专利名称：针对活化Th1细胞的重组免疫毒素IP10－DT390的质粒及制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表达以IP10为导向分子，白喉毒素的活性片段DT390为毒素分子，特异攻击并杀伤活化的Th1细胞的新型重组免疫毒素质粒及其制备方法。
背景技术：
免疫毒素(Immunotoxins，ITs)是将生物毒素与抗体或细胞因子连接起来的导向药物，又称作生物导弹或导向毒素。第一代免疫毒素是将载体与毒素分子通过化学偶联而成，这类免疫毒素具有稳定性差、分子量大、免疫原性强、渗透性差、疗效较差等缺点，且难以大规模生产，因而限制了其应用。随着基因工程重组技术的进一步发展，将载体基因与毒素基因融合，经表达及纯化制备获得重组免疫毒素。这种新工艺产生的嵌合免疫毒素稳定性强，渗透性好，具有较好的导向特异性，且制备方法简单易行，可短期内大量制备，在很大程度上弥补了第一代免疫毒素稳定性差、半衰期短、免疫原性强等不足。极大地推动了免疫毒素在相关领域的深入研究。免疫毒素在生物医学的应用，大都集中于对某些恶性肿瘤及与免疫相关的人类疾病的导向治疗。迄今FDA批准的分子靶向药物(molecularly targeted agent)如Herceptin，Rituximab，ZD1839(Iressa)以及目前风靡全球的STI571(Gleevec)成功地对那些常规疗法无效的肿瘤患者显现出惊人的疗效。其中，白喉毒素与白细胞介素2重组的免疫毒素(ONTAC)业已问世，用于成人皮肤T细胞淋巴瘤的治疗(见Foss FM.Clin Lymphoma，2000，1(2)110-116.)。以T细胞为靶细胞的免疫毒素在治疗T细胞性自身免疫性疾病及移植物抗宿主疾病(GvHD)也取得了良好疗效(见Hu HZ，et al.Cell Immunol.1997，17726；Brenner T，etal.Immùnol.lett.1999，68403；Kreitman RT，et al.Expert Opinion on PharmacoTherapy.1(6)1117-29，2000 Sep.)。基础免疫学的研究进展表明，自身免疫性疾病中识别自身抗原的自身反应性T细胞，主要是CD4+Th1细胞，而CD4+Th2则具有一定的调节作用(见Liblau RS，et al.Immunol.Today；1995，1634；Costa GL，et al.J.Immunol.2000，1643581)。在治疗T细胞性自身免疫性疾病及移植物抗宿主疾病时，这些免疫毒素的作用靶点主要是选择针对T细胞表面抗原或细胞因子受体，如CD3、CD4、CD5、IL-2等，在接受这些免疫毒素的治疗后，相应的自身免疫性疾病或GvHD病情虽有缓解，但出现较显著毒副作用，有时使临床治疗被迫终止。这些毒副作用的主要原因之一是由于这类免疫毒素所选择的导向分子特异性欠佳，往往导致无选择性地杀死所有T细胞，可能会造成免疫应答的普遍抑制。许多细胞因子和激素的受体在活化的自身反应性细胞表面呈特征性分布，因此可利用其配体作为重组免疫毒素的载体。目前为止，已有许多细胞因子被利用来作免疫毒素的载体，如RFT5.dgA(CD25R)、Ki-4.dgA(CD30R)、BL22(CD22R)、IL-10等(见Kreitman RJ，et al.Bailliere′s Best Practice in ClinicalHaematology.16(1)117-33，2003 Mar；Hutchings A，et al.Transplant Immunology.11(3-4)335-44，2003 Jul-Sep.Schnell R，et al.Annals of Oncology.14(5)729-36，2003 May)，以此来构建的重组免疫毒素均具有特异性细胞毒效应可治疗自身免疫性疾病。自身免疫性疾病(autoimmune disease)是由于各种原因导致免疫系统对自身抗原反应，造成自身组织损伤和功能障碍的一大类疾病。目前的治疗措施主要是采用各种非特异的免疫抑制剂，但往往使患者免疫系统受到普遍性抑制而导致感染、肿瘤的发生及骨髓抑制等，而且不能有效地防止疾病的复发。