专利名称：抑制慢性粒细胞白血病中stat5活性的诱骗寡核苷酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及诱骗寡核苷酸及其应用，尤其是信号转导子和转录激活子5(以下简称STAT5)诱骗寡核苷酸及其在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
背景技术：
慢性粒细胞白血病(以下简称CML)的发生是由于t(9；22)(q34；qll)所致的BCR/ABL融合基因编码产生了具有强烈酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白，该蛋白导致血细胞的异常增殖和恶性转化，但细胞恶性转化的具体机制还不甚清楚。大量资料显示，这与BCR/ABL酪氨酸激酶激活细胞内一些重要信号传导分子如PI3K(Phosphatidylinositol-3kinase)、Ras(Renin-angiotensin system)、STAT(Signal transducer and activator of transcription)等有关。其中，STAT5在BCR/ABL转化细胞过程中的作用越来越为人们所重视。
信号转导子和转录激活子(简称STAT)蛋白家族包括七个成员STAT1-6，其中STAT5又分为STAT5a和STAT5b两种组分(到目前为止，未发现两者在DNA结合特异性上有任何区别)。它们在正常细胞内既能将胞外信号传递至核内，又能启动相关基因表达，在细胞的增殖、分化和凋亡等生理过程中起重要作用。其中STAT3、STAT5的异常激活与细胞恶性转化有密切关系，但在CML中未见有STAT3激活的报道。有资料显示在CML细胞中，BCR/ABL融合蛋白可以直接持续(组成型)激活胞浆中的游离STAT5单体，使其磷酸化并形成二聚体，转入核内与靶基因上相应的序列结合，从而启动靶基因表达。现在所知，抗凋亡蛋白Bcl-xL、癌蛋白c-Myc、细胞周期促进因子CyclinD1蛋白等基因的启动子上有STAT5特异性结合序列，都可能被STAT5反式激活而异常表达。这些效应蛋白一方面促进细胞周期进展，另一方面抑制细胞凋亡，在细胞恶性转化过程中起关键性作用。可见，组成型激活的STAT5在BCR/ABL癌蛋白与Bcl-xL、c-Myc等癌蛋白之间起着重要的中介作用。
CML的治疗方法中，传统的放、化疗疗效差且副作用大，最有效的方法是异基因造血细胞移植术，但由于供者有限及受病人年龄等条件限制，现在西方国家中接受该法治疗者仅占初诊病人的5％，我国的这一比例则更低。目前，针对BCR/ABL融合基因及其蛋白进行靶点治疗是国内外CML研究的热点，如针对BCR/ABL融合基因的反义寡核苷酸和核酶的应用以及蛋白酪氨酸激酶特异性抑制剂STI571的开发等。但这些方法都各有其不足反义寡核苷酸和核酶抑瘤效果不稳定且难以应用于体内；而STI571的应用可使部分病人产生耐药性和潜在的骨髓抑制、淋巴细胞功能损害等问题。另外，有体外实验资料显示随着时间的进展和突变的积累，被抑制的BCR/ABL下游信号通路会重新激活，表现在细胞由BCR/ABL依赖性生长转变为BCR/ABL非依赖性生长。这都说明仅针对BCR/ABL进行靶点治疗有其局限性。因此，为了对CML进行根治性综合治疗，从BCR/ABL致细胞转化的机理入手，寻找新的治疗靶点和治疗方法有重要的现实意义。
转录因子诱骗(transcription factor decoy)策略是近年发展起来的一种阻断基因转录的有效方法。其原理是体外合成一段8-30bp经修饰的双链脱氧寡核苷酸，大量转染细胞后，竞争性抑制特定转录因子与基因组DNA序列上的相应顺式元件结合，从而达到阻止靶基因转录的目的。现主要用于心血管疾病、病毒感染性疾病以及肿瘤等的基因治疗研究。该策略有操作简单，易于进行体内实验和效应明显等优点。并且有资料显示，该策略对癌细胞抑制作用明显，但对正常细胞影响甚微，具有良好的应用前景。
