专利名称：一种新的人凝血栓蛋白-1介导因子及其应用和制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码人凝血栓蛋白-1介导因子的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。
凝血栓蛋白-1介导因子(Muskelin)是一种新发现的、广泛表达的胞内凝血栓蛋白-1调节蛋白，它促使凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1)附着于细胞骨架并且是细胞黏附的中介体。(EMBO J 1998，Sep 1；17(17)；4976-74)凝血栓蛋白-1(TSP-1)是一种由血小板a-粒子释放的对凝血酶有刺激作用的糖蛋白，也是生长和修复所需的胞外基质的成分之一，它的三聚体分子量为420kDa。有很多因子都对TSP-1的表达起调节作用，其蛋白通过胞外和胞内两种途径降解(Int J Biochem Cell Biol1997 Jun；29(6)861-5)。研究结果显示，人黑素瘤细胞G361能在含有TSP-1的基质中迅速附着和扩散，然而，当TSP-1肝磷脂结合位被硫酸化、或与A2.5单克隆抗体结合，可选择性的抑制细胞扩散而不会影响附着功能；当单克隆抗体结合在凝血栓蛋白-1的其它功能域上，则可有力地抑制其附着功能。(Cancer Metastasis Rev 1992 Nov；11(3-4)313-24)凝血栓蛋白-1调节因子(Muskelin)主要存在于细胞质中，或附着于细胞膜上，对果蝇的kelch ORF1蛋白和C2C12细胞的研究表明，其功能是刺激细胞附着于TSP-1的C’端，TPS-1调节因子缺失会造成含有TSP-1附着剂的细胞在细胞的黏附、扩散和细胞骨架组织方面的活性降低。
凝血栓蛋白-1介导因子是通过其在细胞内对分子的粘附而对细胞的移动、细胞增殖、神经突的生长及血管生成起调节作用。对这些活性的潜在分子机制的研究已经表明，凝血栓蛋白-1在医学上可用于止血法和血管生成。因此，为治疗目的研究和开发人凝血栓蛋白-1介导因子及其激动剂/抑制剂有重要意义。
本发明的一个目的是提供新的分离的人凝血栓蛋白-1介导因子多肽。本发明的多肽鉴定为人凝血栓蛋白-1介导因子是经过氨基酸同源比较得出的。
本发明的另一个目的是提供编码人凝血栓蛋白-1介导因子多肽的DNA序列。
本发明的另一个目的是提供编码人凝血栓蛋白-1介导因子多肽的重组表达载体。
本发明的另一个目的是提供含有编码人凝血栓蛋白-1介导因子多肽的重组表达载体的宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供生产编码人凝血栓蛋白-1介导因子多肽的方法。本发明的另一个目的是提供针对本发明的人凝血栓蛋白-1介导因子多肽的抗体和拮抗剂。
本发明的另一个目的是提供诊断治疗与人凝血栓蛋白-1介导因子多肽功能异常相关的疾病的方法。例如本发明多肽或多核苷酸可用于肿瘤、脊髓发育不良、骨硬化等相关疾病的治疗。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种分离的或基本上纯的人凝血栓蛋白-1介导因子多肽，其基本上由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列组成。本发明的多核苷酸是从人胎脑组织的cDNA文库中发现的。它包含的多核苷酸序列全长为3011个碱基，其开放读框为SEQ ID NO1中24-2231位，编码735个氨基酸的人凝血栓蛋白-1介导因子。根据氨基酸序列同源比较发现，此多肽与灰鼠凝血栓蛋白-1介导因子之间也有高度同源性，因此被确定为是人的凝血栓蛋白-1介导因子。
术语“分离的”是指材料从其原始环境中被提取。例如，在一个活的动物体内存在的多核苷酸不是分离的，而从天然系统中的一部分或所有共存材料中分离出来的同样的多核苷酸就是分离的。这样的多核苷酸可以是载体或某组合物的一部分，只要这些载体或组合物不是其天然环境的一部分，则多核苷酸仍然是分离的。
本发明的多核苷酸是从人胎脑组织的cDNA文库中发现的。它在结构上具有凝血栓蛋白-1介导因子的特征，同时，此蛋白和灰鼠凝血栓蛋白-1介导因子之间也有高度同源性，在整个氨基酸序列的735个蛋白中有728个蛋白相同，即有99％同源性。
本发明中的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，其中的DNA可以是cDNA、基因组DNA和合成DNA。DNA可以是双链的或单链的，如果是单链的则可以是编码链或是非编码链(反义链)。编码此成熟多肽的多核苷酸序列可以和SEQ ID NO1所示的核酸序列相同，或者可以是编码与SEQ ID NO2所示蛋白相同的成熟多肽，但与SEQ ID NO1所示核酸序列不同的多核苷酸。
