并促进NK细胞在体外对肿瘤细胞的杀伤。随后，在小鼠异基因骨髓移植模型中，也进一步证实PF可以预防GVHD的发生、减轻GVHD的严重程度、降低移植小鼠的死亡率，另外PF体内应用还有助于移植小鼠供者造血细胞及淋巴细胞的植入，且上述作用均明显强于环孢素A。这些结果提示，PF在诱导免疫耐受的同时，不会影响移植后的免疫重建，并且可能通过提高NK细胞的杀伤活性，以及NK细胞和NKT细胞的数量来保留机体对病原体及肿瘤的抵抗力，同时还可以促进供者造血及淋巴细胞的植入，这将为提高临床器官移植及造血干细胞移植的效果提供新的途径。
本发明制备PF的方法，原料丰富，制备方法简单，稳定性好。本发明的胎盘因子是从人胎盘组织中提取的小分子多肽类物质，副作用小，使用安全，具有广泛的应用前景，可在器官移植及造血干细胞移植中用于预防和/或治疗移植物排斥及移植物抗宿主病(GVHD)。
图1为PF的SDS-PAGE电泳结果图2为PF对PHA诱导的淋巴细胞增殖的影响结果图3为PF对混合淋巴细胞反应的影响结果图4为PF对T细胞CD69表达的影响结果图5为PF对NK细胞杀伤肿瘤细胞的影响结果图6为PF对小鼠体重的影响结果图7为PF对小鼠外周血白细胞的影响结果图8为PF对ConA及异基因抗原诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响结果图9为PF对T细胞、CD4+及CD8+T细胞数量及CD4+/CD8+T细胞比值的影响结果图10为PF对小鼠脾脏T细胞及其各亚群CD28表达的影响结果图11为PF对小鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞和CD8+CD28-抑制性T细胞数量的影响结果图12为PF对小鼠脾脏NK细胞及NKT细胞数量的影响结果图13为PF对MLR培养上清中IFN-γ及IL-4的影响结果图14为骨髓移植后各组小鼠GVHD的发生率图15为骨髓移植后各组小鼠的生存曲线图16A为三组小鼠GVHD发生时间及发病例数的比较图16B为三组小鼠死亡时间及死亡例数的比较图17A为骨髓移植后各组小鼠体重的变化图17B为骨髓移植后各组小鼠外周血白细胞计数的变化图18为三组小鼠供者造血细胞及淋巴细胞的植入情况图19为三组小鼠肝脏及小肠病理改变的100倍HE染色照片具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、胎盘因子(placenta factor，PF)的制备材料为健康产妇胎盘。产妇产前行乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV、弓形虫及梅毒检测均为阴性者为健康产妇。
将新鲜胎盘去除筋膜血管，用生理盐水反复冲洗，以完全去除残留于间质中的血液，剪成1×1cm2大小的小块，加入是胎盘组织2倍体积的生理盐水进行高速匀浆(12000转/分钟，即2548.8g，3分钟/次，10次)，匀浆液置于37℃水浴中孵育1小时，然后4℃低速离心(800转/分钟，即113.28g)30分钟，将上清液置于AmiconUltra超滤管中(截留分子量10KD)，进行离心超滤，超滤后产物用Millipore滤器(220μm)过滤除菌分装，得到PF，4℃保存。并对所制备的PF进行理化性质的研究，结果如下(一)、蛋白质定性试验采用加热醋酸法及20％磺基水杨酸法进行蛋白质定性试验。结果表明PF外观呈微黄色透明液体，pH 6.5～7.5。加热醋酸法及20％磺基水杨酸法蛋白质定性为阴性。
(二)、多肽质量的测定(Bradford法)采用Bradford法进行多肽质量的测定配制不同浓度的蛋白质标准品，加入Bradford染液，充分混匀，室温放置2分钟，然后测定590nm波长处溶液的光密度值OD590nm。以蛋白质样品的浓度为纵坐标，光密度值为横坐标，绘出标准曲线。取待测样品500微升，用蒸馏水稀释成1ml，加入Bradford染液，按上述方法测定OD590nm。并从标准曲线上查出待测样品的浓度(即为多肽质量浓度)。多肽质量(mg/g)＝(多肽质量浓度×提取液总体积/测定时取样体积)/胎盘组织质量)。
以标准蛋白质样品(牛血清白蛋白，BSA)的OD590nm对标准蛋白质样品的质量浓度作图，得到回归方程，多肽质量浓度(y)＝-0.459+1.608OD590nm(x)，R3＝0.847，p＝0.001，根据待测蛋白质样品的OD590nm，按回归方程求出PF的多肽质量为5.70～6.86mg/g鲜重胎盘(6.28±0.58mg/g)。
