载胎盘生长因子纳米粒及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开载胎盘生长因子纳米粒及其制备方法和应用。方法步骤：1内水相（含有胎盘生长因子的水溶液）分散在油相（含有聚乳酸聚羟基乙酸共聚物和有机溶剂的有机溶液）中形成初乳；有机溶剂的极性为4.0～6.0；内水相：油相为（1:3）～（1:10）；2初乳在外水相（含HLB值8～18的亲水性非离子表面活性剂的水溶液）中乳化形成复乳；油相：外水相为（1:3）～（1:6）；3复乳与扩散相（水或含有稳定剂的水溶液）混合，去除有机溶剂和稳定剂，冻干；外水相：扩散相为（1:5）～（1:15）。本发明的产品的缓释效果好，制备方法中减少蛋白变性，提高包封率，稳定性较好，有机溶剂可以不为二氯甲烷等溶剂，反应的毒性降低。
【专利说明】载胎盘生长因子纳米粒及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种载胎盘生长因子纳米粒及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI)是由于冠状动脉病变引发其 部分或完全性闭塞，供血急剧减少或中断，导致心肌因持久而严重的缺血缺氧而坏死的疾 病。急性心肌梗死发病急、并发症多、死亡率高，是一种常见的心血管疾病。急性心肌梗死 目前主要的治疗方法包括药物治疗、心脏移植、左心室植入式协助等。由于器官捐献配型的 局限性，植入左心室辅助装置造价昂贵过程复杂，药物治疗成为主要的治疗方法。一种新 型药物治疗方法是在心梗区注射胎盘生长因子（Placental growth factor, PLGF)，促进缺 血区域血管再生成，改善心肌功能恢复。直接心肌内注射，可以将药物精确传递至心肌梗死 区。其局限性是具有侵入性损伤。尽管胎盘生长因子在治疗急性心肌梗死方面表现出良好 的应用前景，但其最大的障碍就是活性成分无法长期存留在心梗区域发挥疗效。为了使药 物直接作用在心梗区域，外源性胎盘生长因子只能注射给药。目前普遍采用的方式是在术 中直视下，向梗死区心外膜下点状注射，但是点状注射的方式加上心肌收缩，容易导致药物 流失，同时胎盘生长因子是一种蛋白类药物，容易局部酶解。总之该方法恢复心功能效果不 甚理想。
[0003] 纳米给药系统物理、化学和生物学性能卓越，己经成为药物新剂型研究中非常活 跃的领域。它们可改变药物在体内的药动学特征，增加药物在靶器官的分布量，从而提高疗 效、减轻毒副作用，同时纳米粒比表面积大，有利于表面功能化修饰；粒径小，有利于更好地 渗透于细胞间隙，发挥微观靶向效应。
[0004] 目前已有 Binsalamah 等人（Binsalamah, Ziyad Mohammed, et al. ''Intramyocardial sustained delivery of placental growth factor using nanoparticles as a vehicle for delivery in the rat infarct model. ''International journal of nanomedicine6(2011) :2667.)采用静电交联法制备海藻酸盐-壳聚糖纳米粒， 用于包载胎盘生长因子，提高了胎盘生长因子的治疗作用。但这种方法采用亲水性载体能 够达到较高的包封率，但释药时长短，一般仅为5天左右。
[0005] 聚乳酸聚轻基乙酸共聚物（poly-lactide-co-glycolic acid, PLGA)是广泛应用 于蛋白多肽类药物缓控释体系的一种纳米载体材料。聚乳酸聚羟基乙酸共聚物具有良好 的生物相容性、生物可降解性，降解产物安全无毒，是食品和药物管理局（Food and Drug Administration, FDA)批准可用于人体的缓释材料。可根据单体比例的不同控制降解速度， 为实现药物的缓控释放提供可能。PLGA载体材料多用于包载香豆素-6、紫杉醇等疏水性药 物制备纳米粒、微球等达到较好的缓释效果，也有用于胰岛素等亲水性药物，但普遍包封率 较低，无法达到很好的药效。