本发明中的多核苷酸包括只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上面描述的多核苷酸变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。此多核苷酸的变体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。由上可见，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明的多核苷酸还可以是包括前导序列的多核苷酸；编码一个有成熟蛋白和附加的氨基酸残基的多肽(蛋白原)的多核苷酸。这样，本发明的多核苷酸可以编码成熟蛋白，或有序列原的蛋白，或同时具有序列原和前导序列的蛋白。
本发明还涉及这样的多核苷酸，即当其与本发明所描述的多核苷酸序列有50％～70％相同的序列时可与之杂交。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。
术语“严格条件”“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
根据本发明的又一个方面，提供的人凝血栓蛋白-1介导因子应包括如SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽和这种多肽的片段、类似物和衍生物。术语‘片段’、‘衍生物’和‘类似物’是指与本发明所述的多肽有相同的生物学功能或活性的多肽。这样，类似物也包括了切除蛋白原部分能被激活产生活性成熟多肽的蛋白原。
本发明中的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选是重组多肽。
本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主细胞(例如，细菌，酵母，高等植物，昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据所用的宿主细胞的不同，本发明的多肽可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括一个起始的甲硫氨酸残基。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均一。
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的载体，和含有本发明所述的多核苷酸的遗传工程宿主细胞和用重组技术生产本发明所述的多肽的方法。
本发明中可用于包含多核苷酸序列的载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，比如，细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；植物细胞病毒；哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒。总之，只要能在宿主体内复制存活，任何质粒和载体都可以用。
表达载体最好含有提供筛选转化的宿主细胞的表型性状的基因，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或大肠杆菌用的四环素或氨苄青霉素抗性。
可以用合适的表达调控序列(启动子)与表达载体中的DNA序列连接在一起以指导mRNA合成。这些启动子中有代表性的例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中的表达的启动子。表达载体还包括有翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入一个增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺势作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子增强基因的转录。例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子，细胞肥大病毒早期启动子增强子，在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子，和腺病毒增强子。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。有代表性的例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞；腺病毒等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。目标的多核苷酸序列可以通过各种各样的步骤插入载体上合适的限制性内切酶位点内，构建完的载体可以用来转化适当宿主细胞以表达此蛋白。
当适当的宿主转化并生长到适当的细胞密度后，选用的启动子即可用适当的方法(如温度转换或化学诱导)诱导，细胞再培养一段时间。
细胞经离心后收获，用物理或化学的方法破碎细胞，得到的粗提物留作进一步纯化用。破碎包括冻融法、超声波法、机诫破碎法、或使用细胞裂解试剂。