(三)、各种组分分子量的测定应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)进行多肽分子量的测定。分离胶、间隙胶及浓缩胶分别为15.5％T(T代表丙烯酰胺浓度)6％C(C代表丙烯酰胺交联度)(内含6mol/mL尿素)，10％T 3％C及4％T 3％C。超低分子量蛋白质多肽标准分子量范围14.4KD-3.313KD。
SDS-PAGE电泳结果表明PF为一组小分子多肽的混合物，其主要含有两种成分(图1)。以超低分子量蛋白质多肽标准的迁移距离对超低分子量蛋白质多肽标准分子量的对数作图，得到回归方程，分子量对数(y)＝4.286-0.269(x)(迁移距离)，R2＝0.950，p＝0.025，根据待测蛋白质样品的迁移距离，在方程中求出PF各组分相对分子量分别为9.187KD及4.794KD；同时经回归方程计算出α-胸腺肽的分子量为3.158KD(理论值为3.108KD)。图1中，1.超低分子量蛋白质多肽标准(分子量范围为14.4KD至3.313KD)，2.α-胸腺肽，3.PF。
实施例2、本发明制备的PF的生物活性(一)、体外生物学活性研究1、对PHA诱导的淋巴细胞增殖的影响人外周血单个核细胞(PBMC)接种96孔板，加入终浓度10μg/ml的植物血凝素(PHA)和不同制剂。试验分三组不同稀释度的PF(1/1，1/2，1/4，1/6，1/8及1/10稀释)、不同浓度的环孢素A(cyclosporin A，CsA)(0.8，0.6，0.4，0.2，0.1及0.05mg/ml)及生理盐水(normal saline，NS)，同时设立培养基及未加PHA的对照孔。于37℃5％CO2孵箱中培育68小时，应用MTT法检测，并计算细胞生长抑制率(生长抑制率(％)＝1-(试验孔OD值/无刺激孔OD值)×100)。
结果如图2所示，表明PF对PHA诱导的淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用，呈剂量依赖关系，随PF稀释度增加，抑制作用逐渐减弱(各剂量组与NS组比较P＜0.0001)，其中1/1、1/2及1/4三个剂量组与CsA组比较P＞0.05(分别为70.03％vs 67.91％，P＝0.401；67.80％ vs 67.23％，P＝0.744及59.33％ vs 67.34％，P＝0.104)。图2中，n＝10，*表示与NS组比较P＜0.05。上述结果表明，PF在体外抑制PHA诱导的T细胞增殖的作用与CsA相当。
2、对混合淋巴细胞反应的影响不同志愿者的PBMC分别作为反应细胞和刺激细胞，刺激细胞以丝裂霉素C(终浓度60μg/ml)处理，将反应细胞与刺激细胞按1∶1比例接种96孔板，加入不同制剂。分组情况同步骤1，并设立单纯反应细胞、单纯刺激细胞及单纯培养基的对照孔。于37℃5％CO2孵箱中培育6天，应用MTT法检测，并计算细胞生长抑制率(同步骤1)。
结果如图3所示，表明PF对混合淋巴细胞反应也具有显著的抑制作用，亦呈剂量依赖关系，随PF稀释度增加，抑制作用逐渐减弱(各剂量组与NS组比较P＜0.0001)。其中1/1、1/2、1/4及1/6四个剂量组与CsA组比较P＞0.05(分别为78.90％ vs 72.96％，P＝0.708；78.70％ vs 73.43％，P＝0.599；73.04％ vs 73.54％，P＝1.000及66.02％ vs 74.25％，P＝0.469)。图3中，n＝10，*表示与NS组比较P＜0.05。上述结果表明，PF在体外抑制混合淋巴细胞反应的作用与CsA相当。
3、佛波酯(PMA)+离子霉素刺激后T细胞活化抗原CD69表达的影响PBMC接种24孔板，每孔加入PMA(终浓度200ng/ml)、离子霉素(终浓度2μg/ml)及不同制剂。分组情况同步骤1，并设立阴性对照孔。于37℃5％CO2孵箱中培育16-18个小时，按说明书标记抗体(阴性对照加入抗人CD3-FITC及同型对照-PE；其余各标本加入抗人CD3-FITC及抗人CD69-PE)，应用流式细胞仪检测CD3+细胞CD69的表达。CD69的表达情况以CD69+CD3+细胞在CD3+细胞中的百分比表示。
结果如图4所示，表明PF对PMA+离子霉素刺激后T细胞活化抗原CD69的表达具有明显的下调作用，呈剂量依赖关系，随PF稀释度增加，作用逐渐减弱(PF各剂量组与NS组比较均P＜0.05)。其中1/1、1/2及1/4三个剂量组CD69表达率低于或等于CsA组(分别为19.58％vs 39.53％，P＝0.002；35.53％vs 39.75％，P＝0.394及46.64％ vs 39.70％，P＝0.230)。图4中n＝8，*表示PF与NS组比较P＜0.05；#表示PF与CsA组比较P＜0.05。上述结果表明，PF及CsA在体外均可抑制T细胞活化(PF vs CsA，P＞0.05)。