目前，现有技术中尚没有用于治疗慢性粒细胞白血病的STAT5诱骗寡核苷酸药物。
发明内容
鉴于目前现有慢性粒细胞白血病靶点治疗技术的缺陷，本发明的目的之一是提供一种以STAT5为靶点的治疗慢性粒细胞白血病的诱骗寡核苷酸。
本发明的目的之二是提供上述STAT5活性诱骗寡核苷酸在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
本发明的目的是这样实现的，根据文献(Ehret GB，et al.DNA BindingSpecificity of Different STAT Proteins.Comparison of in vitro specificity withnatural target sites.J.Biol.Chem，2001，2766675-6688.以及Soldaini E，et al.DNA Binding Site Selection of Dimeric and Tetrameric Stat5Proteins Revealsa Large Repertoire of Divergent Tetrameric Stat5a Binding Sites.Mol.Cell.Biol.2000，20389-401.)结合我们的前期实验结果设计合成以STAT5为治疗靶点抑制慢性粒细胞白血病的诱骗寡核苷酸，其序列为5′-AGATTTCTAGGAATTCAAATC-3′3′-TCTAAAGATCCTTAAGTTTAG-5′；所述两条诱骗寡核苷酸链须等摩尔混合退火成双链。
所述序列进行硫代修饰。
上述STAT5诱骗寡核苷酸用于制备治疗慢性粒细胞白血病的药物，可以将体外合成经修饰的双链脱氧寡核苷酸(Decoy ODNs)，大量转染细胞后，竞争性抑制特定转录因子与基因组DNA序列上的相应顺式元件结合，从而阻止靶基因转录，达到抑制癌细胞生长的目的。
本发明与现有技术中反义寡核苷酸和核酶以及蛋白酪氨酸激酶特异性抑制剂STI571相比具有如下优点和特色1、它作用的靶点不同，因此可以作为CML综合性治疗的另一个候选药物，可以单独应用或与其他药物联合应用，增强治疗效果、减少毒副作用。
2、它可以同时抑制相关转录因子下游的所有靶蛋白的表达，特异性好、效应明显、技术成熟，如已有NF-kappa B、E2F等多个诱骗寡核苷酸药物被美国FDA(Food and DrugAdministration，食品与药品管理局)批准进入III期临床实验。
3、根据STAT5Decoy ODN的作用原理可知，它在其他STAT5异常激活的肿瘤，如前列腺癌等也有应用前景。
发明人以慢性粒细胞白血病K562细胞作为实验模型，应用分子生物学、细胞生物学、实验血液学、实验动物学等方法，进行了一系列实验，研究了STAT5诱骗寡核苷酸对K562细胞的抑制作用。
实验方法
1.诱骗寡核苷酸(以下简称Decoy ODNs)设计与合成设计与STAT5结合的序列Decoy ODNs，将一致性序列(TTC...GAA)改变了2个碱基的序列做为突变序列寡核苷酸(以下简称Mutant ODNs)，经GenBank检索，未查到与其它基因有高度同源性。
Decoy ODNs5′-AGATTTCTAGGAATTCAAATC-3′3′-TCTAAAGATCCTTAAGTTTAG-5′Mutant ODNs5′-AGATTTGTAGCAATTCAAATC-3′3′-TCTAAACATCGTTAAGTTTAG-5′序列中划线部分为突变序列。序列全硫代修饰，由上海博亚公司合成并纯化。
合成的寡核苷酸(简称ODNs)用乙二胺四乙酸(简称TE)溶液溶解，配制成260μM。等摩尔混合，在聚合酶链反应(以下简称PCR)仪上退火形成双链温度从95℃逐渐降至25℃，每15分钟降低5℃，历时3小时。
