专利名称：肝再生增强因子作为免疫抑制剂的应用和开发的制作方法
技术领域：
本发明属于生物产品的应用和开发领域。
背景技术：
随着医学科学的不断发展，对疾病发病机制认识的也不断深入，免疫系统相关的疾病(如自身免疫性疾病、移植排斥反应等)越来越受到人们的重视。自身免疫性疾病，作为一个疾病群，已成为临床常见病，其疾病谱有扩大的趋势----越来越多的疾病被确定为自身免疫性疾病，或与自身免疫密切相关。自身免疫性疾病已经成为当前严重威胁人类健康的疾病之一，是现代医学的一个“难点、重点”，而免疫抑制治疗仍然是目前治疗自身免疫性疾病的主要常规手段。20世纪以来，器官移植技术随着外科手术、免疫抑制药物、器官和细胞分离保存技术及移植免疫学基础研究的迅速发展，已成为脏器功能衰竭终末期的有效、常规性治疗手段。但由于未能彻底解决人体排异反应的难题，移植器官存活的时间常常受到影响。为此世界各国的医药工作者进行了不懈的努力，开展了同种移植器官排斥免疫学的研究，如采用正确合理的组织配型、供体器官的保存方法、手术前预处理方式的改进以及用免疫抑制剂这一重要手段来减少排斥反应等。
免疫抑制剂是一类在器官移植、免疫病理学和临床免疫学等多学科研究基础上发展起来的新的药剂类别，具有免疫抑制作用，可抑制机体异常的免疫反应，目前广泛应用于器官移植排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。免疫抑制剂的发展大致可分为四代，第1代以皮质激素、硫唑嘌呤、抗淋巴细胞球蛋白(AlG)为代表，主要作用为溶解免疫活性细胞，阻断细胞的分化，其特点为非特异性、广泛的免疫抑制。第2代以环孢素A(CsA)和FK506为代表，主要阻断免疫活性细胞的白细胞介素2(IL-2)的效应环节，因其以淋巴细胞为主而具有相对特异性。第3代以单克隆抗体、雷帕霉素、霉酚酸脂为代表，其作用于抗原呈递和分子间的相互作用，与第2代制剂有协同作用。第4代以抗IL-2受体单克隆抗体、FTY20等为代表，主要针对改变cytokine环境，如抑制TH1，增强TH2。虽然随着免疫抑制剂的发展，给千百万需要治疗的病人带来了希望和新生，但由于其选择性和特异性的限制，在治疗的同时不可避免地会损伤患者的免疫防卫能力，致使患者抗感染能力下降，恶性病变的危险增加，除造血和免疫系统外，还损伤肝、肾和消化道功能，造成神经和内分泌功能紊乱以及引发某些过敏反应等。因此研究出更高效而毒副作用更小的免疫抑制剂，已成为临床医师和医药界的共同愿望。
对我国而言，由于没有自己开发的免疫抑制剂，目前临床上广泛应用免疫抑制剂均是从国外引进的，价格昂贵，以环孢素A为例，器官移植后病人每年仅这一项支出就达3-5万，经济负担沉重，使许多患者望而却步。因此，开发出享有完全自主知识产权、高效、低毒、价廉的新型免疫抑制剂，已成为当前我国医药研究刻不容缓的课题。
本研究发现肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration，ALR)具有很强的免疫抑制作用，这种抑制作用仅针对激活的免疫细胞，对未激活免疫细胞则无影响；由于ALR是由人体自身产生的细胞因子，外源性的增加这种因子所引起的毒副作用很少，而且对机体造血系统无明显抑制作用。因此，它具有作为免疫抑制剂开发的巨大潜力，这一研究成果在国内外还未见有报道。可利用基因工程技术大量生产，降低成本，应用于临床，必将产生巨大的社会和经济效益。
发明内容
本发明是将ALR这种机体自身产生的细胞因子，作为新的免疫抑制剂来应用和开发，具有特异性抑制激活的免疫细胞，不影响机体固有的防御能力和造血系统，毒副作用少，可利用基因工程技术大量生产，成本较低，有助于解决目前临床上常用的免疫抑制剂价格昂贵，毒副作用大的缺点，给自身免疫性疾病和器官移植的治疗提供一条全新的有效途径。
本发明内容包括ALR免疫抑制作用的体外活性研究。ALR对于由特异性抗原(肝细胞和肾小管细胞膜抗原)和非特异性抗原(刀豆蛋白A，ConA)刺激的淋巴细胞增殖，具有明显的剂量依赖关系，并对IL-2的产生有明显的抑制作用，而且ALR对未经抗原刺激活化的免疫细胞则无抑制作用，在作用机制上不同于CsA。本发明内容还包括ALR免疫抑制作用的体内活性研究。在新生肝细胞移植加ALR治疗动物急性肝功能衰竭的实验研究中，ALR能明显提高急性肝功能衰竭动物的存活率，其疗效优于新生肝细胞移植加环孢霉素A(CsA)。
具体实施例方式本发明通过以ConA和细胞膜作为非特异和特异性抗原在体外刺激脾脏单个核细胞增殖实验，证明ALR对特异和非特异抗原活化的大鼠脾脏单个核细胞均有明显抑制作用；通过用新生大鼠肝细胞脾内移植联合ALR治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验，证明新生大鼠肝细胞移植与ALR联合运用较单纯的细胞移植能明显提高肝衰竭大鼠的存活率，促进肝功能恢复及改善肝脏病理状况；为将其作为免疫抑制药物开发提供了理论和实验依据。具体实施方案如下1.ALR免疫抑制作用的体外活性研究(1)ALR对ConA诱导大鼠脾脏单个核细胞增殖的抑制作用研究用液体闪烁计数仪测定不同浓度ALR对以5μg/ml的ConA诱导的大鼠脾脏单个核细胞增殖影响。以5μg/ml的CsA、相同体积的空质粒表达产物和相同体积的1640培养液分别作为阳性和阴性对照，结果表明ALR对ConA的促淋巴细胞增殖在5-100μg/ml的浓度范围内有明显抑制作用，且呈现量效依赖关系，在100μg/ml有最大抑制作用，而空质粒表达产物对增殖无影响，见表1。
