专利名称：清除hiv病毒、治疗艾滋病的聚乙酰精宁的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有四氢呋喃环和五元内酯环特征结构的聚乙酰宁类化合物。
番荔枝内酯(Annonaceous acetogenins)是一类番荔枝科植物特有的聚乙酰精宁类化合物，这类化合物的第一个化合物uvaricin[Joladet al.，J.org.Chem.，473151-3153，(1982)]被发现以来，至今近200个化合物被发现，这些化合物具有一个、二个或三个四氢呋喃环和一个饱和的或不饱和五元内酯环，并表现有对棉蚜、蚊幼虫线虫等害虫有杀虫活性，对KB细胞、qPS、3PS、A-549、MCF-7、L-1210等癌细胞株有较强的抑制作用。Mikolajczak等1988年和1989年先后取得了两项用于控制害虫的美国发明专利[U，S.Patent NO.4721727，Jan.26，1988；U.S.Patent NO.4855319，Aug.8，1989]，Mclaughlin等在1993年取得一项治疗肿瘤化疗药物的美国应用专利[U，S.PatentAppl.，serial no.07/336233，field April，11.1989]。其发明专利化合物模式如下
A可取以下形式
和
R1R2可选取H，H；H，OH；H，OAC和＝0。R1R2氧化取代总数≤6。
m＝9～15，n＝10～18，r＝，w＝1或2。
自80年代发现首例艾滋病病例以来，艾滋病已在全球蔓延，被称为“世纪瘟疫”。十多年来死于HIV感染/艾滋病及相关并发症的人数已近1400万人，目前仍有约4000万的HIV感染/艾滋病患者。目前临床治疗HIV感染/艾滋病患者的药物如病毒逆转录的抑制剂、病毒DNA整合酶抑制剂、病毒蛋白酶抑制剂等都是针对病毒粒子的药物，不能清除被整合到宿主细胞染色体DNA链中的病毒DNA，因此患者必须终生用药以控制病毒复制，由于这些药物对正常细胞同样有伤害，有较大的付作用；HIV病毒通过突变来逃避或对抗药物的作用，即长期用药HVI病毒将会对药物产生抗药性。
本发明的目在于提供一种清除HIV病毒治疗艾滋病的聚乙酰精宁，其作用机理完全不同于目前临床治疗HIV感染/艾滋病及其他病毒性感染疾病的治疗药物，该药物对SIV(急性猴免疫缺陷病毒)、HIV感染的细胞有强烈的抑制病毒复制、清除病毒的作用。
本发明化合物的结构模式为
F可选取以下形式
和
X、Y可选取H，H；H，OH；H，OAC和＝0A＝4～12，B＝5～15，D＝1、2或3包括在结构模式(I)中，其化合物可从番荔枝(Annona sqamosaL.)刺果番荔枝(Annona muricata L.)、澳洲番荔枝(Annonacherimolia，ex squamosa)、海南哥纳香(Goniothalamus howii Merr.etChun)的种子或树叶中得到。他们含有一个四氢呋喃环或二个相邻接的四氢呋喃环或三个连成线状排列邻接的四氢呋喃环，一个带有甲基的α、β一不饱和或饱和的五元环内酯或带有丙酮基的五元环内酯，并由5～15个CH2组成的碳链连接在一起，两侧的碳链上通常具有羟基、酮基、乙酰氧基基团取代。他们的化学结构式如下
R1＝H，R2＝OH阿诺宁甲(AnnoninI)(II)R1＝OH，R2＝H阿诺宁已(AnnoninVI) (III)
番荔枝西宁甲(squamosinin A)
新阿诺纳辛-10-酮(neo-annoacin-10-one)
海南哥纳香素已庚(howiicin FG)本发明的化合物抗HIV感染、治疗艾滋病其作用机理是攻击被感染细胞(抗原细胞)的辅酶系统、阻断其ATP合成，使原来处于ATP合成旺盛、大量复制病毒也耗费大量ATP的被感染细胞的代谢立即转变为缺外来能源、缺氧的内源性代谢，伴随胞内ATP贮存的耗竭，被感染的细胞必然走向凋亡，随着凋亡进程的启动，细胞的内源性DNA内切酶，蛋白质分解酶等，把病毒的DNA、RNA、功能蛋白等一一降解、清除。因此，本发明的化合物不仅抑制病毒的复制，而且能够把已被整合到宿主细胞染色体中的病毒DNA也清除掉。应用本发明制造的药物诱导被感染的细胞凋亡清除病毒的疗法，患者经过一段时间用药治疗，有可能达到临床治愈。
本发明的一些化合物体外抗SIV的作用试验结果见表1。其中化合物阿诺宁甲(II)、阿诺宁已(III)的效果最好，(II)在10-5ug/ml(1.61×10-5uM)时对抗原细胞抑制率94.3％，与AZT2uM的效果相当，(II)的抑制作用相当于AZT2uM的105倍，病毒滴度下降优于AZT，培养细胞未发现空洞、合胞体等病变，也优于对照的AZT。
