一种抗艾滋病毒的中药组合物、其制备方法及用途的制作方法

专利名称：一种抗艾滋病毒的中药组合物、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有黄芩提取粉、茜草提取粉、人参皂甙粉和冬虫夏草粉的药物组合物。本发明进一步涉及所述的药物组合物的制备方法以及所述的药物用于治疗艾滋病的用途。
背景技术：
黄芩为清热燥湿药，为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi的根，主要含黄酮类成分，主要作用有抗炎、抗过敏、抗病原微生物、解热及解毒等作用。茜草，又名茜根、血见愁、活血草，为茜科植物茜草Rubia cordifolia L的干燥跟及根茎，茜草含有的主要成分是脂溶性成分蒽醌、还原蒽醌以及它们的糖甙和水溶性成分环己肽类，另外尚富含钙离子等等，其有凉血止血、化瘀行血、抗癌、抗病原微生物等作用。人参根味甘、微苦、性温，具有调气养血、安神益智、生津止咳、滋补强身之功效，被誉为“百草之王”，在中国自古就是调理身体的优选药物。而冬虫夏草为子囊菌麦角科虫草属冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc的子座及其宿主蝙蝠科昆虫虫草蝙蝠蛾Hepialus armoricanus oberthur的幼虫尸体的复合体。冬虫夏草含粗蛋白、脂肪、粗纤维、碳水化合物、灰分、虫草酸、冬虫夏草素、虫草多糖、核苷类、肽类、二十烷等，主要有益精壮阳、扶正益气、补肾平喘、强身延年的作用，同时还有抗炎、抗心律失常、抗肿瘤的作用。
许多实验表明，人参可提高动物与人的体力及智力活动能力，并能增强机体对各种有害刺激的非特异性抵抗力，在治疗剂量下对正常生理功能无干扰亦无副作用，是一类有益无害的全身性强壮滋补药。
在发现人参的上述药物作用的基础上，科技工作者对人参提取物进行了研究，发现在人参中起作用的主要含30多种人参皂甙，如Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg、Rh1、Rh2、F2，和拟人参甙F1，RTs及西洋参皂甙LI等，这些人参皂苷的药理研究主要有抗衰老作用、增强免疫功能的作用、降低血脂的作用，并能引起心脏及血管的一些改变。但迄今为止，尚没有关于人参、人参提取物或任何一种人参皂苷能治疗艾滋病的公开。艾滋病即“人类获得性免疫缺损”综合症疾病的简称。其病原为“艾滋病毒(HIV)”，主要侵犯人体免疫系统，尤其是CD4淋巴细胞，最后摧毁机体免疫功能，引发条件性感染，導致死亡。
抗艾滋病毒药物的研究，第一个被报道的是苏拉明(Suramin)，1985年发现AZT具有体外抗艾滋病毒的活性，1986年进行了临床研究，1987年AZT作为第一个被美国批准用于治疗艾滋病的药，其主要问题是毒性和抗药性，以后又有其它药物出现，到目前为止被美国批准的抗艾滋病毒药有20个，按其作用机理主要属于三类，除2002年底批准的T20是作用于阻断病毒进入细胞内，其它均是即病毒逆转酶抑制剂，如AZT、DDC、DDI等，和病毒蛋白酶抑制剂，其中后者在美国FDA批准了5种药物，分别是沙奎那维(saquinavir)、利托那韦(ritonavir)、indinavir硫酸盐、奈非那韦(nefinavir)等，1995年，美国科学家采用两种逆转酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂联合用药，即现在应用的高活性抗逆转酶疗法(HAART)，组合的药称之为“三联”，此疗法提高了疗效，进一步延长了病人寿命，至今应用6-7年，尚有少数病人活存。
目前我国已有三种药配制HAART疗法的药，但只有抗逆转录酶的药物，缺乏抑制蛋白酶的药物，而且毒性很大，有近20％的病人不能服用。因此在应用中仍面临毒性和抗药性问题。如前所述，T20虽然可以阻断病毒进入细胞，但由于T20是一种肽类，不能口服，只能注射，且价格十分昂贵。因此迫切需要毒性小的抗艾滋病毒药物。
祖国医药是一个伟大的宝库，值得挖掘发扬。发明人经过十多年的研究，找到一些中药提取物或组分或单一成分具有确切的抗艾滋病毒的活性，研究了其抗艾滋病毒作用的靶点，并明显提高机体免疫功能，具有比HAART价格便宜、毒性小等的优势，而且由于HAART疗法有抗药性，需要不断更新治疗组合的药物，因此，中药治疗艾滋病具有广阔的临床应用前景。