用硫酸铵或乙醇沉淀，酸抽提，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维层析，疏水相互作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析或植物凝激素层析等方法可将蛋白从重组细胞培养物中回收并纯化出来。如果需要，可以使用蛋白质再折叠步骤以完成成熟蛋白的构象。最后，可以使用高效液相层析(HPLC)来完成最后的纯化步骤。
人凝血栓蛋白-1介导因子是通过其在细胞内对分子的粘附而对细胞的移动、细胞增殖、神经突的生长及血管生成起调节作用，因而人凝血栓蛋白-1介导蛋白在医学上可用于治疗免疫系统疾病、恶性肿瘤疾病等，例如获得性和遗传性的免疫缺陷、退行性神经疾病、脊髓发育不良疾病、局部贫血性伤害和骨硬化症。
本发明的多肽主要应用于恶性疾病诊断和治疗，包括白血病和淋巴瘤类；上皮细胞起源的肿瘤类；间质起源的肿瘤，如肉瘤类；中枢神经系统肿瘤类，特别优选地，可用于治疗人的恶性黑素瘤。
本发明的多肽对免疫组织的损伤、缺陷或失调类疾病也有作用，特别是可用于造血系统疾病(如恶性贫血)，皮肤病(如鳞状上皮细胞癌)等。
本发明的人凝血栓蛋白-1介导因子与灰鼠的凝血栓蛋白-1介导因子(Muskelin)具有99％的同源性，但本发明的多肽来源于人cDNA文库，更适用于人的疾病治疗，特异性高，且不会产生抗体。
现在已经知道了许多种检测人凝血栓蛋白-1的表达方法，这就提供了一个诊断突变的或非正常水平的人凝血栓蛋白-1介导因子表达的途径。从而可以根据诊断结果来使用人凝血栓蛋白-1介导因子及其拮抗剂进行各种疾病的治疗，也可以在各种疾病的治疗期间监控人凝血栓蛋白-1介导因子的表达水平。
人凝血栓蛋白-1介导因子的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等等。
人凝血栓蛋白-1介导因子的拮抗剂可以与人凝血栓蛋白-1介导因子结合并消除其功能，或是抑制人凝血栓蛋白-1介导因子的产生，或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。用人凝血栓蛋白-1介导因子的拮抗剂可以治疗与肿瘤相关的许多疾病，例如人的恶性黑素瘤、人上皮细胞鳞状癌等等。
本发明的多肽，及其片断、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体，且更适合应用于人类。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。
在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将人凝血栓蛋白-1介导因子加入生物分析测定中，通过测定化合物影响人凝血栓蛋白-1介导因子和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。
可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水，葡萄糖，乙醇，盐类，缓冲盐类，甘油以及它们的组合。组合物内包含有效剂量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明的多核苷酸可以用于疾病治疗，即基因治疗，其中包括细胞体内工程化和反义构建体等。
将生产含有编码本发明的多肽的RNA的病毒颗粒的生产细胞提供患者，以使细胞在体内工程化并在体内表达此多肽。工程化细胞的表达载体可以是反转录病毒、腺病毒等。
反义构建体的构建可以通过反义DNA、RNA用来控制基因表达来完成。例如编码本发明的成熟多肽的多核苷酸序列的5′编码区用来设计长度为从10到40个碱基对的反义RNA寡聚核苷酸。反义RNA寡聚核苷酸在体内与mRNA杂交并阻断mRNA分子翻译成人凝血栓蛋白-1介导因子，或是反义RNA寡聚核苷酸递送到细胞内以使反义RNA或DNA在体内表达，从而抑制人凝血栓蛋白-1介导因子的产生。
本发明的多核苷酸也可以用于诊断。如染色体水平上的检测、DNA水平上的检测等。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。当序列被精确定位到染色体上后，此序列在染色体上的物理位置即可与遗传图谱数据相吻合。然后通过分析，可以确定本发明的多核苷酸与一些已经定位到染色体上的疾病的关系。
全长的人凝血栓蛋白-1介导因子基因及其片断可以用于检测人凝血栓蛋白-1介导因子相关的疾病或疾病的易感性诊断。从患者的血液、脊髓和组织活体解剖的细胞中获得的核酸可以通过各种技术在DNA水平上检测突变。如杂交，化学裂解，DNA直接测序，基因组DNA的Southern杂交等。
本发明多肽和多核苷酸还具有其他用途，例如，本发明多肽可用于肽指纹图谱鉴定；本发明的编码序列或其片段可用于制造基因芯片或微阵列。根据本发明的教导，这些应用对于本领域技术人员而已是显而易见的下面的实施例将进一步说明本发明，但不是以此来限制本发明。