表1，本发明化合物体外抗SIV活性试验样本号 浓 稀对细胞 抗原细胞 病毒滴 细胞病变 结果度 释毒 性 抑制率(％) 度下降(CPE)判定度 log21ug/ml 10-5+ 94.3 28-高度抑制(II)10-6+ 53.9 25+中度抑制10-7- 20.0 20+++ 无抑制
1ug/ml10-5+85.727-高度抑制(III) 10-6+59.625+中度抑制10-7-26.120+++ 无抑制1ug/ml10-3-48.621+无抑制或轻(V) 度抑制10-4-34.420+++ 无抑制10-5-5.7 20++++ 无抑制1ug/ml10-3-31.420+无抑制(VI) 10-4-25.720++++ 无抑制10-5-2.9 20++++AZT 2μM -94.127+高度抑制实验用细胞CEMX174细胞，SIV病毒与药物同时加入。
本发明体外抗SIV活性试验(续)样本号 浓稀对细胞抗原细胞病毒滴 细胞病变结果度释毒 性抑制率(％) 度下降 (CPE) 判定度 log21ug/ml 10-4- 57.127++ 中度抑制(II) 10-6- 20.020++，+++无抑制(III)1ug/ml 10-4+ 82.928+ 高度抑制10-6- 57 21++，+++无抑制(V) 1ug/ml 10-4+ 57.124++ 中度抑制10-6- 34.320+++无抑制1ug/ml 10-4- 80.025+ 中度抑制(VI) 10-6- 22.922++ 无抑制实验细胞为CEMX174细胞。SIV吸附细胞4小时后才加入药物。
下面结合实施例对本发明作详细描述。
实施例一植物材料提取产于海南省我国特有的番荔枝科植物海南哥纳香(Gonithalamushowii Merr.et Chun)种子自然晾干后捣碎(2.5Kg)，置渗漉器中，加石油醚(bp60～90℃)渗漉，渗出液(F001)20升。石油醚渗出液回收石油醚，至余下体积约3升时放置冷却，随后加80％乙醇(V/V)萃取，每次用500ml，共6次，3000ml。80％乙醇萃取部分浓缩物(F003)与丙酮渗出液(F002)液浓缩物合并为F004，进一步减压蒸除溶剂，加少量石油醚脱脂，残余物(F005)用丙酮溶解，与250克硅胶拌和，晾干，备用。
F005柱层析硅胶1.5Kg干法装柱，吸附F005的硅胶置于柱上端，顺次用以下洗脱液洗脱石油醚、石油醚一乙酸乙酯混合液(95∶5，90∶10，85∶15，80∶20，70∶30，50∶50)，乙酸乙酯，最后用乙醇洗脱，在石油醚一乙酸乙酯90∶10～50∶50洗脱部位得到了海南哥纳香素丁.戊.己和庚(howiicins D.E.FandG)。
海南哥纳香素已和庚(howiicins Fand G)混晶，白色针晶，mp85-87℃，[α]D+8.82°(C0.884，CHCl3)，C35H64O7，M＝596，1HNMR(600MHz，in CDCl3，δ ppm，JHZ)0.88(3H，t，J＝7)，1.39(3H，d，J＝6.6)，3.43(1H，m)，3.82(1H，m)，3.88(1H，m)，3.89(1H，m)，5.05(1H，q，J＝6.6)，7.18(1H，brs).13CNMR(100.614MHz，inCDCl3，δ ppm)174.63(3)，151.89(d)，131.14(s)，81.86(d，F)，81.81(d，G)79.34(d，F)，79.33(d，G)，78.01(d)，74.75(d，F)，74.53(d)，74.42(d，G)，74.38(d，F)，74.29(d，G)，69.89(d)，37.30(t)，35.45(t)，33.71(t)，33.51(t)，33.36(t)，32.41(t)，31.39(t)，30.45-29.10(t)，28.43(t)，26.13(t)，25.78(t)，25.75(t)，25.51(t)，22.70(t)，19.11(q)，14.12(q)，EI-MS.m/Z598(M++2)，381，363，351，333，315，281，263，239，221，197。
实施例二。
植物材料提取。
刺果番荔枝种子洗净晾干，捣碎后用石油醚(bp60-90℃)浸提，继用丙酮浸提，丙酮浸出液浓缩后残余物与硅胶粉拌和晾干，碾细，按样品丙酮抽出物(干)∶硅胶＝1∶30进行硅胶柱层析分离，用石油醚、不同比例石油醚一乙酸乙酯混合液作洗脱剂，先后得S1-S13共13个结晶。