发明内容
本发明人发现含有黄芩提取粉、茜草提取粉、人参皂甙粉和冬虫夏草粉的药物组合物具有明显的治疗艾滋病的作用。
因此，本发明一方面涉及一种药物组合物，其含有黄芩提取粉、茜草提取粉、人参皂甙粉和冬虫夏草粉，优选地，以100份组合物计，所述的黄芩提取粉的含量范围为10～30重量份，所述的茜草提取粉的含量为10～25重量份，所述的人参皂甙粉的含量范围为18～25重量份，所述的冬虫夏草粉的含量范围为30～55重量份。
在所述的组合物中，优选地，所述的黄芩提取粉的含量为18重量份，所述的茜草提取粉的含量为17重量份，所述的人参皂甙粉的含量范围为18重量份，所述的冬虫夏草粉的含量为47重量份。
在上述组合物中，所述的提取粉为醇提粉，可以为任何现有技术获得的提取粉，所述的黄芩提取粉、茜草提取粉优选按照下述方法制备，而人参皂甙粉可以是符合质量标准的市售品，优选的标准是人参皂甙粉中含有Rb115～20wt％，Rb215～20wt％，Rb330～90wt％，Rc30～90wt％。所述的冬虫夏草粉可以为天然药用粉或人工培养的冬虫夏草粉。
本发明另一方面涉及一种制备所述的药物组合物的方法，包括以下步骤a.将黄芩的生药粉碎，加入4～5倍的乙醇浸泡至少6小时；将浸泡的原料药与浸泡液一起倒入渗滤罐进行渗滤，渗滤的速度为3～4.5ml/kg.分钟-1；再加入乙醇，同时进行渗滤，使得收集到的渗滤液为相当于生药重量的10～20倍；收集并浓缩渗滤液，使得与水相比，最终获得的浓缩液的重量比为水∶浓缩液＝1∶1.1～1.35；将上述浓缩液喷雾干燥成黄芩提取粉；同时或先后b.将茜草的生药粉碎，加入4～5倍的乙醇浸泡至少6小时；将浸泡的原料药与浸泡液一起倒入渗滤罐进行渗滤，渗滤的速度为3～4.5ml/kg.分钟-1；再加入乙醇，同时进行渗滤，使得收集到的渗滤液为相当于生药重量的10～20倍；收集并浓缩渗滤液，使得与水相比，最终获得的浓缩液的重量比为水∶浓缩液＝1∶1.1～1.35；将上述浓缩液喷雾干燥成茜草提取粉；c.按100重量份计，将10～30份黄芩提取粉、10～25份茜草提取粉、18～25份人参皂甙粉和30～55份冬虫夏草粉混合获得权利要求1的药物组合物。上述方法中所用的乙醇优选为30～70％，更优选50％。
本发明再一方面涉及上述药物组合物用于制备抗艾滋病毒的药物中的用途。
所述的药物组合物可以与抗艾滋病毒药联合应用。所述的抗艾滋病毒药是优选是AZT、DDC、DDI、沙奎那维(saquinavir)、利托那韦(ritonavir)、indinavir硫酸盐、奈非那韦(nefinavir)。
所述的药物组合物的给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。
本发明药物组合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。其它载体如聚丙烯酸树脂类、脂质体，水溶性载体如PEG4000和PEG6000、PVP等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明药物组合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。
例如，将本发明组合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。
此外，如需要，也可以向组合物中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药，优选口服给药。
本发明的药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如艾滋病患者病程的严重程度，患者的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药物成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明组合物的每天的合适剂量范围为0.03～0.50mg/Kg体重/天。上述剂量可以分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。


