具有溶血栓和抗凝血性质的蛋白融合构建体的制作方法

专利名称：具有溶血栓和抗凝血性质的蛋白融合构建体的制作方法
技术领域：
本发明涉及溶血栓药物，其包括包含溶血栓蛋白以及血栓调节蛋白的4、5、6表皮生长因子样结构域(EGF4、5、6)的嵌合融合蛋白。本发明的融合蛋白具有纤溶酶原活化活性、凝血酶抑制活性和抗凝蛋白C途径活化活性。本发明的融合蛋白具有破碎血栓和预防在凝块部位处再闭塞的治疗潜力。
背景技术：
血栓形成(血块或血栓在血管系统内的形成和发展)尽管当发生在出血过程中时是一个挽救生命的过程，但是当发生在任意其它时间时可以是危及生命的。血栓可以阻塞血管，并阻止向器官或其它身体部分的血液供给。如果脱离的话，血栓可以变成栓塞物，并阻塞在起始部位远端的血管。血栓性病症现在构成世界范围内的发展中国家和发达国家的主要死亡原因之一。尽管仍然是针对血栓性循环病症的最优选急诊(“S0S”)药物，纤溶酶原活化剂蛋白药物(诸如链激酶(SK)、葡萄球菌激酶(SAK)和组织纤溶酶原激活物(tPA))在富裕的国家中正在慢慢地丧失它们在急诊心脏介入(诸如支架和旁路手术)中的优势，这是因为与它们的应用有关的出血风险，以及经常遇到的、由凝血酶活性和/或凝血酶新产生引起的在相同血管损伤部位处的凝块再形成的问题。因而，迫切需要开发具有额外特征(诸如凝块特异性和抗血栓性质)的更智能的和更有效的溶血栓药物。血块形成是级联反应的复杂组合的最终结果，在所述级联反应中，几种生化事件造成在损伤部位处的封闭或修复(Butenas和Mann 2002)。基于血液凝固级联的启动，已经将途径分成非固有的和固有的途径，其中所述非固有的途径通过组织因子(TF)的暴露而启动，而固有的途径由因子XII(Hageman因子)、高分子量激肽原(HK)或前激肽释放酶(prekalIikrain)启动。但是，2个级联途径最终汇合在因子Xa产生点，并随后跟随共同的凝血酶介导的纤维蛋白产生(Cannon和Tracy 1995)。凝血酶产生是 脊椎动物中的血液凝固过程的中枢步骤。在凝血酶产生过程中，少量凝血酶掺入扩大中的纤维蛋白凝块/网络中，并且该蛋白酶的催化部位(游离在被吸附的凝血酶中)能够放大凝块生长(Liu,Nossel等人.1979 ；Vali和Scheraga 1988)。凝血酶会与不同的底物相互作用，并活化几种凝块促进因子，例如(a)它通过切割它们的同源受体而造成血小板的活化，(b)造成因子V、VIII和XI的反馈活化，(c)造成转谷氨酰胺酶(transglutminase)、因子XIII的活化,和(d)将纤维蛋白原转化成纤维蛋白。在病理学状况下，在凝块形成并通过链间交联而稳定化以后，它会阻碍在血管中的正常血流，并导致动脉和静脉的堵塞。针对由动物/人类中的病理性血栓形成引起的循环病症(诸如心肌梗塞)的最常见的且优选的药物治疗之一是，血栓溶解剂的静脉内输注(Lijnen和Collen 1988 ；Collen和Lijnen 1990 ;Francis和Marder 1991)。可利用的溶血栓药诸如链激酶(SK)、尿激酶(UK)和组织纤溶酶原激活物(tPA)主要通过相同的纤溶酶依赖性的机理起作用(因为这些是纤溶酶原活化剂)，其中它们切割纤溶酶原的残基561和562之间的易切断肽，并将所述纤溶酶原转化成它的蛋白水解活化形式，即纤溶酶。