[0006] 现有技术中尚不存在能同时实现缓释效果好和包封率高的载胎盘生长因子纳米 粒的制备方法，该现象极大的制约了胎盘生长因子在治疗急性心肌梗死方面的发展，该现 象亟待解决。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中载胎盘生长因子纳米粒的制备 方法不能同时实现缓释效果好和包封率高的缺陷，提供一种新的载胎盘生长因子纳米粒及 其制备方法和应用，该载胎盘生长因子纳米粒缓释效果好，包封率高，毒性低，可以向心肌 梗死区稳定、持续、有效地递送胎盘生长因子。
[0008] 本发明的目的之一是，提供一种载胎盘生长因子纳米粒的制备方法，其包括下述 步骤：
[0009] (1)将内水相分散在油相中形成初乳；其中，所述的内水相为含有胎盘生长因子 的水溶液；所述的油相为含有聚乳酸聚羟基乙酸共聚物和有机溶剂的有机溶液；所述的 有机溶剂为极性在4. 0?6. 0之间的半极性有机溶剂；所述的内水相与油相的体积比为 (1:3)?（1:10);
[0010] (2)将上述初乳在外水相中乳化，形成复乳；其中，所述的外水相为含有稳定剂的 水溶液；所述的稳定剂为HLB值8?18的亲水性非离子表面活性剂；所述的油相与外水相 的体积比为（1:3)?（1:6);
[0011] (3)将上述复乳与扩散相混合，去除有机溶剂和稳定剂，得待冻干溶液，冻干， 即可；所述的扩散相为水或含有稳定剂的水溶液；所述的外水相与扩散相的体积比为 (1:5)?（1:15)。
[0012] 本发明中，所述的HLB值（Hydrophilic Lipophilic Balance)为表面活性剂的亲 水亲油平衡值，用于表示表面活性剂分子中亲水基和亲油基之间的大小和力量平衡程度。
[0013] 步骤（1)中，所述的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物为本领域常规的聚乳酸聚羟基乙酸 共聚物，所述的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的粘均分子量较佳的为10, 〇〇〇?100, 〇〇〇,更佳 的为60, 000。所述的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物中乳酸、羟基乙酸嵌段比例为（50/50)? (85/15)，所述的乳酸、羟基乙酸嵌段比为乳酸嵌段和羟基乙酸嵌段的重量比。
[0014] 步骤（1)中，内水相中所述的胎盘生长因子的浓度为本领域常规浓度，较佳的为 0. 15?0. 30mg/mL，所述的浓度为胎盘生长因子的质量与内水相的体积比。
[0015] 较佳的，步骤（1)中，所述的胎盘生长因子为美国R&D公司的重组人源胎盘生长因 子。
[0016] 较佳的，步骤（1)中，所述的胎盘生长因子和聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的质量比为 (3:200)?（1:1500)。
[0017] 较佳的，步骤（1)中，所述的内水相还可以含有亲水性生理相容性高分子。所述的 亲水性生理相容性高分子较佳的为含多羟基的能稳定蛋白的多糖类物质、含多羟基的能稳 定蛋白的聚氨基酸类物质、聚丙烯酸和聚乙二醇中的一种或多种。所述的含多羟基的能稳 定蛋白的多糖类物质较佳的为肝素、壳聚糖和透明质酸中的一种或多种。所述的含多羟基 的能稳定蛋白的聚氨基酸类物质较佳的为聚谷氨酸。
[0018] 内水相中，所述的生理相容性高分子的浓度为本领域常规浓度，较佳的，所述的生 理相容性高分子的浓度为1%?5%，所述百分比为生理相容性高分子占内水相的重量百分 比。
[0019] 步骤（1)中，所述的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的浓度为本领域常规浓度，较佳的为 5?50mg/mL，更佳的为10?40mg/mL，所述的浓度为聚乳酸聚轻基乙酸共聚物的质量与有 机溶液的体积比。
[0020] 步骤（1)中，所述的有机溶剂较佳的为乙酸乙酯、乙醇和丙酮中的一种或多种。
[0021] 步骤（1)中所述的分散的方法为本领域常规方法；所述的分散较佳的为机械分 散，更佳的为超声分散。较佳的，所述的超声分散的功率为200W，所述的超声分散的时间为 1 ?2min〇