图1显示ZL-1治疗病人6个月后CD4变化情况示意图。
图2显示ZL-1猴体内试验CD4+淋巴细胞动态变化。
图3显示本发明药物组合物对猴感染SIV后病毒增殖的抑制作用。
图4显示茜草(CD)、人参皂甙(JH)以及本发明组合物(ZL-1)的作用靶点的研究。
图5显示本发明药物组合物对CXCR4、CCR5辅助受体的作用。
图6本发明组合物组分之一JHR作用于CD4受体的检测结果。
图7显示茜草(CD)对gp41(穿膜蛋白)的结合作用，图7B显示人参皂甙(JHR)对gp41的结合作用具体实施方式
以下结合附图描述本发明。
实施例1本发明药物组合物的制备取180kg黄芩、150kg茜草生药，粉碎，加入50％乙醇1400L浸泡6小时；将浸泡的原料药与浸泡液一起倒入渗滤罐进行渗滤，渗滤的速度为3～4.5ml/kg.分钟-1；陆续分次加入乙醇，继续进行渗滤，收集到4000L渗滤液；通过回收乙醇浓缩渗滤液，使得与水相比，最终获得的浓缩液的重量比为水∶浓缩液＝1∶1.1～1.35；将上述浓缩液喷雾干燥成粉；黄芩和茜草的提取粉的收率分别为8～10％和10～15％，因此，所获得的干燥粉相当于18kg黄芩提取粉、17kg茜草提取粉。并将获得的干燥粉与18kg人参皂甙粉和47kg冬虫夏草粉混合得到本发明组合物ZL-1，采用本领域技术人员公知的方法加入适量药用载体制成本发明的胶囊粉，然后装入胶囊待用。每粒胶囊中含有本发明组合物为约0.5g。
实施例2取180kg黄芩生药，粉碎，加入50％乙醇720L浸泡6小时；将浸泡的原料药与浸泡液一起倒入渗滤罐进行渗滤，渗滤的速度为3～4.5ml/kg.分钟-1；再陆续50％的乙醇，继续进行渗滤，收集到渗滤液2200L；通过挥发乙醇浓缩渗滤液，使得与水相比，最终获得的浓缩液的重量比为水∶浓缩液＝1∶1.1～1.35；将上述浓缩液喷雾干燥成粉，得到18kg黄芩提取粉。
取150kg茜草生药，粉碎，加入40％乙醇600L浸泡6小时；将浸泡的原料药与浸泡液一起倒入渗滤罐进行渗滤，渗滤的速度为3～4.5ml/kg.分钟-1；陆续加入40％的乙醇，继续进行渗滤，收集到渗滤液1800L；通过挥发乙醇浓缩渗滤液，使得与水相比，最终获得的浓缩液的重量比为水∶浓缩液＝1∶1.1～1.35；将上述浓缩液喷雾干燥成粉，获得17kg茜草提取粉。
将获得的干燥粉与18kg人参皂甙粉和47kg冬虫夏草粉混合得到本发明组合物ZL-1，装入胶囊待用。
实验例1本发明药物组合物的临床实验患者来源2002年在河南省新蔡县、商丘对1000例病人治疗后，抽取60例病人的血液，样本选择点对象为1992年至1995年间因卖血感染爱滋病的人员，共60人，其中男19人，女41人，年龄最大58岁，最小27岁，平均年龄38.9岁，均为农民。其中59个丙型肝炎抗体检测为阳性，7人梅毒PPR检验为阳性，2人合并肺结核感染，乙肝检验均为阴性。
服药方法每天3次，每次4粒，口服。
1.治疗前后病毒载量变化分别于治疗前和治疗后6个月抽取病人血，离心取血浆，-80℃保存，检测时按罗氏(Rocher)RNA定量PCR仪器及试剂盒要求的方法先提取RNA，用罗氏仪器检测病毒载量，结果见表1。
表1ZL-1治疗后病毒载量(VL)的变化

2.治疗前后P24抗原量的变化采用Microelisa方法及试剂，测定上述标本中的P24抗原量，结果见表2。
表2ZL-1治疗后HIV P24抗原的变化

从表2的结果可以看出，服用本发明的药物组合物以后，病人血浆中的病毒载量在治疗6个月后明显下降，及维持不变的达70％，30％仅轻微上升。
3.治疗前后CD4检测情况对所采的血液标本采用流式细胞仪对其全血进行CD4检测，结果见表3。
表3.60例病人的CD4检测情况