实施例1、编码人凝血栓蛋白-1介导因子的cDNA的克隆用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎脑总RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene)从总RNA中分离poly(A) mRNA。2ug poly(A) mRNA经逆转录形成cDNA。用Smart cDNA克隆试剂盒(购自Clontech)将cDNA片段定向插入到，体的多克隆位点上，转化DH5α细菌形成cDNA文库。共获得3028个克隆。用双脱氧法测定所有克隆的5′和3′末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库进行比较，结果发现有一个克隆(103B11)的DNA序列为新的DNA，基因长度为3011bp。通过合成一系列引物对该克隆所含的DNA序列进行双向测定。计算机分析表明，该克隆所含的全长cDNA是一个新的DNA序列(如Seq ID No 1所示)，该序列被命名为pBS-HTSP1，从第24至2231位有一个2207bp的ORF，编码一个新的蛋白质(如Seq ID No 2所示)。此蛋白质被命名为人凝血栓蛋白-1介导因子。
实施例2、人凝血栓蛋白-1介导因子在大肠杆菌系统中的表达和纯化根据该新的人凝血蛋白-1介导因子相应的基因序列，设计出一对特异性扩增引物，序列如下正向引物5’-GCGGCCGCTACGGTGCTG-3’，反向引物5’-GGACTCCCATAGGGCGA-3’；此俩段序列分别含有ApaⅠ和EcoR1酶切位点，其后分别为目的基因3’端和5’端的编码序列，以含有全长目的基因的pBS质粒为模板，进行PCR反应。ApaⅠ和EcoR1的酶切位点相应于表达载体质粒上的选择性内切酶位点。用ApaⅠ和EcoR1分别对扩增序列和质粒PTSA-18进行酶切并连接。将重组质粒转化入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)plySs，并IPTG诱导进行表达。表达产物经过超声破菌和热变性，再上DEAE柱，得到了纯化的目的人凝血栓蛋白-1介导因子蛋白。
实施例3、cDNA克隆的同源检索用本发明提供的人凝血栓蛋白-1介导因子的多核苷酸的序列及其编码的蛋白序列到Genbank，Swissport等数据库进行同源检索，用于检索的程序叫Blast(Basic local Alignment search tool)(1993 Proc Nat Acad Sci905873-5877)，Blast可以找出与人凝血栓蛋白-1介导因子同源的许多基因，其中与本发明发明基因同源性最大的基因，其编码的蛋白在Genbank的准入号为u72194。这些检索到的基因或蛋白序列可以从Genbank数据库中调出。调出的序列可以用GCG软件包中的Pileup(多序列)和Gap(两序列)程序做连配比较。新蛋白的功能预测可以用Motif程序进行分析。同源检索的结果显示本发明提供的人凝血栓蛋白-1介导因子与灰鼠的凝血栓蛋白-1介导因子(Muskelin)具有99％的同源性(详见下表)。＞gi 3493462(U72194)muskelin[Mus musculus]Length=735Plus Strand HSPsScore=3945(1388.7 bits)，Expect=0.0，P=0.0Identities=728/735(99％)，Positives=731/735(99％)，Frame=+3Query 24 MAAGGAVAAAPECRLLPYALHKWSSFSSTYLPENILVDKPNDQSSRWSSESNYPPQYLIL 203MAAGGAVA APECRLLPYALHKWSSFSSTYLPENILVDKPNDQSSRWSSESNYPPQYLILSbjct 1 MAAGGAVAVAPECRLLPYALHKWSSFSSTYLPENILVDKPNDQSSRWSSESNYPPQYLIL 60Query204 KLERPAIVQNITFGKYEKTHVCNLKKFKVFGGMNEENMTELLSSGLKNDYNKETFTLKHK 383KLERPAIVQNITFGKYEKTHVCNLKKFKVFGGMNEENMTELLSSGLKNDYNKETFTLKHKSbjct 61 KLERPAIVQNITFGKYEKTHVCNLKKFKVFGGMNEENMTELLSSGLKNDYNKETFTLKHK 120Query384 IDEQMFPCRFIKIVPLLSWGPSFNFSIWYVELSGIDDPDIVQPCLNWYSKYREQEAIRLC 563IDEQMFPCRFIKIVPLLSWGPSFNFSIWYVELSGIDDPDIVQPCLNWYSKYREQEAIRLCSbjct121 IDEQMFPCRFIKIVPLLSWGPSFNFSIWYVELSGIDDPDIVQPCLNWYSKYREQEAIRLC 180Query564 LKHFRQHNYTEAFESLQKKTKIALEHPMLTDIHDKLVLKGDFDACEELIEKAVNDGLFNQ 743LKHFRQHNYTEAFESLQKKTKIALEHPMLTD+HDKLVLKGDFDACEELIEKAVNDGLFNQSbjct181 LKHFRQHNYTEAFESLQKKTKIALEHPMLTDMHDKLVLKGDFDACEELIEKAVNDGLFNQ 240Query744 