[0022] 步骤（1)中，所述的内水相与油相的体积比较佳的为（1:4)?（1:6)，更佳的为 1:5。
[0023] 本发明中，步骤（1)后，制备得到油包水（W1/0)型乳液。
[0024] 步骤（2)中，所述的稳定剂为本领域常规的稳定剂；所述的稳定剂较佳的为普 朗尼克、聚乙烯醇和吐温80中的一种或多种；更佳的，所述的聚乙烯醇的分子量范围为 13000 ?23000。
[0025] 步骤（2)中，所述的外水相中稳定剂的浓度为本领域常规的浓度，所述的外水相中 稳定剂的浓度较佳的为15%?20%，所述百分比为稳定剂占外水相的重量百分比。
[0026] 步骤（2)中，所述的乳化的方法为本领域常规方法；较佳的，所述的乳化的方法 为高速剪切乳化或高压乳匀。所述的高速剪切乳化较佳的使用分散乳化机。所述的高速 剪切乳化较佳的在冰浴条件下进行。所述的高速剪切乳化的剪切速度较佳的为10000? 30000rpm，更佳的为llOOOrpm。所述的高速剪切乳化的时间较佳的为0. 5?3min。
[0027] 本发明中，步骤（2)后，制备得到水包油包水（W1/0/W2)型复乳。
[0028] 较佳的，步骤（3)中，所述的含有稳定剂的水溶液中的稳定剂的浓度为2%以下，但 不为〇,所述百分比为稳定剂占扩散相的重量百分比。
[0029] 步骤（3)中，所述的有机溶剂的去除方法为本领域常规方法；较佳的，所述的有机 溶剂的去除方法为磁力搅拌挥干或真空旋转蒸发。所述的磁力搅拌挥干的转速较佳的为 lOOrpm?500rpm，所述的磁力搅拌挥干的时间较佳的为6h?12h。所述的真空旋转蒸发的 时间较佳的为3h?6h。
[0030] 步骤（3)中，所述的稳定剂的去除方法为本领域常规方法，较佳的，所述的稳定剂 的去除方法为高速离心。所述的离心的速度较佳的为3000?8000rpm，更佳的为6000rpm ; 所述的离心的时间较佳的为3?lOmin，更佳的为8min。
[0031] 步骤（3)中，所述的冻干的方法为本领域常规方法，较佳的，所述的冻干的方法为 直接冻干或与支架剂混合后冻干。
[0032] 本发明中，所述的支架剂为一种药物辅料，所述的支架剂为本领域常规的支架剂， 较佳的，所述的支架剂为甘露醇、葡聚糖、乳糖和右旋糖苷中的一种或多种。所述的支架剂 的浓度为本领域常规浓度，较佳的为20?50mg/mL，所述浓度为支架剂的质量与待冻干溶 液的体积比。
[0033] 本发明的目的之二是，提供由上述载胎盘生长因子纳米粒的制备方法制得的载胎 盘生长因子纳米粒。
[0034] 较佳的，所述的载胎盘生长因子纳米粒的粒径为100?500nm。
[0035] 较佳的，所述的载胎盘生长因子纳米粒的包封率为30%?50%。
[0036] 本发明中，所述的包封率的计算公式为：
[0037]
【权利要求】
1. 一种载胎盘生长因子纳米粒的制备方法，其特征在于：其包括下述步骤： (1) 将内水相分散在油相中形成初乳；其中，所述的内水相为含有胎盘生长因子的水 溶液；所述的油相为含有聚乳酸聚羟基乙酸共聚物和有机溶剂的有机溶液；所述的有机溶 剂为极性在4. 0?6. 0之间的半极性有机溶剂；所述的内水相与油相的体积比为（1:3)? (1:10)； (2) 将上述初乳在外水相中乳化，形成复乳；其中，所述的外水相为含有稳定剂的水溶 液；所述的稳定剂为HLB值8?18的亲水性非离子表面活性剂；所述的油相与外水相的体 积比为（1:3)?（1:6); (3) 将上述复乳与扩散相混合，去除有机溶剂和稳定剂，得待冻干溶液，冻干，即可； 所述的扩散相为水或含有稳定剂的水溶液；所述的外水相与扩散相的体积比为（1:5)? (1:15)。
2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于： 步骤（1)中，所述的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的粘均分子量为10, 〇〇〇?100,000 ;所 述的聚乳酸聚羟基乙酸共聚物中乳酸、羟基乙酸嵌段比例为（50/50)?（85/15)，所述的乳 酸、羟基乙酸嵌段比为乳酸嵌段和羟基乙酸嵌段的重量比； 和/或，步骤（1)中，内水相中所述的胎盘生长因子的浓度为〇. 15?0. 30mg/mL，所述 的浓度为胎盘生长因子的质量与内水相的体积比； 和/或，步骤（1)中，所述的胎盘生长因子和聚乳酸聚羟基乙酸共聚物的质量比为 (3:200)?（1:1500)。
3. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1)中，所述的内水相还含有亲水 性生理相容性高分子； 所述的亲水性生理相容性高分子较佳的为含多羟基的能稳定蛋白的多糖类物质、含多 羟基的能稳定蛋白的聚氨基酸类物质、聚丙烯酸和聚乙二醇中的一种或多种；所述的含多 羟基的能稳定蛋白的多糖类物质较佳的为肝素、壳聚糖和透明质酸中的一种或多种；所述 的含多羟基的能稳定蛋白的聚氨基酸类物质较佳的为聚谷氨酸； 内水相中，所述的生理相容性高分子的浓度较佳的为1%?5%，所述百分比为生理相容 性商分子占内水相的重量百分比。
4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1)中，所述的聚乳酸聚羟基乙酸 共聚物的浓度为5?50mg/mL，较佳的为10?40mg/mL，所述的浓度为聚乳酸聚轻基乙酸共 聚物的质量与有机溶液的体积比； 和/或，步骤（1)中，所述的有机溶剂为乙酸乙酯、乙醇和丙酮中的一种或多种； 和/或，步骤（1)中所述的分散的方法为机械分散，较佳的为超声分散；较佳的，所述的 超声分散的功率为200W，所述的超声分散的时间为1?2min ; 和/或，步骤（1)中，所述的内水相与油相的体积比为（1:4)?（1:6)。
5. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2)中，所述的稳定剂为普朗尼克、 聚乙烯醇和吐温80中的一种或多种； 和/或，步骤（2)中，所述的外水相中稳定剂的浓度为15%?20%，所述百分比为稳定剂 占外水相的重量百分比； 和/或，步骤（2)中，所述的乳化为高速剪切乳化或高压乳匀；所述的高速剪切乳化较 佳的使用分散乳化机；所述的高速剪切乳化较佳的在冰浴条件下进行；所述的高速剪切乳 化的剪切速度较佳的为10000?30000rpm ;所述的高速剪切乳化的时间较佳的为0. 5? 3min〇
6. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3)中，所述的含有稳定剂的水溶 液中的稳定剂的浓度为2%以下，但不为0,所述百分比为稳定剂占扩散相的重量百分比。
7. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3)中，所述的有机溶剂的去除 方法为磁力搅拌挥干或真空旋转蒸发；所述的磁力搅拌挥干的转速较佳的为lOOrpm? 500rpm，所述的磁力搅拌挥干的时间较佳的为6h?12h ;所述的真空旋转蒸发的时间较佳 的为3h?6h ; 和/或，步骤（3)中，所述的稳定剂的去除方法为高速离心；所述的离心的速度较佳的 为3000?8000rpm ;所述的离心的时间较佳的为3?lOmin ; 和/或，步骤（3)中，所述的冻干的方法为直接冻干或与支架剂混合后冻干；较佳的，所 述的支架剂为甘露醇、葡聚糖、乳糖和右旋糖苷中的一种或多种；较佳的，所述的支架剂的 浓度为20?50mg/mL，所述浓度为支架剂的质量与待冻干溶液的体积比。
8. -种由权利要求1-7中任一项所述的载胎盘生长因子纳米粒的制备方法制得的载 胎盘生长因子纳米粒。
9. 如权利要求8所述的载胎盘生长因子纳米粒，其特征在于：所述的载胎盘生长因子 纳米粒的粒径为100?500nm，包封率为30%?50%。
10. 如权利要求8或9所述的载胎盘生长因子纳米粒在制备用于急性心肌梗死的药物 中的应用；较佳的，所述的载胎盘生长因子纳米粒的使用方法为：载胎盘生长因子纳米粒 采用生理盐水混悬后，向梗死区心外膜下点状注射。
【文档编号】A61K9/113GK104117056SQ201310157029
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2013年4月28日 优先权日:2013年4月28日
【发明者】何军, 连锋, 毛立丽, 路喆鑫, 刘洁, 卞玮, 潘伟祥 申请人:上海现代药物制剂工程研究中心有限公司, 上海交通大学医学院附属仁济医院