组织纤溶酶原激活物和尿激酶是特异性地识别人纤溶酶原中的易切断肽键的蛋白酶(直接活化剂)，而链激酶和葡萄球菌激酶(它们是蛋白‘辅因子’，而不是蛋白酶，并因而是‘间接’活化剂；参见De Renzo, Boggiano等人.1967 ;Buck，Hummel等人.1968 ;McClintock和Bell 1971)首先与纤溶酶或纤溶酶原形成紧密的1:1复合物，并且得到的蛋白水解活性的复合物切割其它‘游离’纤溶酶原分子的易切断肽键，并指数地产生纤溶酶(WohI, Summaria等人.1978 ；Castellino和Powell1981 ；ffohl, Sinio 等人.1983 ；Davidson, Higgins 等人.1990 的综述)。在所有目前可得到的凝块破碎剂(也就是说，纤溶酶原活化剂蛋白药物)中，链激酶表现出最高的溶血栓能力，尽管由于(如SAK)细菌起源，它具有在少数患者中引起免疫反应的限制。尽管如此，因为它与tPA和UK相比相对较低的成本，它被广泛地用作提供得起的溶血栓药。成功的溶血栓治疗会帮助维持正常的血流,并改善大量患者的存活(Verstraete1990)，但是早期再闭塞或血栓重新形成(经常在相同部位)已经继续限制溶血栓药物的成功应用。几项研究证实，在多达30%的经过溶血栓治疗的患者中发生早期再闭塞(Ohman，Califf等人.1990)。通过增加血液的高凝性的纤溶酶活性，可以解释血栓重新形成或早期再闭塞的原因(Eisenberg, Miletich等人.1988);有人提出，纤溶酶活化接触因子(Ewald和Eisenberg 1995)、因子V (Lee和Mann 1989),还可能活化凝血酶原(Seitz等人，1993)。另一种提出的理由是，凝块结合的凝血酶随后分解出凝血酶，这又产生更多的凝血酶，而纤维蛋白结合的凝血酶相对地耐受抗_凝血酶抑制剂(Hogg和Jackson 1989 ；ffeitz, Hudoba等人.1990)； ‘释放的’凝血酶再局部地活化促凝活性，并开始活化血小板(Kumar，Beguin等人.1994 ；Puri,Kumar等人.1995),由此促进导致血栓重新形成的生化事件循环。因而，在损伤部位处的凝血酶抑制(二者直接地)和在它的促凝活性的‘二级’水平应当会极大地阻碍上述的不希望的事件链。如果这样的性质成功地掺入与溶血栓药物相同的分子中，在挽救生命方面的优点是显而易见的。纤溶酶原活化剂是特征性地催化纤溶酶原向纤溶酶的酶促转化的蛋白酶家族。TPA通过水解单个精氨酸-缬氨酸键而将纤溶酶原酶促转化为纤溶酶。

组织纤溶酶原激活物(也称作纤维蛋白激酶、非固有的纤溶酶原活化剂、t-PA或TPA)是一种糖蛋白，且具有约70，000道尔顿(68，000道尔顿)的近似分子量(MW)。它是通过水解单个精氨酸-缬氨酸键而催化前酶纤溶酶原的酶促转化成活性酶纤溶酶的丝氨酸蛋白酶。t-PA的催化部位由氨基酸His-322、Asp-371和Ser-478构成。在没有纤维蛋白存在下，t-PA是较差的纤溶酶原活化剂。氨基端区域由几个结构域构成，所述结构域与其它蛋白是同源的。这些独特的结构域参与该酶的几种功能，包括结合纤维蛋白、纤维蛋白-特异性的纤溶酶原活化、结合内皮细胞受体和快速的体内清除。包含氨基酸残基50-87的一个这样的结构域(E结构域)与人表皮生长因子是同源的，且似乎参与纤维蛋白结合、纤维蛋白亲和力和体内清除。克隆了 t-PAcDNA，并随后在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。组织纤溶酶原激活物(t-PA)是负责特异性地活化与纤维蛋白凝块相关的纤溶酶原(即能够溶解血块)的哺乳动物纤维蛋白溶解系统的组分。组织纤溶酶原激活物介导的凝块溶解显示出血浆中增加的纤维蛋白肽-A水平，所述纤维蛋白肽-A是凝块结合的凝血酶的直接标志物(Weitz, Leslie等人.1998)。