胎盘衍生的细胞凋亡因子的制作方法

专利名称：胎盘衍生的细胞凋亡因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种命名为胎盘衍生的细胞凋亡因子(PlacentaDerived Apoptotic Factor(PDAF))的新颖人类肿瘤-相关抗原及其基因。
背景技术：
许多癌症-特异性基因标记及肿瘤-相关抗原已被鉴定。且发现肿瘤相关抗原大部分为表达于肿瘤细胞(而不表达于非肿瘤组织的细胞)的表面分子。已鉴定出肿瘤-相关抗原为膜蛋白质，或为经修饰碳水化合物的醣蛋白质及醣脂质的分子。它们使得肿瘤细胞与正常细胞在免疫上得以区分，因而可作为人类癌症的诊断或治疗标的。
一些肿瘤-相关抗原已被揭示于先前文献。例如，Takeshi Watanabe等人，1999，Nature Medicine，Vol.5，No.8，第938-942页描述一种表达于SiSo细胞的受体-结合性癌抗原(RCAS1 i.e.，receptor-binding cancer antigen expressed on SiSo cells)，其具有作为肿瘤-相关抗原的功能。RCAS1基因不会表达于正常细胞，但可表达于子宫颈腺癌、子宫内膜腺癌、卵巢癌及子宫颈鳞状细胞癌(见Takeshi Watanabe等人，1996，American Cancer Society，第1501-1509页；以及Hitoo Nakano，1998，Clinical Cancer Research，vol.4，第1517-1520页)。此外，RCAS1基因亦可表达于食道鳞状细胞癌、胃腺癌、结肠腺癌及胰脏腺癌。RCAS1为包含213个氨基酸的蛋白质。该蛋白质具有N-端跨膜部份(8-27个氨基酸)及在C-端部分具有卷曲螺旋结构(179-206个氨基酸)，此表示RCAS1为第II型膜蛋白质或具有双体蛋白质结构的分泌蛋白质。RCAS1系作为配体，以推定受体存于各种人类细胞系，诸如K562(人类慢性骨髓源性白血病)、CCRF-CEM(人类T-淋巴球细胞瘤)及Ramos(Burkitt淋巴瘤)以及正常周围淋巴球，诸如T、B及NK细胞上。RCAS1可抑制受体-表达性细胞的生长并诱导细胞凋亡。肿瘤细胞可借着表达RCAS1而逃避免疫监督及在RCAS1受体-阳性免疫细胞中诱导细胞凋亡。RCAS1在肿瘤相关抗原及诱导免疫细胞的细胞凋亡上皆扮有作用。
发明人预期相似于肿瘤-相关RCAS1抗原的新颖肿瘤-相关抗原，及编码该抗原的核酸，能用于诊断、预防及治疗免疫疾病、细胞增殖及肿瘤，尤其是癌症。

发明内容
本发明的一目的是提供一种命名为胎盘衍生的细胞凋亡因子(PDAF)的新颖人类肿瘤-相关抗原，其包含SEQ ID NO1的氨基酸序列及其生物功能相等物。
本发明的一目的是提供一种多肽，其包含SEQ ID NO2的氨基酸序列及其生物功能相等物。
本发明的一目的为提供一种PDAF的片段，其包含SEQ ID NO3的氨基酸序列及其生物功能相等物。
本发明的另一目的为提供一种编码SEQ ID NO1的多肽的SEQ IDNO4的核酸及其简并序列。再者，本发明提供一种编码SEQID NO2的多肽的SEQID NO5的核酸及其简并序列；以及一种编码SEQ ID NO3的多肽的SEQ ID NO6的核酸及其简并序列。
本发明的另一目的为提供一种包含SEQ ID NO4的核酸的重组载体；一种包含SEQ ID NO5的核酸的重组载体；以及一种含有SEQ ID NO6的核酸的重组载体。此外，本发明亦提供一种含有SEQ ID NO4的核酸的宿主细胞；一种含有SEQ ID NO5的核酸的宿主细胞；以及一种含有SEQ ID NO6的核酸的宿主细胞。
本发明的另一目的为提供一种医药组合物，其包含本发明的PDAF及/或其片段。
本发明再一目的为提供一种转基因动物，其被导入含有SEQ IDNO4的核酸序列的基因片段，或含有SEQ ID NO5的核酸序列的基因片段，或含有SEQ ID NO6的核酸序列的基因片段。


图1A至1D显示PDAF的氨基酸序列(SEQ ID NO1)及其编码的核酸序列(SEQ ID NO4)。加框区为由PDAF蛋白质中的45个氨基酸组成的新颖多肽；阴影区为ATP-GTP结合位置区域；以及划线区为TM代表的跨膜区域及DIM代表的蜷曲螺旋结构及二聚区域。
图2A显示RCAS1及PDAF基因的限制图谱(restriction map)。
图2B显示RCAS1及PDAF基因经限制酶处理后的电泳结果。第1及5道为未切断样本；第2及6道为用EcoRI切断的样本；第3及7道为用BglII切断的样本；第4及8道为用ApoI切断的样本；M1为GeneRulerTM1kb DNALadder；以及M2为GeneRulerTM100bp DNA Ladder Plus。
图3显示PDAF的氨基酸185-213与PIG-B的氨基酸256-284(SEQ IDNO9)间的相似性。相同性为34％(10/29)及阳性为58％(17/29)。