2.细胞培养K562细胞系是慢粒白血病细胞株，第三军医大学基础免疫教研室馈赠。K562细胞用含10％胎牛血清的PRMI 1640培养基培养于含5％CO2的37℃恒温孵箱中，常规换液传代，实验前24h换液，取生长期细胞做实验。
3.诱骗核苷酸转染试验寡核苷酸和脂质体分别按照1∶4比例在两管中以无血清1640中稀释，静置30min后将两者轻轻混匀，静置15min。加入以无血清1640洗涤并调整好细胞数的K562细胞悬液，轻轻混匀置37℃孵育4～6h，加入含10％胎牛血清的1640培养液继续培养。
4.生长曲线实验取生长期细胞，洗涤后重悬于无血清的RPMI-1640培养液中，调整细胞数为1×105/孔，使用5μM、15μM、25μM三种Decoy ODNs处理浓度，用脂质体转染K562细胞，连续5天每天以台盼蓝染色后计数活细胞数目，每次计数重复3次，以平均值绘制生长曲线。
5.噻唑蓝(简称MTT)实验收集对数生长期的K562细胞，利用脂质体转染，接种于96孔培养板，细胞终密度为2×104/孔，分别加入Decoy ODNs和Mutant ODNs序列，终浓度为5μM、15μM、25μM，每个浓度做3个平行孔，每孔总体系200μl，以脂质体处理而不加寡核苷酸的细胞孔做对照组，试剂空白以无血清RPMI-1640培养液补足。置37℃，含5％CO2孵箱中培养72小时，在每组的3个平行孔中加入四甲基偶氮唑蓝(MTT，浓度为0.5mg/ml)，置37℃、含5％CO2孵箱中继续培养4小时，1000g离心10分钟，小心弃去上清，加入二甲基亚砜200μl，振荡5分钟，用酶标仪在570nm处读取吸光度值(A值)。细胞增殖抑制率＝(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100％。
6.细胞周期测定以15μM Decoy ODNs处理1×106个K562细胞，24h后收集细胞，PBS洗两次后，70％乙醇中固定过夜，上机前洗去乙醇，加入PCB溶液低渗处理室温30分钟，离心去上清，加入50μg/ml RNAseA消化30分钟，再加入终浓度为50μg/ml的PI染液室温避光孵育25分钟，用流式细胞仪FCM检测。结果见表1。
表1 DecoyODNs对K562细胞周期各期比例的影响(％)
*表示与未处理组比较P＜0.05**表示与其它两组比较P＜0.05K562细胞的细胞周期分析结果表明Decoy ODNs处理细胞24h后，与未处理细胞和Mutant ODNs处理组的细胞相比，G0/G1期细胞比例增高，S期细胞比例下降，差别有统计学意义(P＜0.05)。提示Decoy ODNs处理后阻滞了细胞周期由G0/G1期向S期推进。Mutant ODNs未明显影响细胞周期进程。
7.Annexin-V/PI双染法检测凋亡调整K562细胞数为5×105/ml，加入15μM Decoy ODNs处理24小时后收集细胞，经PBS洗两次后，重悬于100μl反应缓冲液中，加入5μl Annexin V-FITC及10μl的PI，轻轻混匀，避光保存20min，加入200μl PI缓冲液，立即上FCM检测。
8.反转录-聚合酶链反应(简称RT-PCR)
用Trizol试剂提取K562细胞的总RNA。定量后进行逆转录反应，PCR反应条件为c-myc94℃45秒，58.1℃1分钟，30个循环，72℃10分钟。
bcl-xL94℃45秒，67℃1分钟，30个循环，72℃10分钟。
cyclin D194℃45秒，58.1℃1分钟，30个循环，72℃10分钟。
GAPDH94℃45秒，58.1℃1分钟，27个循环，72℃10分钟。
反应结束后PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，在Bio-Rad凝胶成像仪上观察结果并照相。
9.蛋白印迹提取K562细胞总蛋白并以Bradford法定量后进行SDS-PAGE电泳，积层胶浓度5％，分离胶浓度10％，以80V电泳，直至溴酚蓝进入分离胶后以100V电压继续电泳约2小时。电泳结束后半干转移15V转移2小时。最后DAB试剂显色。结果用扫描仪进行扫描，软件分析灰度值，结果以目的条带的灰度与内参条带的灰度之比表示。