组织纤溶酶原激活物和当前已知的抗-凝血酶药物(诸如肝素和水蛭素)的组合经常用于药物治疗中，但是该抗-凝血酶仅仅作用于游离的凝血酶，并且由于它们的低亲和力，凝块结合的凝血酶对肝素和其它抑制剂是抗性的。此外，这些药物不会影响其它凝血酶产生的间接促进剂(例如因子V和因子VIII)。因此，需要设计新的嵌合蛋白，其活化纤溶酶原同时抑制凝块结合的凝血酶以及凝血酶的间接促进剂(诸如因子V和因子VIII)。对溶血栓后的纤溶酶活性和随后的凝血酶产生的研究清楚地提示，甚至在已经用凝块破碎剂药物清除病理性凝块时，存在导致凝固途径的重新活化的有效因子。另外，产生的凝血酶本身是一种有效的凝固途径活化剂。值得注意的是，凝血酶也执行抗凝功能，这是止血系统的“自限制”控制机制(使得不会存在遍布于脉管系统中的‘失控’凝固)的一个优美实例。游离凝血酶与血栓调节蛋白(一种细胞表面蛋白)形成1:1高亲和力非共价复合物(Kurosawa, Galvin等人.1987)。在形成凝血酶-血栓调节蛋白复合物以后,它的底物特异性从促凝模式重新导向抗凝模式，由此它活化蛋白C抗凝血途径。因而，尽管单独的凝血酶可以活化蛋白C，但是一旦它与血栓调节蛋白形成复合物，它会使蛋白C活化加速几乎 1000 倍(Esmon 和 Owen 1981 ；0wen 和 Esmon 1981))。成熟的血栓调节蛋白含有负责不同功能(即凝血酶抑制和蛋白C活化)的不同结构域，它们位于该大蛋白的表皮生长因子样结构域中。表皮生长因子样(EGF)结构域5和6主要负责凝血酶亲和力，EGF4、5和6结构域一起活化蛋白C(Kurosawa, Stearns等人.1988 ;Stearns,Kurosawa等人.1989)。已知血栓调节蛋白或它的分离的EGF结构域4、5和6活化以蛋白C为中心的抗凝血途径，并且也直接地抑制凝血酶的活性，但是它们自己不会溶解纤维蛋白凝块。为此，血栓溶解剂是必要的。在心脏血栓性疾病中可以彼此独立地使用两类药剂，但是具有两类特性的单一药物(到目前为止尚未得到证实)的优点是显而易见的。术语‘止血’表示在血液/血管系统中的抗凝活性和促凝活性之间的平衡，其中在正常情况下血液组分、特别是血小板不会与血管的衬里异常地相互作用。在损伤或疾病状况下，血小板倾向于附着在该损伤部位处，并且因此凝血因子开始积累在该损伤部位处并活化，尽管这是启动在损伤部位处的修复的应答，但是会导致血液阻塞，由此经常导致沉淀性的血栓性危机。 在血管内的血液凝固和凝块的溶解都是正常止血的必要生理学过程。在血管内的凝块形成和溶解机理是在文献中充分已知的，不同的促凝蛋白(促进凝结)和抗凝蛋白的作用现在也得到相当好的研究。凝块形成是复杂的反应集合的结果，其中凝血酶在启动以及凝固级联加速中起重要作用，最终的结果以稳定的纤维蛋白网络的形式出现。每种现代的溶血栓的/纤维蛋白溶解的疗法通常还组合抗血栓药物(诸如阿司匹林、肝素等)，后者是维持凝块溶解过程中的促凝剂和抗凝剂之间的正常平衡所必需的。在溶解过程中，暂时释放的凝血酶启动自产生环以放大凝块生长；有时这会导致平衡向凝块的再形成或促凝剂/凝结促进剂的活化转移。溶血栓药通过活化循环系统中固有的纤溶酶原而溶解病理性凝块。在可利用的且治疗上有用的溶血栓药中，链激酶表现出最高的溶血栓潜力，但是因为缺乏凝块特异性，有时它会在药物治疗过程中导致出血。该问题相对更少地与其它溶血栓药(tPA和SAK)相关，因为它们具有相对增加的纤维蛋白凝块特异性，但是这些溶血栓药的其它缺点是，更少的纤维蛋白溶解潜力和更短的体内半衰期。