图4显示PDAF的水亲和性分析。
图5显示在各种人类肿瘤细胞系中RCAS1及PDAF的表达。M100bpDNA标记；第1至5道样本分别为MCF细胞系、HT29细胞系、RD细胞系、A375细胞系及胎盘。
图6显示重组蛋白质GST-RCAS1、GST-PDAF、pET-PDAF.ECD及pET-RCAS1.ECD的表达。
图7显示用RCAS1、PDAF、RCASI.ECD及PDAF.ECD处理后的PBMC细胞系的细胞凋亡率。
图8显示用RCAS1、PDAF、RCAS1.ECD及PDAF.ECD处理后的未受刺激的天然(native)B细胞系的细胞凋亡率。
图9显示用RCAS1、PDAF、RCAS1.ECD及PDAF.ECD处理后的T细胞系的细胞凋亡率。
图10显示用RCAS1及PDAF处理后的杰凯特(Jurkat)细胞系的细胞凋亡率。
图11显示用RCAS1及PDAF处理后的TF-1细胞系的细胞凋亡率。
具体实施例方式
本发明特征为一种新颖肿瘤-相关抗原(此后称为PDAF)及其基因，发明人发现其与RCAS1具有相似性。令人惊异地发现，相较于RCAS1，本发明的PDAF可导致肿瘤细胞及免疫细胞呈现较高的细胞凋亡率。
定义在本文中，「核酸序列」一词是指肽核酸(PNA；The FASEB Journal，2000，14(1041-1060))及聚核苷酸诸如脱氧核醣核酸(DNA)及核醣核酸(RNA)。应了解该词包括相等物，自核苷酸类似物制得的RNA或DNA类似物，以及，优选具体实施方式
所使用者，包括单股及双股聚核苷酸。
在本文中，「氨基酸序列」一词是指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列；「氨基酸序列」及类似用词诸如「多肽」或「蛋白质」并非意欲将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整、天然氨基酸序列。氨基酸序列包括寡肽、肽、多肽、或蛋白质序列及其片段或部分，以及天然存在或合成的分子。
在本文中，「变体」一词是指改变一或多个氨基酸的氨基酸序列。该变体较常见可为「保守性」的改变，其中经取代氨基酸具有相似的结构或化学性质，例如以异亮氨酸取代亮氨酸。较罕见则是该变体可具有「非保守性」改变，例如以色氨酸取代甘氨酸。同样少部分的变体亦可包括氨基酸的删除或插入，或两者兼具。
在本文中，「删除」一词是指氨基酸或核苷酸序列的改变，其中分别缺乏一或多个氨基酸或核苷酸残基。
在本文中，「插入」或「添加」一词是指，与天然产的分子相较，氨基酸或核苷酸序列的改变分别是添加一或多个氨基酸或核苷酸残基。
在本文中，「衍生物」一词是指经化学修饰的核酸，其包括以烷基、酰基或胺基取代氢原子的核苷酸。该核酸衍生物可编码保有天然分子的必需生物特性的多肽。
在本文中，「生物功能相等物」一词是指蛋白质或多肽，其中特定氨基酸残基系经删除或以其它氨基酸残基取代、或该蛋白质或多肽系添加其它氨基酸残基，均不会实质影响该蛋白质或肽的功能(例如，治疗细胞增殖疾病或抑制免疫反应、抑制细胞的生长及分化及治疗癌症)，即便是有较少或较大程度的差异。
例如，本发明的多肽(即，SEQ ID NO1、2或3)的生物功能相等物可在氨基酸序列上具有一些改变，使得该氨基酸序列不同于，但实质上相同于，该多肽(即SEQ ID NO1、2或3)的氨基酸序列，且具有与此处所述的多肽基本上相同的性质，即便是有较少或较大程度的差异。
在本文中，「生物功能相等物的氨基酸序列不同于，但实质上相同于SEQ ID NO1、2或3的多肽的氨基酸序列」或其类似用语，是指该生物功能相等物的氨基酸序列实质上对应于SEQ ID NO1、2或3所列氨基酸序列的一部份，其中相对少数的氨基酸残基与SEQ ID NO1、2或3的氨基酸序列的对应位置上的氨基酸残基并不相同，但该生物功能相等物保留此处所述的SEQ ID NO1、2或3的多肽的性质，即便是有较少或较大程度的差异。
特定言之，「该生物功能相等物的氨基酸序列，其不同于但实质上相同于SEQ ID NO1、2或3的多肽的氨基酸序列」包括一种氨基酸序列，其中约70％至约80％，较佳约81％至约90％，更佳约91％至约99％的氨基酸残基相同于或相似于在SEQ ID NO1、2或3的氨基酸序列的对应位置上的残基，且一具有该氨基酸序列的多肽或蛋白质保留此处所述的SEQID NO1、2或3的多肽的性质，即便是有较少或较大程度的差异。
用于制备一多肽或蛋白质的生物功能相等物的方法，例如，是改变氨基酸序列，该方法为本领域所熟知，例如，基因工程技术，诸如，定点突变法，其是用以修饰核苷酸序列或氨基酸序列，以及重组蛋白质的表现。
在本文中，「重组蛋白质」一词是指编码目标多肽的一种(第一种)氨基酸序列与另一种(第二种)氨基酸序列的融合物，该另一种(第二种)氨基酸序列对目标蛋白质的任何区域(domain)而言为外来且并非实质上同源的区域(例如多肽部分)。