(2)30ug/ml的ALR预处理至30h也不影响脾脏单个核细胞对ConA刺激的反应能力。CsA预处理8h后就能明显抑制脾脏单个核细胞对ConA反应，以1640培养液作为对照处理组，见表2。
(3)30ug/ml的ALR在24小时对ConA诱导的脾脏单个核细胞产生IL-2有明显的抑制作用，而CsA在8小时就现显出明显的抑制作用，这进一步说明ALR在作用机制上不同与CsA，见表3。
(4)ALR对成年SD大鼠原代肝细胞膜和人肾小管上皮细胞株HK2细胞膜抗原刺激Wister大鼠脾脏单个核细胞增殖的抑制研究用SD大鼠原代肝细胞和HK2细胞制备的膜抗原分别皮下免疫Wister大鼠，14天后分离脾脏单个核细胞，再分别以相同膜抗原刺激，同时加入浓度为30μg/ml和100μg/ml的ALR，以5μg/ml CsA和相同体积的1640培养液分别作为阳性和阴性对照，用液体闪烁计数仪检测细胞增殖情况。结果两种浓度的ALR和CsA均能抑制肝细胞膜抗原和HK2细胞膜抗原刺激的单个核细胞的增殖反应(P＜0.01)，见表4。
2.ALR免疫抑制作用的体内活性研究采用D-氨基半乳糖(D-gal)诱导大鼠发生急性肝功能衰竭，分别以新生大鼠肝细胞移植加ALR、新生大鼠肝细胞移植加CsA、新生大鼠肝细胞移植、ALR和生理盐水等治疗急性肝衰竭大鼠，观察不同处理组肝衰竭大鼠存活率，肝脏功能及转归。结果显示用ALR联合新生大鼠肝细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭疗效显著，可改善D-gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率，促进肝功能恢复及改善肝脏病理状况，见说明书附图1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、4A、4B。
本发明的优点在于(1)首次发现ALR具有很强的免疫抑制作用，为ALR的临床应用开拓了新的思路。
(2)ALR仅抑制激活的免疫细胞，对未经抗原刺激活化的免疫细胞则无抑制作用，因此，不影响机体固有的防御能力。
(3)ALR为人体自身产生的细胞因子，对机体造血系统无影响，作为新的免疫抑制剂来开发，具有毒副作用少。
(4)可利用基因工程技术大量生产，成本较低的特点，有助于解决目前临床上常用的免疫抑制剂价格昂贵，副作用大的缺点，给自身免疫性疾病和器官移植的治疗提供一条全新的有效途径。
表1不同浓度ALR对ConA诱导单个核细胞增殖的影响
注与对照组比*P＜0.05，**P＜0.01表2 ALR预处理不同时间对ConA诱导单个核细胞增殖的影响
注与对照组比*P＜0.05，**P＜0.01表3 ALR对ConA诱导单个核细胞产生IL-2的影响(单位pg/ml)
注与ConA组比*P＜0.05，**P＜0.01表4 ALR对特异抗原诱导的单个核细胞增殖的影响
注与对照组比**P＜0.01
图1急性肝功能衰竭大鼠经不同治疗的存活曲线。其中肝细胞移植加ALR组的存活率比单纯肝细胞移植组的存活率显著增加，P＜0.05。
图2单纯肝细胞移植(A)、肝细胞移植加CsA(B)和肝细胞移植加ALR(C)三种方法治疗急性肝衰竭术后7天大鼠肝脏的病理切片比较(x 200 HE)。
图3单纯肝细胞移植(A)、肝细胞移植加CsA(B)和肝细胞移植加ALR(C)三种方法治疗急性肝衰竭术后12天大鼠肝脏的病理切片比较(x 200 HE)。
图4肝细胞移植加ALR(A)和单纯肝细胞移植(B)治疗大鼠急性肝功能衰竭12天，存活大鼠肝脏组织增殖细胞核抗原染色比较(x 200 HE)。前者以肝细胞核染色为主，后者以炎症细胞核染色为主。
权利要求
1.肝再生增强因子作为免疫抑制剂开发的权利利用基因工程技术大量生产肝再生增强因子，作为一种新的免疫抑制剂进行开发。
2.肝再生增强因子作为免疫抑制应用的权利肝再生增强因子是一种机体自身产生的、能促进肝脏再生的细胞因子，在体内分布广泛，可能具有多种生物学功能，本发明发现其具有很强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用。
全文摘要
本发明是通过体内外实验发现由机体自身产生的肝再生增强因子具有很强的免疫抑制作用，而且这种抑制作用仅影响激活的免疫细胞，对未激活的免疫细胞则无影响。因此，肝再生增强因子可作为免疫抑制进行应用和开发。
文档编号A61P39/06GK1795924SQ200410081570
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月21日 优先权日2004年12月21日
发明者刘杞, 张玲, 孙航, 袁刚, 谢华 申请人:重庆医科大学