S8新阿诺纳辛-10-酮(neo-annonacin-10-one)无色结晶，mp72.5-75℃，[α]D+17.3°(C＝1.15，CHCl3)+20°(C＝1.55，CH3OH)C35H62O7(M＝594)。1HNMR(300MHZ，inCDCl3，δ ppm，JHZ)0.84(3H，t，J＝7)，2.39(5H，m)，2.49(1H，dd，J＝14，3.2)，3.37(2H，m)，3.78(3H，m)，5.03(1H，dd，J＝6.8，1.5)，7.16(1H，d，J＝1.5)，13CNMR(100MHZ，inCDCl3，δ.ppm)211.62(s)，174.6(s)，151.97(d)，131.01(s)，82.67(d，2xc)，78.04(d)，74.03(d)，73.34(d)，68.89(d)，42.62(t)，42.54(t)，19.05(q)，EI-MSm/z594(M+)，576，558，540，465，447，429，407，395，389，379，377，359，335，325(100)，308，307，289，271，239，221，203。
实施例三番荔枝(Annona squamosa L.)种子自然晾干，捣碎(2446克)。置渗漉器中用石油醚(bp60-90°)20升冷渗漉(F001)，继用丙酮20升渗漉(F002)。F001浓缩至无石油醚蒸出后重新加入600ml石油醚溶解，并用80％甲醇萃取5次，每次150ml，共750ml(F003).F003浓缩至无甲醇蒸出，加入乙酸乙酯100ml溶解，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸于后得14.4克(F004)。
F004柱层析硅胶560g，F004 14.4克干法上柱，用石油醚，石油醚一乙酸乙酯(95∶5，90∶10，80∶20，70∶30，50∶50)，醋酸乙酯、丙酮相继洗脱，分别得到F011，F012，F013，F043，F044组分，F038-F041合并得到5.25g(F050)。
F050柱层析。
硅胶230克。F050 5.25克，干法上柱，依次用石油醚、含5％，8％，10％，20％的丙酮的石油醚、丙酮洗脱，分别得到F051，F052，F063，F064，F065组份。F055，F056组分合并后经硅胶G制备性清层层析，展开剂为氯仿∶丙酮∶甲醇(50∶10∶1)得到化合物A7。
A7，番荔枝西宁甲(squamocinin A).无色无定形物，C36H62O8(M＝622)，[α]D+24.7°(C＝1.4，CHCl3)。1HNMR(300MHZ，inCDCl3，δppm，JHZ)0.85(3H，t，J＝6.9)，1.43(3H，d，J＝6.8)，3.36(1H，m)，3.75-3.90(8H，m)，5.04(1H，q，J＝6.8)，7.16(1H，br.s).13CNMR(75MHZ，inCDCl3，δppm)174，60(s)，151.77(d)，131.18(s)，83.22(d)，83.16(d)，82.78(d)，82.68(d)，82.50(d)，81.78(d)，77.96(d)，74.06(d)，71.32(d)，69.97(d)，19.10(d)，14.10(d)，EI-MS m/z622(M+)，604，586，568，551，498，451，433，415，414，381，363，345，311(100)，293，275，241，141。
实施例四番荔枝种子4.5kg，粉碎后用95％乙醇浸提三次，提取液合并减压浓缩，残余物先后用石油醚、氯仿提取。石油醚部分再用85％甲醇水溶液反萃取，萃取液减压蒸干，残余物经硅胶柱层析分离，丙酮一石油醚(5∶95，10∶90。15∶85，20∶80。30∶70)梯度洗脱，得到F1-80组分，自F42-50，得到化合物annonin VI(III)，经小硅胶柱精制，醋酸乙酯中得无色结晶物。自F58～72合并后再经硅胶柱层析，得到化合物annonin I(II)。