在本文中，「载体」一词是指一核酸分子，其可输送另一与其连接的核酸分子。优选载体的一类型为游离基因(episome)，即能进行染色体外复制的核酸。优选的载体为彼等可自动复制及表达其所连接的核酸者。将一段不相关外来的基因片段插入载体中，以构筑一「重组载体」。一般而言，在重组DNA技术中有用的重组载体通常为「质体」形式，该质体一般是指环状双股DNA环，在其为载体形式时不与染色体结合。
在本文中，「宿主细胞」一词是指可被载体(如质体)感染的宿主细胞。适合于本发明的宿主包括常用者及习用于现有技术者。
在本文中，「转基因动物」一词是指任何种类的动物，其中一或多种(优选为大体上所有)动物的细胞被导入外来基因。该外来基因是通过习知技术的基因操作(如显微注射或以重组载体感染)而导入该动物细胞的前驱细胞内，藉此直接或间接地将该外来基因导入动物细胞中。其中基因操作不仅包括传统的杂交或体外受精，亦包括重组DNA分子的导入，该重组DNA分子可被嵌合于染色体内或可为在染色体外复制的DNA等可由熟习此一技艺者可易于实施的技术。
多肽本发明的一目的是提供一种命名为胎盘衍生的细胞凋亡因子(PDAF)的多肽，其包含SEQ ID NO1(见图1A至1D)所示的氨基酸序列以及其生物功能相等物。
在本发明的具体实施方式
中，SEQ ID NO1的生物功能相等物为与SEQ ID NO1具至少80％，优选为90％，更优选为95％相似度的氨基酸序列。
PDAF是指得自任何物种(以人类为优选)或任何来源(无论是天然、合成、半合成或重组)的实质上经纯化PDAF的氨基酸序列。
根据本发明，PDAF包含258个氨基酸，其中PDAF的213个氨基酸与RCAS1完全相同。该由213个氨基酸组成的序列含有一跨膜区域及一卷曲-螺旋结构及双体区域。本发明的PDAF可诱导肿瘤细胞及免疫细胞的细胞凋亡。
本发明的另一目的为提供一种由45个氨基酸所组成的多肽(SEQ IDNO2)及其生物功能相等物。该45个氨基酸位于PDAF的位置175-219(见图1A至1D)。与RCAS1的序列相较，该45个氨基酸(SEQ ID NO2)系插入RCAS1的氨基酸174与175之间。该45个氨基酸的多肽序列在RCAS1的卷曲-螺旋功能性结构及双体区域前形成疏水区域。因此，该疏水区域可影响全部蛋白质的结构，所以推断PDAF较RCAS1具有增加生理功能的功效。此外，顷发现在SEQ ID NO2中位置210-217的氨基酸与一Ras蛋白质的ATP-GTP结合位置区域(motif)的序列相似。原-致癌基因Ras为各种类型细胞生长及分化所必需的基因。Ras为GTP结合蛋白质，可藉GTP水解控制讯息传导。在Ras基因的GTP结合位置中的单点突变占所有Ras突变的90％以上并存在于20％以上的所有固体肿瘤中。所以，对于癌症治疗而言，突变型Ras极有可能发展成为治疗的标的(见Journal ofImmunotherapy，1999，22(2)155-165以及The Journal of Urology，1999，1621519-1526)。基于上述，发明人可以合理预期包含GTP-ATP结合区域的SEQ ID NO2在细胞的生长及分化上扮演重要地位，且可被用于治疗及诊断疾病。
在本发明的具体实施方式
中，SEQ ID NO2的生物功能相等物为与SEQ ID NO2具至少80％，优选为90％，更优选为95％相似度的氨基酸序列。
本发明的一目的为提供一种由PDAF的位置175-258的氨基酸组成的多肽序列(SEQ ID NO3)及其生物功能相等物。SEQ ID NO3为主要诱导免疫细胞及肿瘤细胞细胞凋亡的功能性片段。在本发明的具体实施方式
中，SEQ ID NO3的生物功能相等物为与SEQ ID NO3具至少80％，优选为90％，更优选为95％相似度的氨基酸序列。
本发明的PDAF包括经改变序列或生物功能相等物的PDAF，其可通过前述定义的删除、插入、或氨基酸残基的取代而被修饰。
核酸本发明的另一目的为提供一种多核苷酸序列(SEQ ID NO4)及其经修饰的序列，其用于编码图1A至1D所示的PDAF(SEQ ID NO1)。PDAF基因与RCAS1基因相似，其在长度上由774 DNAs组成。PDAF基因系扩增自人类胎盘及横纹肌瘤RD细胞系。
本发明亦提供一种由135 DNAs组成的多核苷酸序列(SEQ ID NO5)及其经修饰的序列，其用于编码SEQ ID NO2所示的45个氨基酸。该135DNAs序列系插入RCAS1序列的位置522与523之间。该SEQ ID NO5的数目为3的倍数且在该区无翻译终止密码子。所以，该区不会影响接下来氨基酸序列的翻译及其长度。
本发明亦提供一种由PDAF DNAs的位置523-774的核酸组成的多核苷酸序列(SEQ ID NO6)及其经修饰的序列，其用于编码SEQ ID NO3的多肽。该序列可能为PDAF的功能性片段。
