专利名称：一种慢性粒细胞白血病干祖细胞发病相关分子发现的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种构建慢性粒细胞白血病人原代干祖细胞模型，并由此建立分析慢性粒细胞白血病干祖细胞基因数据库，从而发现慢粒发病干祖细胞中未知肿瘤相关分子。
目前，在人的慢性粒细胞白血病中，p210BCR/ABL是在BCR启动子的调控下表达的，理想的模型应采用BCR的启动子，但BCR/ABL癌基因对于胚胎发育中的嵌入小鼠及转基因小鼠都是致死的，因此，此类的模型没有成功的报道。而只有人干祖细胞癌基因诱导的信号传递才能真正代表慢粒的病理发生发展过程。本研究成功地了慢性粒细胞白血病原代干祖细胞模型和慢性粒细胞白血病干祖细胞基因数据库，分析了慢性粒细胞白血病干祖细胞基因数据库，发现了新的慢粒样原代干祖细胞中肿瘤相关分子，并鉴定了其在慢粒发生中的分子功能及意义。并有效地再现人慢粒的异常细胞表型。而以抑制PCR为基础的cDNA削减杂交方法和基因芯片技术的应用为实现该基因表达数据库研究提供了良好的途径。
本发明的目的是在国际上首次提出利用慢性粒细胞白血病人原代干祖细胞模型建立分析慢性粒细胞白血病干祖细胞基因数据库，从而对白血病发病分子机制有进一步的了解，发现未知肿瘤相关分子，以此设计药物以阻断肿瘤分子靶位点以达到治疗白血病的目的。
本发明是通过下述方法实现的一、构建载体并建立慢性粒细胞白血病原代干祖细胞模型(1)建立逆转录病毒载体及转染系统从IRES上游克隆完整p210BCR/ABLcDNA，构建逆转录病毒载体MSCV-p210BCR/ABL-IRES-eGFP及不含p210的对照载体。用PCL-快速转染系统获得高滴度病毒上清，用于靶细胞转染。
(2)高效转染BCR/ABL癌基因原代干祖细胞从脐带血中分选CD34+Lin-细胞，在多种因子条件下培养，利用多病毒转导系统将p210重组载体及对照载体转入靶细胞。24小时后用FACS分选eGFP CD34+细胞。
(3)建立慢性粒细胞白血病原代干祖细胞模型采用RT-PCR检测转染细胞p210癌基因mRNA水平的表达；Western免疫化学法检测p210在eGFP阳性的实验组及对照组细胞内的表达。
(4)慢性粒细胞白血病原代干祖细胞模型的鉴定再现p210对细胞粘附的作用；再现p210对细胞迁移的作用；再现p210对原有丝分裂原活性的作用；再现p210延缓凋亡的作用；再现p210对细胞分化的作用；再现p210对增殖抑制的作用；再现p210调节信号传导及细胞周期分子。
二、构建及分析人慢性粒细胞白血病原代干祖细胞cDNA基因数据库1、构建人慢性粒细胞白血病原代干祖细胞cDNA文库。
2、制备特异性探针。
3、以同位素标记特异性探针筛选文库，得到实验组细胞特异表达基因克隆，扩增，测序得基因全长。
4、将目的基因装入表达载体，选择适当宿主细胞表达。
5、研究表达产物的生物学性质。
6、以原代干祖细胞模型与无癌基因整合的相应对照细胞为实验对象，采用基因芯片技术，展示慢粒干祖细胞基因表达图谱。基因包括转录因子与染色小体结合蛋白基因；细胞表面分子基因；分泌蛋白基因；信号分子基因等类别。
三、发现与探索新的慢粒样原代干祖细胞中肿瘤相关分子，分析和鉴定其在慢粒发生中分子功能及意义1、发现与研究与Betal integrin家族同源新的信号分子，探讨粘附减弱是由哪一个Betal integrin家族的剪接异构体信号分子引起的。
2、发现与研究与Fax，paxillin，Crkl和CBL等主要粘附分子同源新的信号分子，探讨粘附减弱是由哪一个潜在的粘附分子家族同源信号分子引起的。
3、发现与研究与细胞骨架分子同源新的信号分子，研究细胞骨架家族信号分子是否是粘附减弱的原因。
4、设计并克隆新的信号分子，获得信号分子的全序列。
5、用Northern blot分析其拷贝数和组织特异表达形势。
6、构建基因表达载体，在293细胞中该信号分子高效表达。
7、采用FN包被粘附实验，测定此分子的粘附功能效应的研究。
8、进行此信号分子的细胞肿瘤转化研究。
9、发现了一种p210BCR/ABL转染的的慢粒样原代干祖细胞模型中的肿瘤相关分子类凋亡抑制剂(apoptosis inhibitor)，是凋亡抑制剂的新的异构体，是由RNA拼接所形成的新的凋亡抑制剂家族成员。本发明的优点1、通过对慢性粒细胞白血病人原代干祖细胞模型的研究发现了p210转导CD34+细胞后，上调了的活性，而BCR/ABL的诱导使转位于细胞浆内，因而造成胞核定位障碍不能抑制含的干细胞的细胞周期，从而使之通过G1期而进入细胞循环。