YISQQEYKPRWSQIIPKSTKGDGEDNRPGMRGGHQMVIDVQTETVYLFGGWDGTQDLADF 923YISQQEYKPRWSQIIPKSTKGDGEDNRPGMRGGHQMVIDVQTETVYLFGGWDGTQDLADFSbjct241 YISQQEYKPRWSQIIPKSTKGDGEDNRPGMRGGHQMVIDVQTETVYLFGGWDGTQDLADF 300Query924 WAYSVKENQWTCISRDTEKENGPSARSCHKMCIDIQRRQIYTLGRYLDSSVRNSKSLKSD 1103 实施例4Northern印迹分析人凝血栓蛋白-1介导因子的基因表达用一步法提取总RNA[Anal.Biochem 1987，162，156-159]。该法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M异硫氰酸胍-25mM柠檬酸钠，0.2M乙酸钠(pH4.0)对组织进地匀浆，加入1倍体积的苯酚和1/5体积的氯仿-异戊醇(491)，混合后离心。吸出水相层，加入异丙醇(0.8体积)并将混合物离心得到RNA沉淀。
将得到的RNA沉淀用70％乙醇洗涤，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸钠-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳。然后转移至硝酸纤维素膜上。用32P-标记的探针(约2×106cpm/ml)在一溶液中于42℃杂交过夜，该溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鲑精DNA。用α-32P dATP通过随机引物法制备32P-标记的DNA探针。所用的DNA探针的PCR扩增的人凝血栓蛋白-1介导因子编码区序列。杂交之后，将滤膜在1×SSC-0.1％SDS中于65℃洗30min。然后，用Phosphor Imager进行分析和定量。结果表明，人凝血栓蛋白-1介导因子基因可特异性在脊髓组织中表达。实施例5抗人凝血栓蛋白-1介导因子的抗体的制备用多肽合成仪(PE-ABI)合成下述人凝血栓蛋白-1介导因子凝血栓蛋白-1介导因子特异性的多肽Lys Leu Glu Arg Pro Ala Ile Val Gln Asn(氨基酸序列第61-70位)。将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清白蛋白耦合形成复合，方法参见Avrameas.Immunochemistry，1969；6∶43。用4mg上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔，15天后再用血蓝蛋白多肽复合物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经15μg/ml牛血清白蛋白多肽复合物包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose 4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与本发明的人凝血栓蛋白-1介导因子结合。
序列表(1)一般信息
(2)SEQ ID NO1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度3011bp(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1 (2)SEQ ID NO2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度735个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型多肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO21 Met Ala Ala Gly Gly Ala Val Ala Ala Ala Pro Glu Cys Arg Leu16 Leu Pro Tyr Ala Leu His Lys Trp Ser Ser Phe Ser Ser Thr Tyr31 Leu Pro Glu Asn Ile Leu Val Asp Lys Pro Asn Asp Gln Ser Ser46 Arg Trp Ser Ser Glu Ser Asn Tyr Pro Pro Gln Tyr Leu Ile Leu61 Lys Leu Glu Arg Pro Ala Ile Val Gln Asn Ile Thr Phe Gly Lys76 Tyr Glu Lys Thr His Val Cys Asn Leu Lys Lys Phe Lys Val Phe91 Gly Gly Met Asn Glu Glu Asn Met Thr Glu Leu Leu Ser Ser Gly106 Leu Lys Asn Asp Tyr Asn Lys Glu Thr Phe