因而促使相关领域的研究者从免疫治疗的角度，寻求一种特异、安全、有效的治疗方法如TCR阻断法、细胞因子治疗、MHC阻断法、CD4分子阻断法、T细胞接种以及口服抗原诱导耐受等等，但这些方法或因特异性不高、疗效不稳定，或因技术难度大、难以克服的毒副作用等而不能顺利地过渡到临床(见Waldor MK，et al.Science.1985，227415；Chen Y，et al.Nature.1995，376177；Weiner HL，Immunology Today.1997，18355；Hollday SD，etal.Environmental HealTh Perspectives.108 Suppl 3463-73，2000 Jun；PalmisanoGL，et al.Clinical & Experimental Immunology.135(2)259-66，2004 Feb)，因而自身免疫性疾病的治疗至今仍然是困扰临床的一大难题。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种新型的特异攻击Th1细胞的重组免疫毒素质粒，为临床治疗自身免疫性疾病提供一种新方案，为重组免疫毒素的应用开辟一条新途径。
本发明所述的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素质粒含有序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。此种质粒由IP10 cDNA碱基序列(来自gene bank)插入含有白喉毒素的活性片段DT390 cDNA碱基序列(来自gene bank)的SRα真核质粒中用连接酶连接而成，可表达特异性的重组免疫毒素IP10-DT390。以IP10为导向分子、以白喉毒素的活性片段DT390为毒素分子，具有特异攻击并杀伤活化的Th1细胞的特性。IP10是近年发现的一种新型细胞因子，在免疫应答的过程中，活化的T细胞将表达多种受体，如细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ的受体以及多种化学趋化因子CCR-5，CXCR-3等的受体。这些T细胞的膜受体中，现已证实IP10受体的表达仅限于活化的Th1细胞，而Th2细胞没有表达，并且这种膜受体的表达稳定和持续(见Falko R.，et al.Journal ofNeuroimmunology 2000，110195-208；Gizi W.，et al.The Journal of Immunology2002，1685885-5892)，因此，IP10受体不仅可以作为识别Th1细胞和Th2细胞的标志，也为相关的免疫治疗提供了一个理想的靶位。本发明选用IP10为导向分子，白喉毒素的活性片段DT390为毒素分子，构建IP10-DT390重组免疫毒素质粒，转染体内，表达重组免疫毒素，可特异攻击并杀伤活化的Th1细胞，诱导自身免疫耐受，从而解决了原有免疫毒素特异性欠佳、需要提纯的问题，实现有效治疗自身免疫性疾病的目的。因此，本发明所述的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素质粒可在制备治疗或预防自身免疫性疾病的药中应用。
重组质粒的构建方法依次包括以下步骤1、通过RT-PCR反应，获得IP10基因；2、将上述扩增的IP10基因片段插入到含有DT390片段的SRα真核质粒中，即构建成重组质粒。再转染至感受态细菌中进行扩增，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；3、限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析，以保证重组质粒中IP10插入片段的正确性；4、通过MTT法测定重组免疫毒素质粒的表达活性。
上述制备方法中，构建重组质粒的载体除可选用SRα真核质粒外，还可选用pSecTag2。限制性内切酶可选用Sal I、Nco I及EcoR I。IP10基因用RT-PCR扩增。
本发明所涉及的新型免疫毒素质粒及其制备方法具有以下有益效果1.IP10-DT390重组免疫毒素质粒转染体内，表达重组免疫毒素，其选择新型细胞因子IP10为导向分子，由于IP10受体只表达在活化的Th1细胞表面，Th2细胞表面没有表达，因而由IP10导向的重组免疫毒素只针对Th1细胞，从而使导向攻击更特异、更有效，减少临床治疗自身免疫性疾病时的毒副作用。