10.动物实验五周龄的雌性Balb/c-nude裸小鼠(购于上海斯莱克实验动物有限公司)，体重16-18g，在SPF(specific pathogen free)级层流饲养间以高压灭菌食物和水饲养。为了增加K562细胞致瘤率，裸鼠先用Sli Precise直线加速器(Elekta公司，瑞典)行全身照射，每只裸鼠总剂量300cGy。取对数生长期的K562细胞用PBS洗涤2次，离心浓缩，调整密度为5×107/ml，在每只裸鼠的右腋下皮下注射0.2ml，继续饲养。5天后，共有11只裸鼠右腋下长出水疱样肿瘤，将其中10只随机分为两组Mutant ODN组5只，Decoy ODN组5只。隔天以游标卡尺测量瘤体的长径与宽径，并以公式V＝1/2×(a2×b)计算瘤体体积，其中V为体积(mm3)，a为宽径(mm)，b为长径(mm)。从第10天起每3天向瘤体内注射1次脂质体-ODN混合物(浓度同细胞周期实验)，每次每只瘤体内注射0.1ml，共注射4次，22天时断颈快速处死裸鼠，钝性分离取出瘤体，称重、照相后置液氮中保存。
11.统计学处理实验独立重复三次，结果用平均值±标准差表示，以SPSS10.0软件分析，多组数据间用单因素方差分析，两两比较用t检验。
下面结合附图对本发明及实验结果进一步说明图1显示了Decoy ODNs对K562细胞生长曲线的影响；图2显示了Decoy ODNs和Mutant ODNs对K562细胞的抑制率；图3显示Annexin-V实验检测Decoy ODNs处理K562后细胞的凋亡。
图4显示Decoy ODNs处理对K562细胞bcl-xL、cyclin D1、c-myc mRNA的影响。
图5显示Decoy ODNs处理对K562细胞bcl-xL、cyclin D1、c-myc蛋白的影响。
图6显示了K562荷瘤裸鼠的肿瘤生长曲线。
图7显示了Decoy ODN对K562瘤体的抑制作用。
各图中Decoy表示诱骗寡核苷酸处理组；Mutant表示突变寡核苷酸处理组；Control表示对照组；Cell number表示细胞数；Inhibition rate表示抑制率；目的基因/GAPDH表示不同的目的基因条带与内参基因GAPDH条带的灰度比值；目的蛋白/actin表示不同的目的蛋白条带与内参蛋白actin条带的灰度比值；bcl-xL表示抗凋亡蛋白Bcl-xL；c-myc表示癌蛋白c-myc；CyclinD1表示细胞周期素D1；Concentration表示寡核苷酸浓度；Tumor size表示肿瘤体积。
请看图1，Decoy ODNs对K562细胞生长的抑制随Decoy ODNs浓度的增大而增大。由生长曲线看出，5μM浓度对K562细胞的生长抑制不明显；而15μM DecoyODNs对K562细胞有明显抑制生长作用，处理后K562细胞数仅有缓慢的增长；25μM处理浓度明显抑制了K562细胞生长。
请看图2，5μM Decoy ODNs处理3d后对K562细胞的抑制率为15％，15μM处理浓度抑制率达到51％，25μM处理浓度抑制率达82％。说明了Decoy ODNs对K562细胞的增殖抑制呈剂量依赖性，浓度越高，抑制作用也越明显。Mutant ODNs也随着浓度的增大对K562细胞的抑制增强，但在与相同浓度Decoy ODNs比较，抑制率明显低下，5μM为6％，15μM为10％，25μM为18％。
请看图3横坐标FL1代表FITC标记的Annexin-V荧光强度，纵坐标代表PI强度。依据FL1及FL2将FCM分成4各区，LL代表活细胞，LR代表早期凋亡细胞，UR、UL代表晚期凋亡和死细胞。图3a，未处理组大部分细胞都是活细胞，早期凋亡细胞只有1.32±0.53％。图3b，Decoy ODNs转染K562细胞24h后即有14.57±1.08％早期凋亡细胞。图3c，Mutant ODNs基本上不影响K562细胞的凋亡，早期凋亡细胞只有4±2.02％。