4、对NK细胞杀伤肿瘤细胞的杀伤活性的影响PBMC接种24孔板为效应细胞，加入不同制剂。试验分三组不同稀释度的PF(1/1，1/2，1/4，1/6，1/8及1/10)、不同浓度的CsA(0.2，0.1及0.05mg/ml)及生理盐水(normal saline，NS)。37℃5％CO2孵箱培育12小时，取出效应细胞，重新计数接种96孔板。K562细胞株，接种96孔板作为靶细胞，效靶比20∶1。并设立效应细胞自发释放孔、靶细胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔、体积校正释放孔及培养基空白对照孔。其余步骤按说明书进行，酶标仪检测OD490。并计算细胞杀伤率。
杀伤率(％)＝(A-B-C)/(D-C)×100。
A＝试验孔OD值-空白对照孔OD值B＝效应细胞自发释放孔OD值-空白对照孔OD值C＝靶细胞自发释放孔OD值-空白对照孔OD值D＝靶细胞最大释放孔OD值-体积校正孔OD值。
结果如图5所示，表明PF组NK细胞杀伤率均高于或等于NS组，其中1/4、1/6及1/8三个剂量组NK细胞杀伤率高于NS组(分别为32.32％vs 15.23％，P＝0.000；22.73％vs15.23％，P＝0.011及21.30％ vs 15.23％，P＝0.038)；而1/1、1/2及1/10三个剂量组NK细胞杀伤率与NS组比较差异无统计学意义(分别为14.80％vs 15.23％，P＝0.880；16.48％vs 15.23％，P＝0.663及18.96％ vs 15.23％，P＝0.199)。而CsA组明显低于NS组(分别为5.02％ vs 15.23％，P＝0.000；6.69％ vs 15.23％，P＝0.004；7.88％vs 15.23％，P＝0.013)。上述结果表明，与CsA不同，PF体外应用并不影响、甚至可以促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。
(二)、体内生物学活性研究Balb/c小鼠，随机分为三组，每组12只。分别腹腔注射PF(20ml/kg.d)、CsA(30mg/kg.d)及NS(0.4ml/只/天)，连续14天，第15天处死小鼠。进行以下生物活性检测1、PF对小鼠体重及外周血白细胞计数的影响隔日监测各组小鼠的体重及外周血白细胞计数。体重的变化结果如图6所示，表明PF体内应用对小鼠体重无明显影响，该组小鼠体重一直波动于20g；而CsA体内应用后引起小鼠体重下降、小鼠进食减少、活动减少及精神变差。外周血白细胞的变化结果如图7所示，表明PF及CsA体内应用均对小鼠外周血白细胞计数无明显影响。图6和图7中，n＝12。
2、PF对ConA诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响小鼠脱颈椎处死，分离脾脏，于玻璃匀浆器内研磨脾脏，制成脾细胞悬液，用溶血素溶解红细胞，调整浓度为1×106个/ml备用。
脾细胞接种96孔板，加入终浓度为4μg/ml的ConA，并设立单纯培养基及未加ConA的对照孔。37℃5％CO2孵箱培育68小时，MTT法检测，计算刺激指数(SI)(SI＝试验孔OD值/NS组无刺激孔OD值)。
PF对ConA诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响结果如图8所示，表明静止状态下，PF组小鼠脾脏淋巴细胞OD570nm低于NS组(0.384 vs 0.583，p＝0.001)及CsA组(0.384 vs 0.424，p＝0.408)。而在ConA刺激后，PF组刺激指数低于NS组(0.890vs 2.139，p＝0.008)及CsA组(0.890 vs 1.312，p＝0.423)。上述结果说明，PF在体内抑制静止期及ConA诱导的脾脏淋巴细胞增殖活性的作用与CsA相当。图8中，n＝12；静止期细胞增殖活性以OD570表示；ConA及异基因抗原诱导的细胞增殖活性以刺激指数(SI)表示；*表示与NS组比较P＜0.05。