2、通过此模型的研究通过此模型，还发现了多种慢粒样原代干祖细胞中肿瘤相关分子，并分析和研究了其在慢粒发生中的分子功能和机制。
3、本研究还成功地构建了人慢性粒细胞白血病干祖细胞cDNA基因数据库，从而为慢性粒细胞白血病的药物治疗提供了有效的靶基因。
4、本研究发现的多种与慢性粒细胞白血病相关基因和致白血病的癌基因特异性相关分子对于慢性粒细胞白血病发生发展的病理机制的研究和治疗都有着重要的意义，必将对慢性粒细胞白血病的最终治愈有重大的贡献。类凋亡抑制剂(apoptosis inhibitor)2341bpgaaaccatgg tcaggtggtc tcttacctgt taaaatcagg agctgacaaa gaaaagttggcgacatggtg gcacccgtgc tggagacttc tcacgtgttt tgctgcccaa accgggtgcggggagtcctg aactggagct ctgggcccag aggacttctg gcctttggca cgtcctgctccgtggtgctc tatgaccccc tgaaaagggt tgttgttacc aacttgaatg gtcacaccgcccgagtcaat tgcatacagt ggatttgtaa acaggatggc tccccttcta ctgaattagtttctggagga tctgataatc aagtgattca ctgggaaata gaggataatc agcttttaaaagcagtgcat cttcaaggcc atgaaggacc tgtttatgcg gtgcatgctg tttaccagaggaggacatca gatcctgcat tatgtacact gatcgtttct gcagctgcag attctgctgttcgactctgg tctaaaaagg gtccagaagt accaatatta gcatgtggca atgatgattgcagaattcac atatttgctc aacaaaatga tcagtttcag aaagtgcttt ctctctgtggacatgaggat tggattagag gagtggaatg ggcagccttt ggtagagatc ttttcctagcaagctgttca caagattgcc tgataagaat atggaagctg tatataaagt caacatctttagaaactcag gatgacgata acataagact gaaagaaaat acttttacca tagaaaatgaaagtgttaaa atagcatttg ctgttactct ggagacagtg ctagccggtc atgaaaactgggtaaatgca gttcactggc aacctgtgtt ttacaaagat ggtgtcctac agcagccagtgagattatta tctgcttcca tggataaaac catgattctc tgggctccag atgaagagtcaggagtttgg ctagaacagg agagtggact ccagagattg tcatttcaggacactttgatggtgtcc aagacctagt ctgggatcca gaaggagaat ttattatcac tgttggtactgatcagacaa ctagactttt tgctccatgg aagagaaaag accaatcaca ggtgacttggcatgaaattg caaggcctca gatacatggg tatgacctga aatgtttggc aatgattaatcggtttcagt ttgtatctgg agcagatgaa aaagttcttc gggttttttc tgcacctcggaattttgtgg aaaatttttg tgccattaca ggacaatcac tgaatcatgt gctctgtaatcaagatagtg atcttccaga aggagccact gtccctgcat tgggattatc aaataaagctgtctttcagg gagatatagc