从表3结果可以看出，经本发明药物组合物治疗以后，病人血中的CD4明显上升，表明本发明药物组合物可以明显提高病人血中的CD4水平。服药后一个月CD4增加一倍，继续服药，CD4持续上升，6个月时增加了156.7％，CD4接近300，常规标准CD4在200以下为病人，200以上向正常恢复。
另外，目前国内艾滋病人应用的辅助药物，其批准的标准为必须50％或以上的病人CD4数量的增加30％以上，本发明人还对经本发明药物组合物ZL-1治疗6个月后全血中的CD4进行检测，结果见图1。从图1中可以看出，本发明组合物有86％的病人CD4增加超过30％，有80％的病人的CD4增加超过50％，……甚至有37％的病人CD4数量增加了400倍。
4.对上述60例病人治疗前后临床指征变化的观察，结果见表4A、4B。
表4A

表4B


以上数据表明临床症状及指征明显改善。
5.本发明药物组合物的体内毒性实验(1)急性毒性实验结果给大鼠灌胃给药，大于20克/公斤未见任何毒性。
(2)亚急性毒性实验结果给大鼠连续灌胃6个月后，大、中、小三个剂量组的大鼠生长情况正常，ALT、BUN、RBC、WBC及白细胞分类均正常，病理切片表明心、肝、肾、脾、肺、胰、脑、睾丸、卵巢等脏器未见异常。
6.安全性评价体外治疗指数检测，见表5。
表5

实验例2本实施例描述一典型病例，倪××，辽宁人，32岁，经本发明药物组合物治疗前后病毒载量的变化情况，见表6，其中的服药方法同实施例1的描述。
表6用本发明药物组合物治疗的一例病人的病毒载量变化