2.毒素分子选用的是白喉毒素的活性片段DT390，是细菌毒素的跨膜结构域和酶性结构域，去除了DT分子的细胞结合区，可进一步减少非特异性结合和降低不良反应。
3.通过质粒转染活体肌肉细胞的方法，将免疫毒素(IP10-DT390)质粒直接导入动物肌肉，使免疫毒素(IP10-DT390)在骨骼肌内高效表达而起到治疗作用。
4.免疫毒素质粒是通过DNA重组技术来获得的，它可直接转染细胞而表达重组免疫毒素，勿需进一步提纯免疫毒素蛋白质。同时避免了原来化学偶联免疫毒素复杂的制备工艺和难以标化的缺点，使其更易产业化。
5.免疫毒素IP10-DT390质粒亦可用于移植排斥反应及某些肿瘤的防治。
图1是本发明所述针对活化Th1细胞的重组免疫毒素(IP10-DT390)质粒的一种示意图，真核质粒载体为SRα；图2是流式细胞仪测定IP10-DT390活化T、Th1、Th2和B细胞的细胞毒实验结果图；图3是转染SRα-IP10-DT390的NIH3T3细胞上清对活化T细胞的细胞毒作用(MTT法)；图4是IP10-DT390治疗组与对照组临床评分；图5是治疗组及未治疗组小鼠的病理切片。
图中，1-1-DT390、1-2-IP10、1-3-SRα真核质粒、3-1-转染细胞上清(48h)、3-2-转染细胞上清(24h)、3-3-非转染细胞上清、4-1-未治疗组、4-2-治疗组、5-1-未治疗组小鼠第一室管膜周围炎细胞浸润40×、5-2-未治疗组小鼠脑膜血管周淋巴细胞浸润40×、5-3-未治疗组小鼠脑组织疏松化40×、5-4-对照组小鼠大脑组织20×、5-5-治疗组小鼠脑组织疏松化减轻40×、5-6-治疗组小鼠脑膜血管炎细胞浸润减少20×具体实施方式
实施例1重组免疫毒素真核表达质粒的构建载体选用含有DT390的SRα真核质粒(由美国Wisconsin大学PhD.Hu Huaizhong提供，invitrogen公司)，具体步骤如下1、小鼠IP10基因的预处理(以下试剂均购于promega公司)(1)用Trizol试剂按以下步骤提取小鼠肝总RNA1)小鼠肝组织100mg。
2)加1mlTrizol。
3)匀浆。
匀浆要彻底，后转至EP管，组织匀浆量＞100mg时分装，1ml/每EP管。
4)颠倒混匀10下，室温5分钟。
5)加氯仿1/5体积(0.2ml，必须按总体积的1/5)。
6)颠倒混匀10下，室温5分钟。
7)离心12000g，4℃，15分钟。
8)转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中。
9)加等体积异丙醇(约400μl)，混匀室温10分钟10)离心12000g，4℃，10分钟。
11)弃上清12)加冰预冷的75％乙醇(用DEPC水配)1ml。
13)离心7500g，4℃，5分钟。
14)弃上清，空气干燥5-10分钟(不能完全干燥)15)溶于DEPC水中至20μl(10μl-20μl)(可在55-60℃水中，＜10分钟，助溶)(2)逆转录反应依次按以下步骤进行1)按下表配备试剂(稀释10倍后用)。
试剂 浓度(μg/μl) 体积(μl)RNA11.5Oligo(dT)150.0522)混匀，离心，70℃，5min。
3)立即冰水浴，稍离心。
4)按下表配备试剂试剂浓度 体积(μl)终浓度M-MLV Buffer5× 4 1×dNTP10mM 1 0.5mMRNasin 40U/μl 0.5 20UM-MLV 200U/μl 1 200UddH2O 13.55)混匀，离心，42℃，60min。
6)95℃，10min(破坏MLV)。
7)4℃保存(3)cDNA的PCR反应1)反应体系如下表试剂 浓度 体积(μl)Taq Buffer 10×2MgCl225mM 1.2dNTP 10mM 0.2上游引物 12.5pmol/μl 0.5下游引物 12.5pmol/μl 0.5cDNA模板2ddH2O 13.3Taq酶 2.5U/μl 0.32)PCR扩增的引物上游5′-CAT GCC ATG GAT CCC TCT CGC AAG GAC GGT C-3′下游5′-CCG GAA TTC TTA AGG AGC CCT TTT AGA CCT-3′PCR反应条件94℃预变性3min，94℃变性35sec、58℃复性30sec、72℃延伸55sec，34个循环后72℃延伸10min。