本发明包括基于习知的基因密码的简并性而衍生的可编码SEQ IDNO1，2或3的多肽的所有核酸。该等简并变体可为天然发生者，或可经由例行的分子工程技术的应用而产生的，例如，Sambrook等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory出版，纽约，冷泉港。
根据本发明，编码SEQ ID NO1，2及3以及其衍生物的DNA序列或其片段可使用熟习此一技艺者可易于实施的方法来制造。或者，其可经由化学方法制造。例如，多肽合成可使用各种固相技术进行，而自动化合成可经由多肽合成仪(例如ABI 431A多肽合成仪)达成。
本技艺所熟知及一般的DNA定序方法可被用于本发明的任何优选具体实施方式
。该等方法可利用酶(如DNA聚合酶I的克莱劳(Klenow)片段、Taq聚合酶、T7聚合酶、或重组聚合酶的组合及校读外切核酸酶(proofreading exounclease)(诸如ELONGASE的组合))或市售试剂盒来实施。该方法优选以机器自动化进行，这些机器诸如Hamilton MicroLab 2200(Hamilton，Reno，Nev.)，Peltier Thermal Cycler(PTC200；MJ Research Watertown，Mass.)及ABI 377 DNA定序仪(Perkin Elmer)。
本发明的核酸序列可用熟习此一技艺者可易于实施的方法予以工程化，以修饰PDAF编码序列，该修饰包括(但非限于)修改基因产物的扩增、生产及/或表达。
重组载体及宿主系统本发明的另一目的为提供一种重组载体，其含有如SEQ ID NO4、5或6所示的核酸序列。为了表达生物上活性的PDAF，编码PDAF或其生物功能相等物的核酸序列可被插入适当重组载体(即含有经插入编码序列的转录及翻译所需组件的载体)。根据本发明，可使用熟悉此一技艺者可易于实施的方法构筑含PDAF编码序列以及适当转录及翻译控制组件的重组载体。这些方法包括活体外重组DNA技术、合成技术以及在活体内的基因重组。
本发明的另一目的为提供一种含有重组载体的宿主细胞，该重组载体含有SEQ ID NO4、5或6所示的核酸序列。根据本发明，可使用多种宿主系统以含有及表达编码PDAF的序列。这些宿主细胞包括(但不限于)微生物(诸如用重组噬菌体、质体或共质体(cosmid)DNA重组载体转形的细菌)；用酵母菌重组载体转形的酵母菌；用病毒重组载体感染的昆虫细胞系统；用病毒重组载体或用细菌重组载体转形的植物细胞系统；或动物细胞系统。
用途根据本发明，惊异地发现PDAF具有下列特征(1)与RCAS1相较，PDAF对于周围血液淋巴球、未受刺激的天然B细胞、活化T细胞及血癌细胞系诸如杰凯特(Jurkat)细胞及TF-1能够诱导较高细胞凋亡率。所以，PDAF可作为治疗白血病的细胞毒性剂，及/或在需要抑制反应的病症中(诸如移植体攻击宿主症或自体免疫疾病以及在移植过程中)作为免疫抑制剂。
(2)此外，在胎盘组织中PDAF的表达高于RCAS1的表达。再者，PDAF可诱导免疫细胞的细胞凋亡。根据David A.Clark，1991，CriticalReviews in Immunology，11(3，4)215-247的教示，发明人可以合理地预期PDAF能用于降低对精子排斥所造成的不孕以及对于胎儿组织排斥所造成的流产。
(3)PDAF可在肿瘤细胞表达。所以，发明人可以预期对抗PDAF的抗体可用于杀死表达RCAS1或PDAF的肿瘤细胞。
(4)在一些肿瘤细胞中，PDAF的表达低于RCAS1。所以，与RCAS1的表达相较，PDAF的表达具有较高的组织特异性。因此，发明人可以预期PDAF可用于诊断癌症。
(5)习知技艺已知的免疫抑制剂可被用于治疗肝炎(见Crit RevImmunol，1991，11(3-4)215-247)。所以，发明人可以合理预期本发明的PDAF可用于治疗肝炎。
基于上述描述，本发明的PDAF可用于治疗及诊断与细胞增殖及免疫反应相关的疾病。
医药组合物本发明亦提供一种医药组合物，其包含如SEQ ID NO1、2或3所示的多肽，其特别可用于治疗细胞增殖或抑制免疫反应。该医药组合物可含有适当的医药上可接受的载剂，以及视需要亦可含有赋形剂及辅助剂。
本发明的医药组合物可以习知技艺已知的方式(例如藉习用方法)制造，该习用方法包含混合、溶解、制粒、制锭、磨细、乳化、包胶、包陷及/或冷冻干燥步骤。
本发明的医药组合物可藉任何途径投药，这些途径包括(但不限于)口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、脑室内、穿皮、皮下、腹膜腔内、鼻内、肠道、局部、舌下或肛门投与。