Thr Leu Lys His Lys121 Ile Asp Glu Gln Met Phe Pro Cys Arg Phe Ile Lys Ile Val Pro136 Leu Leu Ser Trp Gly Pro Ser Phe Asn Phe Ser Ile Trp Tyr Val151 Glu Leu Ser Gly Ile Asp Asp Pro Asp Ile Val Gln Pro Cys Leu166 Asn Trp Tyr Ser Lys Tyr Arg Glu Gln Glu Ala Ile Arg Leu Cys181 Leu Lys His Phe Arg Gln His Asn Tyr Thr Glu Ala Phe Glu Ser196 Leu Gln Lys Lys Thr Lys Ile Ala Leu Glu His Pro Met Leu Thr211 Asp Ile His Asp Lys Leu Val Leu Lys Gly Asp Phe Asp Ala Cys226 Glu Glu Leu Ile Glu Lys Ala Val Asn Asp Gly Leu Phe Asn Gln241 Tyr Ile Ser Gln Gln Glu Tyr Lys Pro Arg Trp Ser Gln Ile Ile256 Pro Lys Ser Thr Lys Gly Asp Gly Glu Asp Asn Arg Pro Gly Met271 Arg Gly Gly His Gln Met Val Ile Asp Val Gln Thr Glu Thr Val286 Tyr Leu Phe Gly Gly Trp Asp Gly Thr Gln Asp Leu Ala Asp Phe301 Trp Ala Tyr Ser Val Lys Glu Asn Gln Trp Thr Cys Ile Ser Arg316 Asp Thr Glu Lys Glu Asn Gly Pro Ser Ala Arg Ser Cys His Lys331 Met Cys Ile Asp Ile Gln Arg Arg Gln Ile Tyr Thr Leu Gly Arg346 Tyr Leu Asp Ser Ser Val Arg Asn Ser Lys Ser Leu Lys Ser Asp361 Phe Tyr Arg Tyr Asp Ile Asp Thr Asn Thr Trp Met Leu Leu Ser376 Glu Asp Thr Ala Ala Asp Gly Gly Pro Lys Leu Val Phe Asp His391 Gln Met Cys Met Asp Ser Glu Lys His Met Ile Tyr Thr Phe Gly406 Gly Arg Ile Leu Thr Cys Asn Gly Ser Val Asp Asp Ser Arg Ala421 Ser Glu Pro Gln Phe Ser Gly Leu Phe Ala Phe Asn Cys Gln Cys436 Gln Thr Trp Lys Leu Leu Arg Glu Asp Ser Cys Asn Ala Gly Pro451 Glu Asp Ile Gln Ser Arg Ile Gly Arg Cys Met Leu Phe His Ser466 Lys Asn Arg Cys Leu Tyr Val Phe Gly Gly Gln Arg Ser Lys Thr481 Tyr Leu Asn Asp Phe Phe Ser Tyr Asp Val Asp Ser Asp His Val496 Asp Ile Ile Ser Asp Gly Thr Lys Lys Asp Ser Gly Met Val Pro511 Met Thr Gly Phe Thr Gln Arg Ala Thr Ile Asp Pro Glu Leu Asn526 Glu Ile His Val Leu Ser Gly Leu Ser Lys Asp Lys Glu Lys Arg541 Glu Glu Asn Val Arg Asn Ser Phe Trp Ile Tyr Asp Ile Val Arg556 Asn Ser Trp Ser Cys Val Tyr Lys Asn Asp Gln Ala Ala Lys Asp571 Asn Pro Thr Lys Ser Leu Gln Glu Glu Glu Pro Cys Pro Arg Phe586 Ala His Gln Leu Val Tyr Asp Glu Leu His Lys Val His Tyr Leu601 Phe Gly Gly Asn Pro Gly Lys Ser Cys Ser Pro Lys Met Arg Leu616 Asp Asp Phe Trp Ser Leu Lys Leu Cys Arg Pro Ser Lys Asp Tyr631 Leu Leu Arg His Cys Lys Tyr Leu Ile Arg Lys