3、PF对混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reactions，MLR)的影响Balb/c小鼠(H-2d)及C57BL/6小鼠(H-2b)脾细胞以1∶1比例接种96孔板，混匀。同时设立单纯反应细胞、单纯刺激细胞及单纯培养基对照孔。37℃ 5％CO2孵箱培育6天，MTT法检测，计算刺激指数(同步骤2)。结果如图8所示，表明PF组刺激指数低于NS组(0.586vs 1.651，p＝0.000)及CsA组(0.586vs 0.608，p＝0.801)，这些结果表明PF抑制由异基因抗原诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖的作用与CsA相当。图8中，n＝12；静止期细胞增殖活性以OD570表示；ConA及异基因抗原诱导的细胞增殖活性以刺激指数(SI)表示；*表示与NS组比较P＜0.05。
4、PF对T细胞及其各亚群、抑制性T细胞(CD4+CD25+及CD8+CD28-T细胞)、自然杀伤(NK)细胞及自然杀伤性T(NKT)细胞数量，T细胞表面共刺激分子CD28表达的影响采用荧光标记的特异性抗体，对脾细胞进行分析，取脾细胞，每管含细胞数2×106个/ml，按说明书分别加入CD3ε、CD4、CD8α、CD28、CD25、Pan-NK 1.1抗体，4℃避光30min，重悬细胞，即可上机检测，或用1％多聚甲醛固定，4℃保存，24h内检测。
PF对T细胞、CD4+及CD8+T细胞数量及CD4+/CD8+T细胞比值的影响结果如图9所示，表明用药后PF组T细胞、CD4+及CD8+T细胞数均明显高于CsA组(分别为43.88vs31.78，P＝0.004；29.06vs 18.97，P＝0.004；8.71vs 5.96，P＝0.026)，而与NS组无差异(P＞0.05)。PF组CD4+/CD8+T细胞比值也高于CsA及NS组(但P＞0.05)。结果表明，与CsA不同，PF在体内无T细胞去除作用，而是通过抑制T细胞的功能诱导机体免疫耐受。图9中，n＝12；#表示与CsA组比较P＜0.05。
PF对T细胞及其各亚群CD28表达的影响结果如图10所示，用药后PF组T细胞、CD4+T及CD8+T细胞表面CD28的表达均明显低于CsA及NS组(与CsA组比较分别为20.29vs27.16，P＝0.006；13.52 vs 18.58，P＝0.034；4.67 vs 8.52，P＝0.024。而与NS组比较分别为20.29 vs 30.46，P＝0.001；13.52 vs 20.05，P＝0.011；4.67vs 8.71，P＝0.017)。这一结果表明PF体内应用可以下调T细胞及其各亚群细胞共刺激分子的表达，从而诱导T细胞无能，作用强于CsA。图10中，n＝12；CD28的表达情况以CD28+细胞的绝对数量(×106个/l)表示；*表示PF与NS组比较P＜0.05；#表示PF与CsA组比较P＜0.05。
PF对CD8+CD28-抑制性T细胞及CD4+CD25+调节性T细胞数量的影响结果如图11所示，表明用药后PF组CD4+D25+调节性T细胞及CD8+D28-抑制性T细胞的数量均明显高于CsA组及NS组(PF组与NS组比较，CD4+CD25+T及CD8+CD28-T细胞数量分别为8.81vs4.95，P＝0.002；3.62vs 1.79，P＝0.026)，而CsA组则低于NS组(分别为2.83vs4.95，P＝0.052；1.43vs 1.79，P＝0.630)。这一结果表明，与GsA不同，PF在体内可以通过增加CD8+CD28-抑制性T细胞及CD4+CD25+调节性T细胞，诱导机体免疫耐受。图11中，n＝12；*表示PF与NS组比较P＜0.05；#表示PF与CsA组比较P＜0.05。
PF对NK细胞及NKT细胞数量的影响结果如图12所示，表明用药后PF组NK细胞及NKT细胞的数量均明显高于NS及CsA组(PF组与NS组比较，NK细胞及NKT细胞数量分别为4.8vs 2.08，P＝0.002；1.96 vs 0.81，P＝0.000)。CsA组NK细胞数量与NS组比较无明显差异(2.32 vs 2.08，P＝0.682)，但CsA组NKT细胞则明显低于NS组(0.41 vs 0.81，P＝0.000)。图12中，n＝12；*表示PF与NS组比较P＜0.05；#表示PF与CsA组比较P＜0.05。