转基因动物本发明亦提供一种转基因动物，其被导入含有SEQ ID NO4的核酸序列的基因片段、含有SEQ ID NO5的核酸序列的基因片段、或含有SEQID NO6的核酸序列的基因片段。根据本发明，转基因动物可为任何方便使用的动物，诸如非人类哺乳动物，例如实验室测试方法所使用者，如啮齿动物(例如小鼠或家鼠)，以及用于产生移植用器官或组织的动物(如猪及马)。本发明的转基因动物系使用习知且方便的基因操作技术(诸如显微注射或感染重组载体)将本发明基因导入动物中而易于得到。该基因可借着导入前躯细胞内而被直接或间接导入至动物的一细胞或所有细胞中。基因操作技术包括传统的杂交养殖，试管受精，或引进重组DNA分子，该重组DNA分子可被整合在染色体中或可为在染色体外复制的DNA。本发明的基因包括分别含有SEQ ID NO4，5及6的核酸序列的基因片段。
根据本发明，转基因动物由于导入本发明的基因而具有非特异性免疫抑制活性。所以，转基因动物可被用作较易被人类接受的移植用器官或组织的来源。
下列实例系被用于举例说明而非限制本发明。
实例1 PDAF的制造人类PDAF基因的扩增将胎盘组织磨碎并用玻璃研磨器(汇通公司(Wheaton))在RNAZOLTMB溶液中混合。添加0.1ml氯仿至所得溶液中，然后将该溶液置于冰上5分钟。将所得溶液于12,000g及4℃下离心15分钟。取0.5ml的上层水层，并添加0.5ml异丙醇至该层中。完全混合后，将所得溶液放置在冰上15分钟，然后于12,000g及4℃下离心15分钟以沉淀出RNA。将1ml的75％乙醇添加至该沉淀物中以移除RNA沉淀物中的盐。将RNA沉淀物在空气中自然干燥，然后溶解在适当量的无菌水中。测定OD260以定量RNA。
使用胎盘的全部RNA及寡-d(T)12-18引物进行逆转录反应。所得第一股cDNA与RNA互补结合以形成核酸分子。以RNase H处理核酸分子以得到用于合成第二股cDNA的引物。以引物及聚合酶合成该cDNA。所得cDNA粘接入质体pCR3.1。继而将该质体pCR3.1转形入宿主细胞大肠杆菌DH5α中。将该宿主细胞移至硝基纤维素膜上并用含强碱及SDS的缓冲液溶裂细胞以释出质体DNA。将质体DNA用UV处理以将该DNA固定于硝基纤维素膜上。使用ATP-GTP结合位置的多肽序列GXXXXGKS(SEQ ID NO7)的简并序列做为DNA探针，经由杂交反应以选择含有所欲质体DNA的宿主细胞。培养经选择的宿主细胞，接着萃取该宿主细胞的质体。使用各种限制酶的限制酶定位图测定法定性DNA，或者使用引物T7及pCR3.1反向引物自动定序双股DNA。
经定序的DNA用DNASIS-Mac v 2.0软件分析。与基因库(Genebank)中的序列比较后，发明人未发现任何基因序列与本发明的PDAF的序列相同。然而，顷发现新颖PDAF基因的蛋白质翻译区与RCAS1者相似。如图1A至1D所示，PDAF基因的蛋白质翻译区在长度上具有774核酸(SEQ IDNO4)。再者，PDAF及RCAS1的限制酶定位图(图2A及限酶切割的电泳圈(图2B))证明PDAF基因确实与RCAS1不同。
新颖PDAF基因的蛋白质翻译区具有额外的135核酸(SEQ ID NO5)。PDAF基因的其余539核酸与RCAS1完全相同。此外，在基因库中未发现与上述135核酸相同的序列。该由135核酸组成的序列被插在RCAS1序列的位置522与523之间。
135核酸的序列用于编码由45个氨基酸组成的序列(SEQ ID NO2)。查核基因库后，未发现相似的序列。只有在内质网(ER)中B类补体的磷脂酰肌醇糖(phosphatidyllinositiol glycon of complementationclass B(PIG-B))的氨基酸256-284的序列与45个氨基酸的序列具低度相似性(图3)。所以，该45个氨基酸的序列为新颖序列。经由DNASIS-Macv 2.0软件的分析，发现45个氨基酸的序列为高度疏水性多肽(图4)。该多肽的氨基酸210-217(GQWSYGKS)与Ras蛋白质的ATP-GTP结合位置区域的序列((A/G)XX XXGK(S/T))(SEQ ID NO8)具高度相似性。
在肿瘤细胞系中PDAF的表达以人类乳腺腺癌MCF-7、人类结肠直肠腺癌HT29、人类黑色素瘤A375、人类胚胎性横纹肌瘤RD及人类胎盘细胞测定PDAF的表达。萃取RNA，然后用寡-d(T)12-18作为逆转录反应的引物。继而使用PDAF基因的蛋白质翻译区的二终端的序列作为引物，将反应产物进行PCR反应。生成的反应产物经由琼脂醣凝胶电泳分析。如图5所示，上述肿瘤细胞系主要表达RCAS1。只有RD细胞系表达少量的PDAF。不过，胎盘细胞主要表达PDAF。相反地，胎盘细胞仅表达少量RCAS1。
重组蛋白质的表达及纯化pCR3.1质体所含的RCAS1基因片段或PDAF基因片段藉使用限制酶EcoRI切割及用1％琼脂醣凝胶单离。使用Gene Clean III试剂盒纯化被单离的DNA片段。将纯化的DNA与pGEX-3X载体(Amersham Pharmacia)粘接，然后将该载体转形入大肠杆菌。萃取该细胞所含的质体，得到质体pGEX-3X/RCAS1及pGEX-3X/PDAF。将上述二质体转形入大肠杆菌BL21以表达重组蛋白质。