His Arg Phe Glu646 Glu Lys Ala Gln Val Asp Pro Leu Ser Ala Leu Lys Tyr Leu Gln661 Asn Asp Leu Tyr Ile Thr Val Asp His Ser Asp Pro Glu Glu Thr676 Lys Glu Phe Gln Leu Leu Ala Ser Ala Leu Phe Lys Ser Gly Ser691 Asp Phe Thr Ala Leu Gly Phe Ser Asp Val Asp His Thr Tyr Ala706 Gln Arg Thr Gln Leu Phe Asp Thr Leu Val Asn Phe Phe Pro Asp721 Ser Met Thr Pro Pro Lys Gly Asn Leu Val Asp Leu Ile Thr Leu参考文献
权利要求
1．一种分离的人凝血栓蛋白-1介导因子多肽，它包含具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2．如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽。
3．一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少80％相同性(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4．如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多肽。
5．如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种(a)具有SEQ ID No.1中24-2231位的序列；(b)具有SEQ ID No.1中1-3011位的序列。
6．一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7．一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种宿主细胞(a)用权利要求6所述的载体转化的宿主细胞；(b)用权利要求3所述的多核苷酸转导的宿主细胞。
8．一种具有人凝血栓蛋白-1介导因子活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达人凝血栓蛋白-1介导因子的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人凝血栓蛋白-1介导因子活性的多肽。
9．一种能与权利要求1所述的人凝血栓蛋白-1介导因子多肽特异性结合的抗体。
10．一种核酸分子，它含有权利要求3所述的多核苷酸中连续的10-3000核苷酸。
11．一种化合物，其特征在于，它选自下组(a)模拟权利要求1所述多肽的活性的化合物，(b)促进权利要求1所述多肽的活性的化合物，(c)拮抗权利要求1所述多肽的活性的化合物，(d)抑制权利要求1所述多肽的表达的化合物。
12．如权利要求11所述的化合物，其特征在于，它是SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列或其片段的反义序列。
13．一种应用权利要求11所述化合物来调节人凝血栓蛋白-1介导因子蛋白在体内、体外活性的方法。
14.一种检测与权利要求1所述的多肽异常表达相关的疾病或疾病的易感性的方法，其特征在于，包括检测编码所述多肽的核酸序列中的突变。
15.如权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，它被用于筛选促进人凝血栓蛋白-1介导因子多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人凝血栓蛋白-1介导因子多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。
16.如权利要求10所述的核酸分子的用途，其特征在于，它被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
17.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开了人凝血栓蛋白－1介导因子和编码此多肽的DNA(RNA)以及通过重组技术生产此多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病的方法,如获得性和遗传性的免疫缺陷、退行性神经疾病、脊髓发育不良疾病、局部贫血性伤害、骨硬化病等。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码该人凝血栓蛋白－1介导因子的多核苷酸的用途。
文档编号C07K14/47GK1288056SQ9911685
公开日2001年3月21日 申请日期1999年9月10日 优先权日1999年9月10日
发明者毛裕民, 谢毅 申请人:上海生元基因开发有限公司