5、MLR培养上清IL-4、IFN-γ水平的测定MLR第6天，离心取上清，应用BioSource公司小鼠细胞因子ELISA试剂盒检测IL-4及IFN-γ水平。结果如图13所示，表明用药后PF组IFN-γ水平是NS组的1/4(42.33pg/ml vs 179.86pg/ml，P＝0.000)，且低于CsA组(42.33pg/ml vs51.61pg/ml，P＝0.603)；而IL-4水平是NS组的2.5倍(110.8pg/ml vs 45.47pg/ml，P＝0.006)，且高于CsA组(110.8pg/ml vs 62.52pg/ml，P＝0.031)。结果表明，PF体内应用可以明显降低Th1型细胞因子的分泌(如IFN-γ)，而促进Th2型细胞因子的分泌(如IL-4)，使体内Th1型细胞向Th2型细胞偏移。图13中，n＝12；*表示与NS组比较P＜0.05；#表示与CsA组比较P＜0.05。
(三)、PF对小鼠异基因骨髓移植(allo-BMT)后移植物抗宿主病(GVHD)的影响实验方法如下1、移植前受鼠准备小鼠饲养于北京大学人民医院实验动物中心SPF级动物房内。于移植前7d开始饮用含庆大霉素(320U/L)和红霉素(250mg/L)的抗菌素溶液进行肠道准备，持续到移植后4周。移植前4-6h经60Co-γ射线全身照射(北京大学医学部辐照室)，照射源距照射平面150cm，照射总剂量8.0Gy，剂量率为2.967Gy/min，照射时间2分36秒。
2、移植分组将照射后的BaLB/C受鼠随机分为4组A、B、C和D组，除A组7只外，其他各组均22只。B、C及D组小鼠从移植当天开始分别腹腔注射不同制剂(PF、CsA及NS)，连续14天，注射剂量为PF(20ml/kg.d)、CsA(30mg/kg.d)及NS(0.4ml/只/天)。
A组(单纯照射组)照射后不行移植。
B组(PF移植组)回输供鼠骨髓和脾细胞，同时连续腹腔注射PF 14天。
C组(CsA移植组)回输供鼠骨髓和脾细胞，同时连续腹腔注射CsA 14天。
D组(NS对照组)回输供鼠骨髓和脾细胞，同时连续腹腔注射NS 14天。
3、供鼠骨髓细胞及脾脏细胞的分离供鼠脱颈椎处死，无菌剪取小鼠胫骨、股骨及脾脏。剪开干骺端，用装有RPMI1640液的注射器接七号针头反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔变白为止，收集骨髓细胞过四号针头，制成骨髓细胞悬液。取供鼠脾脏制成脾细胞悬液(方法同步骤二)。上述骨髓细胞及脾脏细胞以4％锥虫蓝染色法检测细胞活力≥95％，备用。
4、移植除单纯照射组外，其它各组每只受鼠，于照射后4-6小时经尾静脉输入含供鼠2×108个细胞/kg的骨髓细胞和2×108个细胞/kg的脾细胞的混合悬液0.4～0.5ml。骨髓细胞与脾细胞的比例为1∶1。
5、生存和死亡判断标准移植后2周内死亡且WBC＜0.5×109/L为造血衰竭。
WBC＞1.0×109/l，并具有倦怠、脱毛、翘毛、腹泻、体重减轻、弓背、甚至死亡，死亡小鼠肝脏及小肠符合GVHD病理学改变者为GVHD发生。
以生存大于60天为长期生存。
6、小鼠allo-BMT后观察指标(1)一般情况观察移植后小鼠体重、精神、体形、体位、毛发、有无腹泻等。并对各组小鼠进行GVHD评分，大于4分者可临床诊断为GVHD，大于6分者为重度GVHD。
(2)生存期及死亡除A组7只小鼠外，其余每组各16只用于生存期及死亡率观察(一直观察到移植后60天)，剩余小鼠做骨髓细胞及脾细胞嵌合体检测。
(3)造血功能移植后隔日各组小鼠断尾取血10μl，加入到稀释10倍的白细胞计数液中，观察各组外周血中白细胞恢复的情况。
(4)骨髓及脾细胞嵌合体的检测移植后第14、21天处死各组受鼠(各3只)，取骨髓及脾脏，分别制成骨髓细胞及脾脏细胞悬液，应用流式细胞术检测骨髓细胞、脾脏细胞中H-2Db阳性细胞的百分比，即可反应受鼠造血细胞及淋巴细胞的植入情况。
(5)GVHD的病理形态各组共观察60天，出现GVHD表现的小鼠濒死前均取肝脏、肠道组织，用体积分数为10％的甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察。长期存活的小鼠处死前取肝脏、肠道组织做病理观察。
实验结果如下1、移植后小鼠生存期、死亡率及GVHD发生情况的观察结果表明A组7只小鼠于照射后第4天开始死亡，12天内全部死亡，均死于造血衰竭，生存时间(8.143±1.056)天。
D组小鼠中11只于移植后第4天开始出现倦怠、活动明显减少、少食、耸毛、腹泻、体重下降及严重弓背等症状(GVHD评分为7.18±1.33)，余5只小鼠于移植后第6天出现上述症状。GVHD的中位发病时间为移植后第4天，移植后14天GVHD的发生率为100％(图14及表1)。D组小鼠于移植后第5天开始死亡，死亡的中位时间为8.5天，19天内全部死亡，生存时间(10.00±1.268)天(图15及表2)。