将含有上述二质体的大肠杆菌细胞在37℃下振荡培养整夜。将培养溶液接种至新鲜AP/LB培养基并在37℃下振荡培养4小时。添加0.1mM的IPTG至培养物。然后将培养物于振摇及25℃下培育4小时以诱导重组蛋白质的表达。将该培养物于8000xg及4℃下离心15分钟以收集细胞。将细胞悬浮在20毫升含1％Triton X-100的PBS缓冲液中。使用音波仪破裂该细胞。在12,000xg及4℃下离心15分钟以移除不溶的沉淀物。将含有重组蛋白质的上清液加至装填有麸胱甘肽(glutathione)琼脂糖4B的亲和管柱(Amersham Pharmacia)中。以含20mM还原谷胱甘肽、120mMNaCl及50mM Tris-HCl的缓冲液(pH8.0)冲析GTS-重组蛋白质。将冲析出的溶液于4℃下以PBS缓冲液透析并以Amicon 8010浓缩。所得蛋白质的浓度用BCA蛋白质测定试剂(Pierce)测定。
使用自RCAS1及PDAF的细胞外蛋白质区域设计的引物进行PCR，以大量得到用于编码RCAS1及PDAF的细胞外蛋白质区的基因片段。以限制酶BamHI处理基因片段并黏接至用BamHI预先处理的载体pET32a(+)(Invitrogen)。然后，将该载体转形入大肠杆菌细胞。经由PCR、质体萃取及限制酶定位图谱测定，得到质体pET32a(+)/RCAS1.ECD及pET32a(+)/PDAF.ECD。以上述二质体转形入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Promega)。
将含有质体pET32a(+)/RCAS1.ECD及pET32a(+)/PDAF.ECD的大肠杆菌细胞在37℃下振荡培养整夜。将培养物接种至新鲜AP/LB培养基，继而在37℃下振荡培育3小时。将0.1mM的IPTG加到培养基中以诱导重组蛋白质的大幅表达。将培养物于8000xg及4℃下离心15分钟以收集细胞。将细胞悬浮在含50mM磷酸钠(pH8.0)及300mM氯化钠的缓冲液中并藉超音波使的破裂。在12,000xg及4℃下离心15分钟以移除不溶的沉淀物。添加含有重组蛋白质的上清液至由Ni-NTA SUPERFLOW(QIAGENE)组成的亲和性管柱中。PET重组蛋白质以含有10％甘油及连续梯度的0-500mM咪唑的缓冲液(pH8.0)冲析。重组蛋白质pET-RCAS1.ECD、pET-PDAF.ECD、GST-RCAS1及GST-PDAF的电泳图系示于图6中。将冲析出的溶液于4℃下以PBS缓冲液透析及用AMICON 8010浓缩。所得蛋白质的浓度用BCA蛋白质测定试剂(Pierce)测定。
实例2 PI染色及流式细胞光度测定108的人类周围血液单核细胞在含10％牛血清的RPMI培养基中在37℃下培育1-2小时。收集悬浮细胞，接着添加至涂覆兔-抗-人类免疫球蛋白IgM抗体(CAPPEL)的24孔培养皿中。将培养皿置于室温下1小时以进行附着反应。与兔子-抗人类免疫球蛋白IgM抗体接连的淋巴球为未受刺激的天然B细胞。收集悬浮的细胞并添加1×106细胞/毫升/孔至涂覆小鼠-抗人类CD3单株抗体(OKT3；3μg/ml；1ml/孔)的24-孔培养皿中。在培养皿中的淋巴球主要为活性T细胞。将如上述制备的重组蛋白质添加至含上述B及T细胞的24-孔培养皿中，接着将培养皿放置在培育器中，并于5％CO2及37℃下培育64-68小时。将该细胞于2400rpm离心5分钟。移除上清液并添加低张DNA染色缓冲液(3.5mM柠檬酸钠，0.3％Triton X-100，pH6.8)至细胞中。再加入800μl的低张DNA染色缓冲液及30μg RNase A及5μg碘化普罗披锭(propidium iodide)。该反应进行30分钟。染色结果藉流式细胞仪测定。如图7所示，用GST-PDAF处理的PBMC的细胞凋亡率比用GST-RCAS1处理的PBMC的细胞凋亡率高。
图8及9显示与GST-RCAS1相较，GST-PDAF在未受刺激的天然(native)B细胞及活化T细胞中可诱导较高度的细胞凋亡。
人类血癌细胞系、杰凯特(Jurkat)(T淋巴球细胞)及人类红血球癌细胞系TF-1(ATCC CRL-2003)的PI染色及流式细胞仪测定如上述进行。如图10所示，用PBS缓冲液或GST蛋白质处理的杰凯特细胞(对照组)的细胞凋亡率分别为3.95％及5.22％。用GST-RCAS1处理的杰凯特细胞的细胞凋亡率为7.9％，略高于用GST蛋白质处理的杰凯特细胞的细胞凋亡率。不过，用GST-PDAF处理的杰凯特细胞的细胞凋亡率远高于用GST-RCAS1处理或用GST处理的杰凯特细胞的细胞凋亡率。基于上述，本发明的PDAF与RCAS1相较，能诱导较高的杰凯特细胞细胞凋亡率。