请看图4Decoy ODNs转染K562细胞24h，收集细胞做RT-PCR，bcl-xL、cyclinD1、c-myc mRNA在Decoy ODNs处理后表达下调，经密度分析后，以各目的条带和内参GAPDH的密度相比，bcl-xL下降了54.04％，cyclin D1下降了45.30％，c-myc下降了53.60％。
请看图5Decoy ODNs处理48h后，bcl-xL、cyclin D1、c-myc蛋白表达水平都不同程度下调。将各目的条带与内参actin的灰度相比，Decoy ODNs作用48h后，bcl-xL下降36.58％、cyclinD1下降了31.04％、c-myc下降了49.70％。
图6中，图中数值为代表性肿瘤三次体积测定值±SD，可见与Mutant ODN组相比，Decoy ODN组肿瘤体积明显受到抑制(P＜0.05)。
图7中上行为Mutant ODN组瘤体，下行为Decoy ODN组，称重后发现，Decoy ODN组肿瘤重量明显低于Mutant ODN组(P＜0.05)。
实验结果表明1、STAT5诱骗寡核苷酸可以有效抑制体外培养的K562细胞生长增殖。
2、STAT5诱骗寡核苷酸对K562细胞的抑制作用主要是通过抑制细胞周期进展和促进细胞凋亡而发挥作用的。
3、STAT5诱骗寡核苷酸对K562细胞的抑制作用在一定浓度范围内呈浓度依赖性。
4、STAT5诱骗寡核苷酸可以有效抑制实验动物模型中K562细胞所致实体瘤的生长。
5、STAT5诱骗寡核苷酸在体内体外均能抑制慢性粒细胞白血病K562细胞的生长增殖，为STAT5诱骗寡核苷酸在制备临床治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用提供了充分的实验依据。
具体实施例方式
分别合成5′-AGATTTCTAGGAATTCAAATC-3′3′-TCTAAAGATCCTTAAGTTTAG-5′两条链，均经过全硫代修饰，等摩尔混合，在PCR仪上从95℃缓慢降至25℃退火形成双链的STAT5诱骗寡核苷酸。上述STAT5诱骗寡核苷酸用于制备治疗慢性粒细胞白血病的药物，诱骗寡核苷酸的浓度为5～25μmol/L。
权利要求
1.一种抑制慢性粒细胞白血病中STAT5活性的诱骗寡核苷酸，其序列为5′-AGATTTCTAGGAATTCAAATC-3′3′-TCTAAAGATCCTTAAGTTTAG-5′；所述两条诱骗寡核苷酸链须等摩尔混合退火成双链。
2.根据权利要求1所述的抑制慢性粒细胞白血病中STAT5活性的诱骗寡核苷酸，其特征在于所述序列进行硫代修饰。
3.根据权利要求1或2所述的抑制慢性粒细胞白血病中STAT5活性的诱骗寡核苷酸，其特征在于所述STAT5诱骗寡核苷酸在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述STAT5诱骗寡核苷酸的终浓度为5～25μmol/L。
全文摘要
本发明属于一种抑制慢性粒细胞白血病中STAT5活性的诱骗寡核苷酸及其应用，该诱骗寡核苷酸的序列为5′－AGATTTCTAGGAATTCAAATC－3′3′－TCTAA AGATCCTTAAGTTTAG－5′；所述两条诱骗寡核苷酸链须等摩尔混合退火成双链，并进行硫代修饰。将该STAT5诱骗寡核苷酸用于制备治疗慢性粒细胞白血病的药物，可以把体外合成经修饰的双链脱氧寡核苷酸(Decoy ODNs)，大量转染细胞后，竞争性抑制特定转录因子与基因组DNA序列上的相应顺式元件结合，从而阻止靶基因转录，达到抑制癌细胞生长的目的。
文档编号A61P35/02GK1769447SQ20041008122
公开日2006年5月10日 申请日期2004年11月5日 优先权日2004年11月5日
发明者王小中, 冯文莉, 史梅, 曾建明 申请人:重庆医科大学