实验例3本发明药物组合物的药效学研究体外实验分别用HIV-1病毒感染三种细胞(MT4，Hela-CD4，PBMC)，观察根据实施例1制备的药物ZL-1对HIV-1复制的抑制作用。
(1)MT4细胞病毒HIV-1，NL4株方法将实施例1的药物组合物配制成1mg/ml的浓度，进行实验时稀释成不同浓度备用。①在96孔培养板进行实验，于各孔加入100μl药液，每个浓度药液至少设两个孔。另取新鲜培养的MT4细胞，每管5×105细胞，加HIV-1病毒1×103TCID50/ML，37℃二氧化碳培养箱中培养，两小时后离心，弃去上清，再用RPMI1640洗一次，去除游离的病毒，加培养基到5×105/1ml。于96孔板每个加有药的孔中加入100μL此感染HIV-1的细胞(5×104/100μL)二氧化碳培养箱中37℃培养。第三天换药，于孔中吸出100μL上清，加入100μL与本孔相同浓度的新鲜药液，对照组加入100μL培养基。第六天，各孔取上清，采用Microelisa方法及试剂，测定P24抗原量。每次实验设病毒对照，细胞对照及AZT阳性药对照，根据所测P24抗原量按下列公式计算抑制率 不同浓度药液所得的不同抑制率，经统计处理，求得半数制率量(IC50)。
(2)Hela—CD4细胞病毒HIV的单一生活周期的报告病毒(Single-life-cycle reportervirus)由带HIV质粒转染而得。
方法24孔板接种Hela-CD4-LTR--gal细胞0.4×105/孔，放置24小时，使之吸附，贴壁，第二天，吸去孔中上清，加100ul药(药对照)或药及HIV-1(可不同浓度药液)或培养基(Mock)，两小时后各孔加入200μl相同药液或培养基，CO2培养箱37℃培养48小时，按下列方法检测。
固定各孔吸去上清加入固定液(1ml)再以K4[Fe(CN)6]·3H2O，K3[Fe(CN)6]及X-gel染色。
计数每孔兰色细胞数以下列公式计算抑制率，再计算IC50。
(3)PBMC细胞病毒NL4-3方法以医院中新鲜取得的PBMC(人外周血新分离的淋巴细胞)，计数、离心1200rpm弃去上清，配成3×106细胞/ml。所用培养基应加入IL2.(1000×的IL2按每ml培养基中加入1μl)37℃过夜。实验以5×106为一感染单位，JHR浓度为0.4mg/ml相同浓度设两孔，病毒对照两孔，细胞对照也设两孔，24孔板每孔5×106细胞在0.5ml药液或培养基中，NL4.3病毒(HIV-1)，病毒量为每孔加入4×104IU，吹打均匀，转入12孔板，再加入相同药液或培养基，1.5ml，使总量为2ml，37℃培养，每3-4天取上清，每孔取100μl，放-80℃保存，全部收集完测定RT，药物组与病毒对照组比较计算抑制率。
所得结果如下MT4细胞株半数抑制量IC50＝139μg/mlHela-CD细胞株半数抑制量IC50＝54.8μg/mlPBMC细胞(本发明组合物组分之一JHR)(人外周血新分离的淋巴细胞)服药6天的半数抑制量IC50＝77μg/ml。
结果表明ZL-1在体外试验中对HIV-1有明显的抑制作用。
实验例4本发明药物组合物对恒河猴的治疗作用实验动物实验用恒河猴，4.5～5.5Kg，雌雄各半，共10只，购自中国医学科学院实验动物研究所灵长类繁殖中心，用商品化膨化饲料饲养。实验前经体检无异常，经血清学间接免疫荧光(IFA)抗体检查法检查排除潜在的猴免疫缺陷病毒(SIV)，猴逆转录D型病毒(SRV)和猴T淋巴细胞性I型病毒(STLV-I)的感染。
感染毒株和剂量用美国Aaron Diamond艾滋病研究中心darx博士赠与的SIVmac251病毒株，每只动物用相当于3MID100病毒剂量的病毒液1ml静脉感染。
药物及实验治疗方案ZL-1和AZT均由本发明人提供，剂型为胶囊。动物分AZT阳性药物治疗组和SIVmac251感染对照组，每组动物3～4只，雌雄各半。ZL-1治疗组动物在病毒感染前10天开始给药，每日给药一次，一次2粒胶囊，经口服用，连续不间断给药70天；AZT阳性药物对照组动物在病毒感染后30分钟开始给药，每动物每日给药一次，每次100mg经口服用，连续不间断给药60天。SIVmac251感染对照组不给药治疗。
感染前后观察感染前除一般体检外，称体重，采血(作感染前的各项指标检查)。感染和治疗后继续做一般观察和检查，并按程序定时采血测定血浆病毒滴度、血液中CD4+淋巴细胞数和抗体滴度。60天实验结束后，处死动物。
血浆病毒分离动物感染SIVmac251后，选择第7、11、14、21、28、42、60天采取血样，肝素抗凝分离血浆，血浆分别从200μl开始以5倍递减量稀释于24孔板内，以10％小牛血清RPMI-1640补至每孔1ml，然后加入105个SIVmac251敏感细胞株CEMX174细胞液0.6ml，置37℃CO2孵箱，每3-4天观察和细胞传代一次。以接种最小量的标本仍然出现典型的细胞融合病变为标本的病毒滴度。每标本接种8个滴度即200ul、40ul、8ul、1.6ul、0.32ul、0.064ul、0.0128ul和0.00256ul，各相当于每毫升血浆SIV病毒5、25、125、625、3125、15625、78125和390625个TCID值。标本观察3周判定病毒分离结果。
血液中CD4+淋巴细胞数测定选择动物实验前和感染SIVmac251后第14、28、42、60天采取血样标本，Ficoll淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞，用直接荧光标记抗CD4单克隆抗体染色后，上机FACS计数得到CD4+淋巴细胞百分率，结合普通血象检查的白细胞总数和分类结果，计算出血液中含CD4+淋巴细胞的总数。
1.药物治疗前后恒河猴体内CD4+淋巴细胞动态变化结果结果如图5、表7所示。