人类白血球癌细胞系TF-1为具低度分化的造血细胞系。如图11所示，本发明的PDAF与RCAS1相较，能诱导较高的TF-1细胞细胞凋亡。
序列表<110>华星生物科技股份有限公司<120>胎盘衍生的细胞凋亡因子<130>6653-015<140>09/684,327<141>2000-10-10<160>9<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>258<212>PRT<213>PDAF多肽序列<400>1Met Ala Ile Thr Gln Phe Arg Leu Phe Lys Phe Cys Thr Cys Leu Ala1 5 10 15Thr Val Phe Ser Phe Leu Lys Arg Leu Ile Cys Arg Ser Gly Arg Gly20 25 30Arg Lys Leu Ser Gly Asp Gln Ile Thr Leu Pro Thr Thr Val Asp Tyr35 40 45Ser Ser Val Pro Lys Gln Thr Asp Val Glu Glu Trp Thr Ser Trp Asp50 55 60Glu Asp Ala Pro Thr Ser Val Lys Ile Glu Gly Gly Asn Gly Asn Val65 70 75 80Ala Thr Gln Gln Asn Ser Leu Glu Gln Leu Glu Pro Asp Tyr Phe Lys85 90 95Asp Met Thr Pro Thr Ile Arg Lys Thr Gln Lys Ile Val Ile Lys Lys100 105 110Arg Glu Pro Leu Asn Phe Gly Ile Pro Asp GIy Ser Thr Gly Phe Ser115 120 125Ser Arg Leu Ala Ala Thr Gln Asp Leu Pro Phe Ile His Gln Ser Ser130 135 140Glu Leu Gly Asp Leu Asp Thr Trp Gln Glu Ash Thr Asn Ala Trp Glu145 150 15S 160Glu Glu Glu Asp Ala Ala Trp Gln Ala Glu Glu Val Leu Arg Ser Arg165 170 175Thr Asn Val Cys Leu Leu Cys Ser Leu Leu Phe His His Pro Thr Pro180 185 190Thr Ser Thr Pro Tyr Ile Asn Gln Ser Val Lys Ile Glu Arg Val Ser195 200 205Leu Gly Gln Trp Ser Tyr Gly Lys Ser Lys Glu Gln Gln Lys Leu Ala210 215 220Asp Arg Glu Lys Arg Ala Ala Glu Gln Gln Arg Lys Lys Met Glu Lys225 230 235 240Glu Ala Gln Arg Leu Met Lys Lys Glu Gln Asn Lys Ile Gly Val Lys245 250 255Leu Ser<210>2<211>45
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<210>6<211>252<212>DNA<213>PDAF多肽序列<400>6tccaggacca atgtatgttt actctgctct ctcctgtttc atcatcccac tcctacctcc 60actccctaca ttaaccaatc agtaaagata gagagagtga gtctgggtca gtggagttac 120ggaaagagta aggaacagca gaaactagca gacagagaaa agagagcagc cgaacaacaa 180aggaagaaaa tggaaaagga agcacaacgg ctaatgaaga aggaacaaaa caaaattggt 240gtgaaacttt ca 252<210>7<211>8<212>PRT<213>PDAF多肽序列<220>
<221>变体<222>(1)...(8)<223>xaa＝任何氨基酸<400>7Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Lys Ser1 5<210>8<211>6<212>PRT<213>pDAF多肽序列<220>