所有溶血栓药具有基本上相同的溶栓机理(纤溶酶原活化)，但是具有一个共同的问题，即在溶栓以后，产生的凝血酶经常通过由凝血因子Va和因子VIIIa控制的反馈机制进一步放大凝血酶产生。在溶栓过程中，凝块结合的凝血酶也被释放进循环中，其相对地耐受固有的抗-凝血酶和其它外部提供的凝血酶抑制性药物。该凝块结合的凝血酶(存在于‘原始’损伤附近)也有助于在凝块/损伤部位附近产生甚至更多的凝血酶，特别是在凝块的不完全除去以后，这会导致临床上严重的早期再闭塞问题。在其它固有的促凝剂的溶解和活化过程中的凝血酶产生，是止血平衡的一个正常部分。抗-凝血酶剂(如肝素、水蛭素和化学合成的药物)可以抑制凝血酶，并阻止它的随后短暂效应，如高反应性血小板形成过程的抑制、纤维蛋白原向纤维蛋白转化的抑制、以及诱导血液中的高凝性的其它凝结促进活性。但是，值得注意的是，所有这些直接抑制剂作用于短暂地产生的凝血酶，而不作用于那些实际上加速凝血酶产生并在促凝途径中起关键作用的因子。因而，这些药物都不会象希望的那样有效地作用于在凝血酶产生和早期再闭塞中起重要作用的凝血因子V和VIII。众所周知的细 胞表面分子血栓调节蛋白与凝血酶形成1:1复合物，并指导它的促凝功能成为有效的抗凝剂，即蛋白C活化剂。活化的蛋白C和蛋白S都会降解活化的因子 V 和因子 VIII (Esmon 1989)。尽管所有可利用的溶血栓药不具有凝块溶解能力，并且它们的机理在文献中是比较清楚的，但是在凝块溶解过程中，凝块和纤溶酶的残余物会导致凝血酶产生；与此同时，由于这些试剂不会灭活在凝块溶解过程中暂时出现的凝血酶，结果是，再闭塞是在溶血栓治疗之后的常见问题。迄今为止，不可得到这样的抗-凝血酶药物:其具有溶血栓性质和抗-凝血酶性质(特别是促凝活性)的组合，从而灭活主要负责血栓重新形成的“真正元凶”。

发明内容
本发明涉及改进的溶血栓药物的设计，所述药物除了能够活化纤溶酶原以外，还表现出抑制凝血酶产生的能力。这些双重性质在相同分子中的存在潜在地具有巨大的临床益处，因为这有助于使溶血栓治疗以后的早期再闭塞问题最小化。本发明公开了策略地设计的嵌合多肽，其中将源自血栓调节蛋白的、具有抗凝血酶性质的结构域/区段与不同的溶血栓蛋白融合，使得得到的融合体/嵌合多肽同时表现出凝块溶解(溶血栓)性质以及抗-凝血酶性质。这些新颖的融合构建体具有以纤溶酶和/或凝血酶依赖性的方式活化溶血栓系统的能力(这使得所述构建体成为凝块特异性的，因为纤维蛋白凝块富含纤溶酶以及凝血酶，而游离的纤溶酶和凝血酶在循环中短暂停留，迅速地被丝氨酸蛋白酶抑制蛋白诸如α-2抗纤维蛋白溶酶、抗-凝血酶等灭活)。这些构建体也同时抑制在凝块溶解过程中释放的短暂地产生的凝血酶，并且也在血栓性病症(诸如卒中、心肌梗塞、深静脉血栓形成等)的情况下使用这些药剂进行药物治疗的过程中启动内在的(固有的)抗凝蛋白C途径。不同于目前可得到的溶血栓药，本发明公开了新的溶血栓构建体，其能够靶向凝固级联的因子Va和VIIIa(另外能够活化纤溶酶依赖性的溶血栓途径)以及固有地内在的抗凝蛋白C途径；几种希望的能力在同一药物分子中的这种组合存在会提高它们的总效力，使得这些可以溶解病理性血块，同时使最可能危及生命的溶血栓后事件之一(即凝结过程的复发)最小化。该方案是，设计、试验和验证具有抗-凝血酶和溶血栓性质的融合蛋白的建立。因为EGF4、5、6的固有的凝血酶亲和力，EGF4、5、6向溶血栓分子中的成功“功能性”融合，可以潜在地使溶血栓分子靶向富含凝血酶的凝块。与此同时，如果所述融合体除了保留2种最初‘独立的’亲本生物活性(即抗-凝血酶和纤溶酶原活化剂活性)以外，还将前药性质赋予杂合分子使得它优先在凝块附近(而不是全身性地)活化，由于它的靶向作用性质，这将是另一个非常有用的且有利的特征。