C组小鼠于移植后第6天开始出现以上症状(GVHD评分为6.07±0.83分)。GVHD的中位发病时间为6天，移植后14天GVHD的发生率为100％(见图14及表1)。C组小鼠于移植后第8天开始死亡，死亡的中位时间为14.5天，25天内全部死亡，生存时间(14.938±1.453)天，长于D组小鼠(14.94 vs 10.00，P＝0.015)，但却明显短于B组小鼠(14.94 vs 48.15，P＝0.000)(见图15及表2)。
B组16只小鼠有5只在移植后第8天出现轻微活动减少、体重下降、耸毛(GVHD评分为4分)，其中有2只在29天内死于GVHD(死亡时GVHD评分为6分，表现为体重下降、轻微活动减少、静息时弓背及耸毛)，另外3只在观察期一直存活，并随着时间推移，上述症状逐渐减轻消失。另有1只小鼠在移植后第26天出现上述症状(GVHD评分为4分)，并伴有轻度腹泻，于移植后第31天死亡(死亡时GVHD评分为5分)。其余有4只小鼠于30天后出现腹部轻度脱毛、体重下降、轻微活动减少、静息时弓背及耸毛现象，并分别于移植后第47、58、43及40天死亡(死亡时GVHD评分为4.75±1.26分)。B组小鼠GVHD的中位发病时间为46天，明显晚于C组及D组(P＜0.0001)。同时B组小鼠GVHD发病率也明显低于C及D组(P＜0.0001)，移植后14天GVHD的发生率为0，30天为18.7％，45天为39.1％，60天为49.2％(见表1及图14)。共有14/16只小鼠存活时间大于30天。6/9只小鼠生存期大于45天，2/5只小鼠生存期大于60天。用Kaplan-Meier评估四组小鼠的生存曲线可见B组小鼠较其它各组生存时间明显延长，平均生存时间为(48.145±3.382)天，与其它各组两两比较(A、C、D组)差异有显著性(P＜0.0001)。B组小鼠30天、45天及60天生存率均明显高于C组及D组(P＜0.0001)。其中30天生存率分别为87.5％、0％、0％，45天生存率分别为60.9％、0％、0％，60天生存率分别为30.5％、0％、0％(见表2及图15)。
B组GVHD评分明显低于D组(P＜0.0001)。其中，移植后7天为2.375 vs 7.00，P＝0.000；移植后14天为3.125 vs 8.111，P＝0.000；移植后21天为1.5 vs 8.5，P＝0.000。并且B组GVHD评分也明显低于C组(P＜0.01)，分别为移植后7天为2.375 vs 6.31，P＝0.000；移植后14天为3.125 vs 7.38，P＝0.000；移植后21天为1.5 vs 7.86，P＝0.000；移植后30天为1.875 vs 8.5，P＝0.001。而C组GVHD评分低于D组，但差异无统计学意义(见表3)。
图16A显示了三组小鼠出现GVHD临床表现的时间及例数，图中可见B组小鼠出现GVHD症状的时间明显晚于C组与D组，而C组小鼠出现GVHD的时间与D组无明显差异(三组小鼠GVHD的中位发病时间分别为46天 vs 6天 vs 4天)；并且B组小鼠发生GVHD的例数明显少于C组与D组(分别为7 vs 16 vs 16)。图16B显示了三组小鼠出现死亡的时间及死亡例数，图中可见B组小鼠死亡时间明显晚于C组与D组，而C组小鼠死亡时间与D组差异不明显(三组小鼠中位死亡时间分别为40天 vs 14.5天 vs 8.5天)；并且B组死亡小鼠例数明显少于C组与D组(分别为7 vs 16 vs 16)。图16A和图16B中，n＝16。
上述结果提示，PF体内应用可以明显减少异基因骨髓移植小鼠急性GVHD的发生及GVHD相关的死亡，并减轻受鼠GVHD的严重程度，延长受鼠生存期，提高总体生存率。并且上述作用均强于CsA(P＜0.01)。
图14中，n＝16；*表示与B组(PF移植组)与D组(NS移植组)比较P值；#表示B组与C组(CsA移植组)比较P值；&表示C组与D组比较P值。图15中A组为7只小鼠；其余各组均为16只小鼠。*表示与B组(PF移植组)与D组(NS移植组)比较P值；#表示B组与C组(CsA移植组)比较P值；&表示C组与D组比较P值。
表1.Allo-BMT后各组小鼠GVHD发生情况的比较(n＝16)
注*表示B组(PF移植组)与D组(NS移植组)比较P＜0.01，#表示B组与C组(CsA移植组)比较P＜0.01表2.Allo-BMT后各组小鼠生存情况比较
注*表示B组(PF移植组)与D组(NS移植组)比较P＜0.01，#表示B组与C组(CsA移植组)比较P＜0.01.