<221>变体<222>(1)...(6)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>8Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Lys1 5<210>9<211>29<212>PRT<213>PIG-B多肽序列<400>9Leu Ile Leu His His Phe Leu Pro Val Gly Phe Val Thr Leu Ser1 5 10 15Leu Ser Leu Met Ile Asp Arg Ile Phe Phe Gly Gln Trp Thr20 2权利要求
1.一种多肽，其特征在于具有含SEQ ID NO1的氨基酸序列或其生物功能相等物。
2.一种多肽，其特征在于包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其生物功能相等物。
3.一种多肽，其特征在于包含SEQ ID NO3的氨基酸序列或其生物功能相等物。
4.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于是用于抑制细胞的生长及分化或抑制免疫反应。
5.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于它用于抑制细胞的生长及分化或抑制免疫反应。
6.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于它用于抑制细胞的生长及分化或抑制免疫反应。
7.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于它用于治疗癌症。
8.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于它用于治疗癌症。
9.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于它用于治疗癌症。
10.一种分离的核酸，其特征在于它用于编码权利要求1的多肽，及其简并序列。
11.一种分离的核酸，其特征在于它用于编码权利要求2的多肽，及其简并序列。
12.一种分离的核酸，其特征在于它用于编码权利要求3的多肽，及其简并序列。
13.根据权利要求10所述的分离的核酸，其特征在于它为SEQ IDNO4。
14.根据权利要求11所述的分离的核酸，其特征在于它为SEQ IDNO5。
15.根据权利要求12所述的分离的核酸，其特征在于它为SEQ IDNO6。
16.一种重组载体，其含有权利要求10的核酸序列。
17.一种重组载体，其含有权利要求11的核酸序列。
18.一种重组载体，其含有权利要求12的核酸序列。
19.一种宿主细胞，其含有权利要求16的载体。
20.一种宿主细胞，其含有权利要求17的载体。
21.一种宿主细胞，其含有权利要求18的载体。
22.一种制造权利要求1的多肽的方法，其包含下列步骤a)在适于表达多肽的条件下，培养权利要求19的宿主细胞；以及b)从宿主细胞培养物回收多肽。
23.一种制造权利要求2的多肽的方法，其包含下列步骤a)在适于表达多肽的条件下，培养权利要求20的宿主细胞；以及b)从宿主细胞培养物回收多肽。
24.一种制造权利要求3的多肽的方法，其包含下列步骤a)在适于表达多肽的条件下，培养权利要求21的宿主细胞；以及b)从宿主细胞培养物回收多肽。
25.一种重组蛋白质，其包括权利要求1的多肽及对该多肽而言为外来且非实质上同源的区域。
26.一种重组蛋白质，其包括权利要求2的多肽及对该多肽而言为外来且非实质上同源的区域。
27.一种重组蛋白质，其包括权利要求3的多肽及对该多肽而言为外来且非实质上同源的区域。
28.一种控制细胞生长的医药组合物，其包含权利要求1的多肽。
29.一种控制细胞生长的医药组合物，其包含权利要求2的多肽。
30.一种控制细胞生长的医药组合物，其包含权利要求3的多肽。
31.根据权利要求28所述的医药组合物，其特征在于它用于抑制细胞的生长及分化或抑制免疫反应。
32.根据权利要求29所述的医药组合物，其特征在于它用于抑制细胞的生长及分化或抑制免疫反应。
33.根据权利要求30所述的医药组合物，其特征在于它用于抑制细胞的生长及分化或抑制免疫反应。
34.一种制备转基因动物的方法，其包括将含有SEQ ID NO4的核酸序列的基因片段导入动物。
35.一种制备转基因动物的方法，其包括将含有SEQ ID NO5的核酸序列的基因片段导入动物。
36.一种制备转基因动物的方法，其包括将含有SEQ ID NO6的核酸序列的基因片段导入动物。
全文摘要
本发明提供一种新颖人类肿瘤－相关抗原(即胎盘衍生的细胞凋亡因子(PDAF))的核酸及氨基酸序列，及这些序列在治疗免疫及细胞增殖相关病症上的用途。
文档编号C12N15/12GK1640890SQ200410000359
公开日2005年7月20日 申请日期2004年1月9日 优先权日2004年1月9日
发明者罗玮瑜, 谢世良 申请人:华星生物科技股份有限公司