阿诺宁甲(Annonin I)，白色无定形或白色结晶，mp44.5-46°，[α]D+22.1°(C＝0.5，CHCl3)，C37H66O7(M＝622)。UV入max211nm(E 10690，MeOH)，1HNMR(400MHZ，in CDCl3，δppm，JHz)0.82(3H，t，J＝7)，1.35(3H，d，J＝6.8)，3.35(1H，m)，3.53(1H，m)，3.75(1H，m)，3.80(1H，m)3.83(2H，m)，3.86(1H，m)4.94(1H，dq，J＝6.8，1.2)，6.94(1H，d，J＝1.2).13CNMR(100MHZ，in CDCl3，δppm)173.8(s)，148.8(d)，134.2(s)，83.3(d)，82.7(d)，82.4(d)，82.1(d)，77.3(d)，74.1(d)，71.6(d)，71.3(d)，19.1(q)，14.0(q)，EI-MS m/z622(M+)，604，586，568，519，501，483，465，417，399，347，329，319，295(100)，267，239，203，195。
阿诺宁已(annonin VI)，无色结晶，mp77-78°，[α]D+15.1°(C＝0.7，MeOH).C37H66O7(M＝622).UV入max211.5nm(E 10631，MeOH)。1HNMR(400MHz，in CDCl3，δppm，JHz)0.84(3H，t，J＝7.2)，1.37(3H，d，J＝6.8)，3.36(1H，m)，3.81(4H，m)，3.90(2H，m)，5.02(1H，q，J＝6.8)，6.96(1H，S).13CNMR(100MHz，in CDCl3，δppm)174.6(s)，151.7(d)，131.1(s)，83.2(d)，82.8(d)，82.5(d)，82.2(d)，77.9(d)，74.1(d)，71.3(d)，69.9(d)，19.1(q)，14.1(q).EI-MS m/z622(M+)，604，586，568，451，433，415，381，363，345，311(100)，293，275，241。
实施例五静脉注射用药(1)阿诺宁甲 1mg(2)大豆油 5g(3)卵磷脂 2.5g(4)甘油(glycerin) 2g
(5)注射用蒸馏水 100ml上处方中(1)加入(2)，(3)溶解，再加入(4)和(5)乳化，得到静脉注射剂。
实施例六静脉注射用药(1)阿诺宁已 1mg(2)大豆油 5g(3)卵磷脂 2.5g(4)甘油(glycerin) 2g(5)注射用蒸馏水加至100ml处置同实施例五。
实施例七(1)阿诺宁甲0.80mg(2)阿诺宁已0.2mg(3)大豆油 5g(4)卵磷脂 2.5g(5)甘油(glycerin) 2g(5)注射用蒸馏水加至 100ml上处方中(1)、(2)加入(3)、(4)溶解后，再加入(5)和(6)乳化，得到静脉注射剂(微乳剂)。
权利要求
1.一种清除HIV病毒、治疗艾滋病的聚乙酰精宁，其特征为它的结构模式为
式中F可选取以下形式
X、Y可选取H，H；H，OH；H，OAC和＝0A＝4～21，B＝5～15，D＝1，2或3
2.根据权利要求1所述的清除HIV病毒、治疗艾滋病的聚乙酰精宁，其特征为化合物有一个四氢呋喃环、或两个相邻接的四氢呋喃环或三个连接成线状排列邻接的四氢呋喃环，一个带有甲基的α、β一不饱和或饱和的五元环内酯或带有丙酮基的五元内酯环，并由5～15个CH2组成的碳链连接在一起，四氢呋喃环两侧的碳链上通常具有羟基、酮基、乙酰氧基取代，他们的化学结构如下
R1＝H，R2＝OH阿诺宁甲(AnnoninI)R1＝OH，R2＝H阿诺宁已(AnnoninVI)
番荔枝西宁甲(squamosinin A)
新阿诺纳辛-10-酮(neo-annoacin-10-one)
海南哥纳香素已庚(howiicin FG)
3.根据权利要求1和2所述的清除HIV病毒、治疗艾滋病的聚乙酰精宁，其特征为该药物包括上述化合物的单体化合物、混合物或者是含有上述化合物的植物提取和分离部位及复方制剂药物。
全文摘要
本发明公开了一种具有四氢呋喃环特征结构的聚乙酰精宁(acetogenins),其化学结构为:X、Y可选取:H,H;H,OH;H,OAC和=0 A=4～21,B=5～15,D=1,2或3,此类化合物对SIV,HIV－1等病毒、有强烈抑制和清除作用,对流感病毒、鼻病毒等所致的流感、感冒等有显著的治疗作用,有希望发展成为新型抗HIV病毒,治疗艾滋病的新药。
文档编号C07D307/58GK1255494SQ9911724
公开日2000年6月7日 申请日期1999年11月24日 优先权日1999年11月24日
发明者杨仁洲 申请人:杨仁洲