以上结果表明猴感染SIV后，病毒量上升的同时，CD4细胞数急剧下降，而ZL-1治疗组在感染后2，4周时，可保护45-48％细胞不受病毒侵害，而AZT组35％细胞受保护，6，8周后ZL-1治疗组仍有32-38％细胞受到保护.
2.药物治疗前后恒河猴体内病毒量的变化结果如表8、图3所示。
表8恒河猴治疗实验(恒河猴感染SIVmac251，为急性感染)药后周数 1 2 3 4抑制率(％) 17.0％ 80.2％ 70.7％ 70.2％结果表明祛毒增宁对恒河猴感染的SIV有明显的抑制作用。
传统治疗艾滋病药物AZT有明显抑制SIV的作用，抑制率达90％以上，本发明药物组合物也有明显的抑制作用，在所用的剂量下，可使抑制率维持在70～80％。
实验例5本发明药物组合物作用靶点1.病毒生活周期中作用阶段的检测目的观察本发明药物组合物作用于病毒生活周期哪个或哪几个阶段，包括病毒进入细胞，逆转录酶、整合酶、转录、蛋白酶。应用病毒“单一生活周期”(single life cycle)模型研究药物作用靶点。
(1)MAGI法合病毒为重组病毒，以HIV的LTR，使β-半乳糖苷酶报告基因得以表达，形成病毒的一种“单一生活周期”的模型。此模型如前述用Hela-CD4细胞以K4[Fe(CN)6]、K3[Fe(CN)6]、x-gel染色，显微镜下蓝色细胞表示带有病毒基因。
(2)Luciferase法采用重组、转染的VSVG病毒，细胞系用H9细胞株，检查方法采用发光法检测Luciferase的活性，病毒量多则此酶活性高。
实验方法细胞感染病毒后设不同组，分别于感染后0，6，12，18，24，36小时加药，作用至感染后48小时，分别进行MAGI或Luciferase法检测。
以上两种检测方法均为病毒“单一生活周期”模型，其最大优点是感染的不同时间表示病毒繁殖的不同阶段。2-6小时是病毒进入细胞，10-14小时是逆转录阶段，20小时以后是整合、转录阶段。故不同时间给药其抑制作用表示作用于何靶点。本发明实验对JHR和Rb3的作用靶点进行了分析。
结果见图4所示，结果表明ZL-1作用于阻断病毒进入细胞，以及逆转录酶及整合酶诸阶段。ZL-1组合物中的茜草提取物(CD)仅对病毒进入及逆转录酶阶段有作用，而人参皂甙(JHR)对病毒进入及整合酶阶段有作用，表明组合物优于单一提取物。
2.作用于辅助受体CXCR4CCR5的检测实验使用MAGI法进行方法同上，检测CXCR4受体用嗜T淋巴细胞，病毒用NL4，检测CCR5受体用嗜M淋巴细胞，病毒用YU2.
结果见图5。
从图5中可以看出，本发明组合物对CXCR4辅助受体、CCR5辅助受体均有抑制作用，则表明其作用可能在嗜T及嗜M淋巴细胞共同有的CD4受体或者病毒与细胞的融合过程，而不是此两辅助受体本身。
3.作用于CD4受体的检测本研究使用本发明组合物组分之一JHR进行。
使用流式细胞仪的方法进行测试。方法如下采用SupT1细胞与药物37℃共同培育2小时，以PBS+2％FCS洗涤，于4℃冰浴条件加CD4PE放置30分钟，洗涤，离心后加CD4单抗，冰浴中培育30分钟，洗涤，离心，冰浴条件，悬浮于50ul的二抗Ab抗-小鼠-FITC中20分钟，洗涤一次，悬浮于300-500ul的PBS/2％CS+PI中，FACS(进行流式仪检测)。检测结果见图6。
结果表明JHR对CD4受体无作用。
4.作用于病毒跨膜蛋白gp41的检测本研究采用本发明组合物成分之一茜草(CD)和JHR进行。其对gp41(穿膜蛋白)的结合作用的结果见76A、6B。将基因重组的gp41分别置于BIACORE检测仪的芯片上，分别加入一定浓度的茜草或JHR提取物，仪器即检测出是否与之结合。作为组合物组分致之一的茜草(CD)和JHR与病毒的gp41都有结合作用。
实验例6本发明药物组合物与其他治疗爱滋病药物的联合用药目的观察ZL-1与AZT有无协同作用采用ZL-1组成药物之一JHR进行。
方法实验采用MAGI+est方法(如前)①单独用药AZT从1uM至3.9nM，设五个剂量AZT1-5JHR-1从400ug/ml至1.56ug/ml，设五个剂量分别求得IC50②合并应用以AZT与JHR-1各1/2量相加为一个样品AZT1分别与JHR1-JHR5五个组合AZT2、AZT3、AZT4、AZT5亦分别与JHR-1-JHR-5五个组合，故为25个浓度组合，每个浓度设两孔，另设细胞、病毒对照。
③以各药物组合与病毒组比较，求得抑制率。以各药物组合抑制率与单独AZT IC50比较作用增减。
以下表9显示本发明药物组合物JHR-1与AZT的联合用药结果。
表9