表3.Allo-BMT后各组小鼠GVHD评分的比较(n＝16)
注*表示B组(PF移植组)与D组(NS移植组)比较P＜0.01，#表示B组与C组(CsA移植组)比较P＜0.012、移植后各组小鼠体重变化及白细胞计数结果如图17A、图17B及表4所示，表明A组小鼠于移植后体重持续下降，外周血白细胞＜0.5×109/L，1周左右陆续死亡。
B组小鼠于移植后2天体重开始下降，由平均20.11g逐渐降至15.74g，从第10天开始又逐渐回升至20.7g。外周血白细胞从第2天开始下降，第4天达最低点0.3×109/L，之后逐渐回升至正常。从移植后第6天开始，B组小鼠外周血白细胞计数均高于C组及D组(P＜0.05)。这一结果提示，PF体内应用可以促进移植后小鼠的造血恢复。
C组小鼠于移植后第2天体重开始下降，14天左右降为最低(由平均的20.14g降至14.89g)，之后逐渐回升至15g左右。白细胞数从第2天开始下降，第4天达最低点0.35×109/L，以后逐渐回升至正常。从移植后第6天开始，C组小鼠外周血白细胞计数均高于D组(第6天2.06 vs 1.39，P＝0.01；第8天5.42 vs 3.34，P＝0.054；第14天10.13 vs 3.63，P＝0.042)。
D组小鼠体重于移植后第2天开始下降，第6天达最低点由平均19.95g降至14.47g，以后逐渐增加至17g左右。外周血白细胞第2天开始下降，第4天达最低点0.3×109/L，之后逐渐回升至正常水平。图17A、图17B及表4中n＝16，*表示B组(PF移植组)与D组(NS移植组)比较P＜0.05，#表示B组与C组(CsA移植组)比较P＜0.05。
表4.移植后各组小鼠外周血白细胞计数的比较(n＝16)。
注*表示B组(PF移植组)与D组(NS移植组)比较P＜0.05，#表示B组与C组(CsA移植组)比较P＜0.053、供体造血细胞植入情况分别在移植后14及21天用PE-H-2Db单克隆抗体检测骨髓及脾脏细胞中H-2Db+细胞的比例。实验结果如图18中A和B所示，移植后第14天B组小鼠骨髓细胞中H-2Db+细胞的比例明显高于C及D组(P＝0.000)(分别为91.55％ vs 68.9％ vs 65.13％)，C组与D组比较P＝0.004；而移植后第21天B组小鼠骨髓细胞中H-2Db+细胞的比例与C组比较无差异(99.08％ vs 98.6％，P＝0.379)。同时，实验亦发现，移植后第14天B组小鼠脾淋巴细胞中H-2Db+细胞的比例高于D组(P＝0.001)，但与C组比较无明显差异(P＝0.147)，分别为97.7％ vs 96.94％ vs 94.86％；而在移植后第21天B组小鼠脾淋巴细胞中H-2Db+细胞的比例与C组比较无明显差异(98.02％ vs 98.49％，P＝0.507)。上述结果提示，在移植后第21天供鼠造血细胞及淋巴细胞在受鼠体内成功植活，并且PF体内应用可以明显促进供者造血细胞及淋巴细胞的植入。图18中，n＝3，供者植入情况以H-2Db+细胞的百分比表示。*表示B组(PF移植组)与D组(NS移植组)比较P＜0.01；#表示B组(PF移植组)与C组(CsA移植组)比较P＜0.01。(注释因移植后第21天D组小鼠全部死亡，故无法检测D组小鼠的植入情况)。
4、病理学变化D组小鼠均出现GVHD临床表现，病理检查见多个脏器萎缩、颜色发黑，肝脾脏萎缩明显，肝脏表面可见点片状出血灶。病理切片示肝细胞肿胀、变性，肝细胞索紊乱，门静脉及中央静脉明显扩张、淤血，肝血窦及中央汇管区内有大量淋巴细胞浸润，肝内胆管上皮细胞凋亡，大量淋巴细胞浸润(图19中a)；小肠绒毛坏死脱落，隐窝结构破坏消失，隐窝处可见许多凋亡小体及坏死细胞碎片，粘膜和粘膜下层明显水肿、充血，粘膜下层有大量淋巴细胞浸润(图19中b)。该组小鼠肝脏及小肠组织的病理改变程度较一致，均符合GVHD的诊断。
C组小鼠病理改变同D组。
B组小鼠病理改变仅为轻度炎性反应肝细胞轻度变性图19中c)。小肠粘膜完整，粘膜下轻度水肿，小肠有少量淋巴细胞浸润(图19中d)。
病理检查提示PF可以减轻GVHD所致的肝脏、肠道损伤.