ttctcagcct tctgatgaag aggagctgtt aactagtactggttttgagt atcagcaggt ggcctttcag ccctccatac ttactgagcc tcccactgaggatcatcttc tgcagaatac tttgtggcct gaagttcaaa aactatatgg gcacggttatgaaatatttt gtgttacttg taacagttca aagactctgc ttgcctcagc ttgtaaggcagctaagaaag agcatgcagc tatcattctt tggaacacta catcttggaa acaggtgcagaatttagttt tccacagttt gacagtcacg cagatggcct tctcacctaa tgagaagttcttactagctg tttccagaga tcgaacctgg tcattgtgga aaaagcagga tacaatctcacctgagttcg agccagtttt tagtcttttt gccttcacca acaaaattac ttctgtgcacagtagaatta tttggtcttg tgattggagt cctgacagca agtatttctt cactgggagtcgagacaaaa aggtggttgt ctggggtgtg tgcgactcca ctgatgactg tattgagcacaacattggcc cctgctcctc agtcctggac gtgggtgggg ctgtgacagc tgtcagcgtctgcccagtgc tccacccttc tcaacgatac gtggttgcag taggattgga gtgtggaaagatttgcttat atacctggaa aaagactgat caagttccag aaataaatga ctggacccactgtgtagaaa caagtcaaag ccaaagtcat acactggcta tcagaaaatt atgctggaagaattgcagtg gaaaaactga acagaaggaa gcagaaggtg ctgagtggtt acactttgcaagctgtggtg aagatcacac tgtgaagata cacagagtca ataaatgtgc actgtaatggactt
权利要求
1.一种利用慢性粒细胞白血病人原代干祖细胞模型建立分析慢性粒细胞白血病干祖细胞基因数据库的方法，其特征在于用基因嵌入法将p210癌基因整合到造血干祖细胞染色体构建慢性粒细胞白血病原代干祖细胞模型，以此模型与无癌基因整合的相应对照细胞为实验模型，采用削减杂交方法并结合基因芯片技术，展示慢粒干祖细胞胞基因表达数据库，进而探索基因特异性相关分子致白血病发病机制。
2.根据权利要求1所述的一种p210BCR/ABL转染的的慢粒样原代干祖细胞模型中的肿瘤相关分子类凋亡抑制剂(apoptosis inhibitor)，一种凋亡抑制剂新的异构体(isoform)。保扩的内容类凋亡抑制剂基因序列相应的氨基酸序列，类凋亡抑制剂的基因产物及其衍生物，及含有部分或全部该基因片段的基因产物及其衍生物；保护参照该序列所设计的靶序列阻断、封闭或加强作用的基因、蛋白质以及细胞水平的物质结构。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于成功地构建了人慢性粒细胞白血病干祖细胞cDNA基因数据库。通过与无癌基因整合的相应对照细胞的比较，并结合cDNA削减杂交方法和基因芯片技术，发现了多种与慢性粒细胞白血病相关的基因，从而为慢性粒细胞白血病的药物治疗提供了有效的靶基因。
全文摘要
本发明公开了慢性粒细胞白血病人原代干祖细胞模型的构建后,由此分析并建立慢性粒细胞白血病干祖细胞基因数据库,从而发现了一种慢粒发病干祖细胞中未知肿瘤相关分子。本发明涉及了人慢性粒细胞白血病原代干祖细胞基因数据库的构建及分析。发现的一种与慢性粒细胞白血病相关基因和致白血病的癌基因特异性相关分子对于慢性粒细胞白血病发生发展的病理机制的研究和治疗都有着重要的意义。
文档编号C12Q1/68GK1361244SQ00136049
公开日2002年7月31日 申请日期2000年12月26日 优先权日2000年12月26日
发明者赵春华 申请人:赵春华