从表9可以看出，本发明药物组合物与AZT具有协同药物作用。最大剂量组可增效7.9倍。
实验例7本发明药物组合物组分之一对HIV蛋白酶抑制剂抗性毒株的抑制作用本发明人进一步研究了本发明药物组合物对HIV蛋白酶抑制剂抗性株的抑制作用。
HIV-1对一种蛋白酶抑制剂形成的抗性株，毒力为5.7×104IU/ml，采用Hela-CD4细胞，MAGI实验方法观察JHR的作用，有无交叉抗性，结果JHR剂量为0.4mg/ml，病毒5ul或8ul抑制率均达100％，表明对白酶抑制剂形成的抗性株也有作用，结果见表10。
表10

*PRIV是蛋白酶抑制剂的抗性株病毒。
权利要求
1.一种药物组合物，其含有黄芩提取粉、茜草提取粉、人参皂甙粉和冬虫夏草粉的，其特征在于以100重量份组合物计，所述的黄芩提取粉的含量范围为10～30重量份，所述的茜草提取粉的含量为10～25重量份，所述的人参皂甙粉的含量范围为18～25重量份，所述的冬虫夏草粉的含量范围为30～55重量份。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中在所述的组合物中，所述的黄芩提取粉的含量为18重量份，所述的茜草提取粉的含量为17重量份，所述的人参皂甙粉的含量范围为18重量份，所述的冬虫夏草粉的含量为47重量份。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述的黄芩提取粉、茜草提取粉或人参皂甙粉为醇提取粉，所述的冬虫夏草粉为天然药用粉或人工培养的冬虫夏草粉。
4.一种制备如权利要求1所述的药物组合物的方法，包括以下步骤a.将黄芩的生药粉碎，加入4～5倍的乙醇浸泡至少6小时；将浸泡的原料药与浸泡液一起倒入渗滤罐进行渗滤，渗滤的速度为3～4.5ml/kg.分钟-1；再加入乙醇，同时进行渗滤，使得收集到的渗滤液为相当于生药重量的10～20倍；收集并浓缩渗滤液，使得与水相比，最终获得的浓缩液的重量比为水∶浓缩液＝1∶1.1～1.35；将上述浓缩液喷雾干燥成黄芩提取粉；同时或分别b.另将茜草的生药粉碎，加入4～5倍的乙醇浸泡至少6小时；将浸泡的原料药与浸泡液一起倒入渗滤罐进行渗滤，渗滤的速度为3～4.5ml/kg.分钟-1；再加入乙醇，同时进行渗滤，使得收集到的渗滤液为相当于生药重量的10～20倍；收集并浓缩渗滤液，使得与水相比，最终获得的浓缩液的重量比为水∶浓缩液＝1∶1.1～1.35；将上述浓缩液喷雾干燥成茜草提取粉；c.按100重量份计，将10～30份黄芩提取粉、10～25份茜草提取粉、18～25份人参皂甙粉和30～55份冬虫夏草粉混合获得权利要求1的药物组合物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的乙醇为30～70％的乙醇。
6.根据权利要求1～3所述的药物组合物用于制备抗艾滋病毒的药物中的用途。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述的药物组合物可以与抗艾滋病毒药联合应用。
8.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述的抗艾滋病毒药是AZT、DDC、DDI、沙奎那维、利托那韦、indinavir硫酸盐、奈非那韦。
全文摘要
本发明涉及一种含有黄芩提取粉、茜草提取粉、人参皂甙粉和冬虫夏草粉的药物组合物。本发明进一步涉及所述的药物组合物的制备方法以及所述的药物用于治疗艾滋病的用途。
文档编号A61K36/068GK1754559SQ20041008051
公开日2006年4月5日 申请日期2004年9月30日 优先权日2004年9月30日
发明者李泽琳, 曾越, 曾毅, 曾欣 申请人:北京世纪康医药科技开发有限公司