(4)扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳分析2、重组免疫毒素SRα真核表达质粒的预处理(1)用限制性内切Nco I及EcoRI双酶切SRα真核质粒，反应体积20μl(其中含有Nco I酶1μl、EcoRI酶1μl、10×NEbuffer2 2μl、SRα真核质粒10μl、ddH2O 6μl)，37℃过夜(内切酶均购自New England公司)；还可选用限制性内切酶Sal I对SRα真核质粒进行酶切。
(2)反应后用1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统的紫外灯照射下，按胶回收试剂盒(购自Omiga公司)的方法回收大片段。
3、IP10与SRα真核表达质粒的连接及转化
(1)将上述步骤中所获得的载体片段及插入片段粗略定量后，按插入片段∶载体分子摩尔数比＝3～10∶1的连接反应原则进行连接实验；(2)反应体系如下表，整个反应过程在PCR仪中16℃过夜。连接反应时应分别设立无插入片段和无载体的对照管。使上述扩增的IP10基因片段插入到含有DT390片段的SRα真核质粒中，IP10基因片段与DT390片段通过Nco I酶切位点连接，与SRα真核质粒通过EcoR I酶切位点连接，构建成重组质粒(结果见图1)。连接酶可选用T4(T4DNAligase)。
试剂 体积(μl)ddH2O 1110×buffer 2IP102SRα 4T4DNA ligase1Total Volume20(3)将连接产物分别转化大肠杆菌JM109的感受态细胞。连接产物的转化方法按《分子克隆操作指南》进行，主要步骤如下A、取连接产物4μl加入感受态细胞30μl置于1.5ml Ep管中，阴性对照为感受态细胞30μl置于1.5ml Ep管中；B、置于冰上30min，每隔几分钟轻弹；C、42℃水浴30Sec；D、冰上放置3min；E、加0.3ml SOC培养基(10ml SOC+50μl 2mol/L Mgcl2)，置于冰上；F、37℃，250rpm振摇1小时；G、取50μl转化细胞+5μl 0.1g/ml Amp，均匀涂布于含Amp的平板，置37℃孵箱培养过夜。
4、限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析，以保证重组质粒中IP10插入片段的正确性。
5、IP10-DT390真核表达质粒在NIH3T3细胞中的表达
(1)在转染前24h，将NIH3T3细胞(购自TaKaRa公司)接种于六孔培养板中，每孔细胞约1×106，置于37℃5％CO2孵箱培养；(2)待细胞长满至约80-90％融合后，分别以SRα空质粒及IP10-DT390 SRα质粒转染真核细胞NIH-3T3，具体操作按Qiagen公司脂质体转染试剂盒中的说明书进行；(3)质粒转染后72h，收集细胞。将变性后的蛋白质marker和转染后细胞裂解上清液在5％的浓缩胶和10％的分离胶中进行SDS-PAGE电泳；(4)电泳完备后，将凝胶上的蛋白质电转移到硝酸纤维素滤膜上，电转移后的膜用封闭液(约10％的PBS脱脂奶粉)封闭处理2h，再加入IP10多克隆抗体应用液作用1h，充分洗涤后再加入酶标二抗兔抗羊IgG，作用1h。最后加底物显色。
实施例2体外重组免疫毒素IP10-DT390的生物活性测定1、流式细胞仪测定其细胞毒性(1)在无菌操作台上取小鼠脾脏，用RPMI1640培养基制成脾细胞悬液，与conA(10ug/ml)混合培养；(2)培养3天后，加入上述转染上清按原液1/2、1/4、1/8、1/20、1/50稀释的浓度，50μl/孔，各浓度设立三复孔；(3)继续培养24h，收集细胞，流式细胞仪测定免疫毒素IP10-DT390分别对活化T、Th1、Th2细胞和B细胞的细胞毒性(CD4+T细胞膜表面标记；IFN-γTh1细胞内标记；IL-4Th2细胞内标记；CD19+B细胞膜表面标记)；(4)流式细胞仪测定结果显示，T细胞及Th1细胞数目下降40％-60％，而对Th2及B细胞无此影响(如图2所示)。由此表明重组免疫毒素IP10-DT390具有较好的靶向特异性。