总之，生物学活性研究证实，PF在体内体外对T淋巴细胞具有强大的免疫抑制作用。PF体内应用后，并没有明显的T淋巴细胞去除作用，而是通过降低T细胞的增殖和活化能力、诱导CD4+CD25+调节性T细胞及CD8+CD28-抑制性T细胞的产生、调节Th1/Th2细胞因子的分泌等多种途径诱导机体免疫耐受，其作用强于传统的免疫抑制剂环孢素A。同时，PF可以提高体内NK细胞及NKT细胞的数量，并促进NK细胞在体外对肿瘤细胞的杀伤。随后，在小鼠异基因骨髓移植模型中，也进一步证实PF可以预防GVHD的发生、减轻GVHD的严重程度、降低移植小鼠的死亡率，另外PF体内应用还有助于移植小鼠供者造血细胞及淋巴细胞的植入，且上述作用均明显强于环孢素A。这些结果提示，PF在诱导免疫耐受的同时，可能不会影响移植后的免疫重建，并且可能通过提高NK细胞的杀伤活性，以及NK细胞和NKT细胞的数量来保留机体对病原体及肿瘤的抵抗力，同时还可以促进供者造血及淋巴细胞的植入，这将为提高临床器官移植及造血干细胞移植的效果提供新的途径。
权利要求
1.一种制备胎盘因子的方法，包括以下步骤1)将胎盘剪碎，进行离心力为1770～2991.3g的组织匀浆，将得到的匀浆液置于25-40℃水浴中孵育0.5～2.5小时后，在4-10℃113.28～398.25g离心20～40分钟，取上清液；2)将步骤1)得到的上清液进行截留分子量为10KD的超滤，得到的超滤产物即为胎盘因子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述组织匀浆的离心力为2548.8g。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述匀浆液置于37℃水浴中孵育1小时。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述匀浆液孵育后在4-10℃113.28g离心30分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述胎盘为人胎盘。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中还包括将步骤2)得到的胎盘因子进行灭菌处理的步骤。
7.由权利要求1至6中任一权利要求所述的方法制备的胎盘因子。
8.根据权利要求7所述的胎盘因子，其特征在于所述胎盘因子主要含有两种多肽，分子量分别为9.187KD和4.794KD。
9.一种预防和/或治疗移植物排斥及移植物抗宿主病的药物，它的活性成分为权利要求7或8所述的胎盘因子。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于所述药物的剂型为针剂或粉针剂。
全文摘要
本发明公开了一种胎盘因子及其制备方法与应用。该胎盘因子可按照以下方法制备1)将胎盘剪碎，进行离心力为1770～2991.3g的组织匀浆，将得到的匀浆液置于25－40℃水浴中孵育0.5～2.5小时后，在4－10℃ 113.28～398.25g离心20～40分钟，取上清液；2)将步骤1)得到的上清液进行截留分子量为10KD的超滤，得到的超滤产物即为胎盘因子。本发明制备PF的方法，原料丰富，制备方法简单，稳定性好。本发明的胎盘因子是从人胎盘组织中提取的小分子多肽类物质，副作用小，使用安全，具有广泛的应用前景，可在器官移植及造血干细胞移植中用于预防和/或治疗移植物排斥及移植物抗宿主病(GVHD)。
文档编号A61K35/48GK1872333SQ20061007861
公开日2006年12月6日 申请日期2006年4月28日 优先权日2006年4月28日
发明者闫晨华, 陆道培 申请人:北京大学人民医院