2、转染上清中IP10-DT390对效应细胞的细胞毒作用(MTT法)(1)效应细胞的准备6-8周龄，20g左右雌性C57BL/6小鼠眼球放血后处死，无菌解剖剥离脾脏，用注射器针芯轻压脾组织，加入RPMI1640培养基，收集离心，获得脾细胞的悬液，并调整细胞浓度为5×106/ml，常规接种于细胞培养瓶，加入含ConA的RPMI1640培养基(ConA终浓度为5μg/ml)，37℃，5％CO2孵箱培养，培养72小时后，收集悬浮生长被ConA激活的淋巴细胞作为效应细胞(2)将收集的效应细胞浓度调整至1×106/ml，加入96孔细胞培养板，100μl/孔，再分别将收集的上述转染上清按原液1/2、1/4、1/8、1/20、1/50稀释的浓度加入，50μl/孔，各浓度设立三复孔。
(3)于37℃，5％CO2孵箱中共同培养24小时、48小时后，分别取出培养板，每孔加20μl MTT(5μg/ml)，继续培养4小时，将培养板以1000转/分离心5min，小心去除上清，每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，充分混匀，37℃放置20min，使结晶物充分溶解，在酶标仪上测定各孔光吸收值(波长570nm)，按下列公式计算细胞活性 (4)结果显示细胞转染上清对小鼠活化T细胞具有较强的细胞抑制效应，共育48小时的抑制效应高于24小时，且该抑制效应具有剂量依赖关系，即随着上清稀释度的增加而抑制效应随之降低(结果见图3)。
实施例3重组质粒对自身免疫性疾病动物模型EAE(experimental allergicencephalomyelitis)的初步治疗效果1、EAE(Experimental Allergic Encephalomyelitis)动物模型的建立根据常规方法用MBP免疫C57BL/6小鼠，建立EAE模型。
(1)用C57BL/6小鼠建立EAE动物模型，将自提的MBP粗提液与FCA(内含结核分枝杆菌5mg/ml)等体积混和，使用3ml注射器反复推拉成为油包水的乳剂，采用腹腔注射的方法。
(2)免疫剂量每只小鼠注射MBP∶FCA(1∶1)混和液0.4ml，百日咳杆菌菌液PBS(1∶50)混和液0.2ml(内含百日咳杆菌0.6-1.8×106个)。
(3)对照组每只小鼠腹腔注射百日咳杆菌菌液与PBS混和液0.2ml(内含百日咳杆菌0.6-1.8×106个)。
(4)免疫时间第1天、第7天免疫两次。
2、重组质粒对EAE模型的初步治疗(1)用IP10-DT390重组质粒对EAE动物模型进行治疗试验治疗时间在MBP免疫小鼠后第1天、第3天分别治疗2次；治疗方法使用阳离子脂质体包被的IP10-DT390重组质粒，采用试验小鼠大腿肌肉注射的方式；治疗剂量50μg/只。
(2)观察治疗后治疗组及未治疗组的症状表现，根据临床评分标准进行打分(Kono分级法)，具体为0分没有任何临床症状；1分动物尾部无力；2分动物尾部无力+前肢或后肢中等无力；3分前肢或后肢严重无力，人为翻身后不能恢复；4分肢体麻痹，人为翻身后不能恢复；5分濒死状态(有关结果如图4所示)。
(3)处死动物并取脑组织及骨髓做病理切片，经HE染色后镜下观察病理改变(如图5所示)。
结果显示，动物模型临床评分显示，其治疗组与未治疗组均有明显差异(p＜0.05)。病理切片显示，治疗组与未治疗组比较，小脑及脊髓脱髓鞘病变减轻；脑膜下及血管周围淋巴细胞浸润减少。总之，动物试验初步结果表明经重组免疫毒素IP10-DT390质粒治疗后，EAE动物模型的临床症状有明显缓解作用。
SEQUENCE LISTING<110>四川大学<120>针对活化Th1细胞的重组免疫毒素IP10-DT390的质粒及制备方法与应用<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1410<212>DNA<213>小鼠<400>1ggcgctgatg atgttgttga ttcttctaaa tcttttgtga tggaaaactt tgctagctac60cacgggacta aacctggtta tgtagattcc attcaaaaag gtatacaaaa gccaaaatct120ggtacacaag gaaattatga cgatgattgg aaagggtttt atagtaccga caataaatac180gacgctgcgg gatactctgt agataatgaa aacccgctct ctggaaaagc tggaggcgtg240gtcaaagtga cgtatccagg actgacgaag gttctcgcac taaaagtgga taatgccgaa300actattaaga aagagttagg tttaagtctc actgaaccgt tgatggagca agtcggaacg360gaagagttta tcaaaaggtt cggtgatggt gcttcgcgtg tagtgctcag ccttcccttc420gctgagggga gttctagcgt tgaatatatt aataactggg aacaggcgaa agcgttaagc480gtagaacttg agattaattt tgaaacccgt ggaaaacgtg gccaagatgc gatgtatgag540tatatggctc aagcctgtgc aggaaatcgt gtcaggcgat cagtaggtag ctcattgtca600tgcataaatc ttgattggga tgtcataagg gataaaacta agacaaagat agagtctttg660aaagagcatg gccctatcaa aaataaaatg agcgaaagtc cggccaaaac agtatctgag720gaaaaagcta aacaatacct agaagaattt catcaaacgg cattagagca tcctgaattg780tcagaactta aaaccgttac tgggaccaat cctgtattcg ctggggctaa ctatgcggcg840tgggcagtaa acgttgcgca agttatcgat agcgaaacag ctgataattt ggaaaagaca900
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权利要求
1.一种针对活化Th1细胞的重组免疫毒素质粒，其特征在于将IP10 cDNA碱基序列片段插入含有白喉毒素DT390 cDNA碱基序列活性片段的SRa真核质粒中用连接酶连接而成。
2.如权利要求1所述的针对活化Th1细胞的重组免疫毒素质粒质，其特征在于所说的连接酶选用T4连接酶。
3.一种权利要求1至2所述重组组免疫毒素质粒的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤(1)将动物的IP10基因进行扩增；(2)将上述扩增的IP10基因片段插入到含有DT390片段的真核质粒中构建重组质粒，再将重组质粒转染至感受态细菌中进行扩增，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；(3)利用限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析，以保证重组质粒中IP10插入片段的正确性。
4.如权利要求3所述的重组免疫毒素质粒的构建方法，其特征在于构建重组质粒选用的质粒载体有SRα、pSecTag2。
5.如权利要求3或4所述的重组免疫毒素质粒的构建方法，其特征在于限制性内切酶选用SalI、NcoI及EcoRI。
6.如权利要求3或4所述的重组免疫毒素质粒的构建方法，其特征在于IP10基因用RT-PCR扩增。
7.权利要求1至2所述重组组免疫毒素质粒在制备治疗自身免疫系统疾病药物中的应用。
8.权利要求1至2所述重组组免疫毒素质粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。
9.权利要求1至2所述重组组免疫毒素质粒在制备治疗移植排斥反应药物中的应用。
全文摘要
通过基因工程技术构建重组免疫毒素IP10－DT390的高效表达质粒。它是一种特异针对活化Th1细胞的新型重组免疫毒素质粒(IP10－DT390)，转染入体内后表达高度特异性的重组免疫毒素，以IP10为导向分子，白喉毒素的活性片段DT390为毒素分子，选择了活化Th1细胞的特异性膜受体CXCR3(IP10受体)为靶点。该免疫毒素质粒的制备方法包括重组质粒的构建、重组质粒转染的工程菌的制备等步骤。该质粒表达的重组免疫毒素具有严格的靶向性，即通过IP10的导向作用特异攻击活化的Th1细胞，诱导特异性免疫耐受，从而避免了无选择性地杀伤所有T细胞，特别适合于自身免疫性疾病和器官移植排斥反应的防治，亦可应用于某些肿瘤的治疗。
文档编号A61K48/00GK1641035SQ20041008139
公开日2005年7月20日 申请日期2004年12月3日 优先权日2004年12月3日
发明者张 林, 陈文捷, 李虹, 贾怡, 李明远 申请人:四川大学