在本发明中，通过在相同分子中的有效整合，已经成功地功能化具有溶血栓性质与凝血酶抑制能力以及蛋白C活化能力的组合的几种杂合蛋白分子，以便极大地提高目前可得到的溶血栓药物的效力，并辅助预防血栓重新形成现象，因为整合进相同试剂/分子中的所有这些性质的存在，将会在除去各种血栓性病理性综合征中的纤维蛋白血块方面提供实时的(时间的)和空间的(原位的)有益作用。在本发明中 ，已经将链激酶、组织纤溶酶原活化剂和葡萄球菌激酶与EGF4、5、6融合，以产生具有启动纤溶酶依赖性的溶血栓系统和凝血酶介导的蛋白C抗凝血途径的性质的嵌合分子。此外，在本发明的一些实施方案中，还实现了迄今为止尚未报道的溶栓活性、凝块特异性活性和抗凝血酶活性的成功整合。在不同的融合构建体中，使用在接头中的不同的优选氨基酸残基，小心地设计血栓溶解剂和EGF结构域之间的融合接点，并引入不同的凝血酶和/或纤溶酶可切割位点，由于EGF4、5、6从嵌合体的蛋白水解性释放和随后的溶血栓组分活化，所述位点会造成不同的时间依赖性的体外纤溶酶原活化动力学。不同的凝血酶可切割位点在溶血栓药和EGF4、5、6的接点处的存在，允许这二者在富含凝血酶的凝块附近被局部地停留的酶(凝血酶或纤溶酶)彼此分离；因而，在切割以后，每个结构域独立地执行它的功能。此外，在有些融合构建体中，已经将转谷氨酰胺酶可识别的交联序列导入在嵌合多肽的要害部位处，使得活化的结构域将由于血液转谷氨酰胺酶的作用而共价地结合在上皮组织(其损伤最先导致凝块产生)中或周围的凝块残余物，并从而在已经溶解最初的凝块以后继续长时间地提供在纤溶酶原活化和凝血酶抑制方面的局部化效应。这将清楚地导致药物的‘治愈’效应，这是一种在目前使用的任何溶血栓蛋白药物中不可得到的性质。


图1的示意图描绘了:不同的框架内基因融合构建体，其中血栓调节蛋白的EGF4、5、6结构域与任一个编码链激酶、组织纤溶酶原激活物或葡萄球菌激酶的DNA融合，以及编码结构域间接头(包括具有三甘氨酸(GGG)或转谷氨酰胺酶-识别信号(TG)的接头)以促进凝血因子XII1-催化的杂合蛋白与其它组织或纤维蛋白凝块的共价交联的框架内融合序列，以及凝血酶可切割序列(TCS)。图1A的示意设计A代表编码在SK (链激酶)的N-端末端处融合的EGF4、5、6的DNA序列。图1B的示意设计B代表通过适当的接头与SK的C-端末端融合的EGF4、5、6,所述接头含有促进柔性的残基(例如，三甘氨酸段，GGG)。
图1C的示意设计C代表同时在SK的N和C端处的EGF融合以及转谷氨酰胺酶识别位点/残基段。图1D的示意设计D代表在SK的C-端末端处融合EGF4、5、6结构域，其中缺失了SK的5个氨基酸。图1E的示意设计E代表在SK的N和C端处同时融合EGF4、5、6，其中凝血酶识别和可切割序列(TCS)存在于EGF和SK的接点处。图1F的示意设计F代表在SK的N和C端处同时融合EGF4、5、6，其中凝血酶识别序列存在于EGF和SK的接点处，且转谷氨酰胺酶识别序列存在于EGF的开始部分(N-端末端)处。图1G的示意设计G代表在SK的α和β结构域的接点处融合EGF结构域。图1H的示意设计H代表在SK的β和Y结构域的接点处融合EGF结构域。图1I的示意设计I代表在tPA(组织纤溶酶原激活物)的N和C端处同时融合EGF结构域。在所有附图中和这样的术语在说明书中出现的任意地方，“egf”表示tPA的EGF-样结构域，而“EGF456”表示血栓调节蛋白的EGF4、5、6结构域。图1J的示意设计J代表在tPA的C-端末端处融合EGF4、5、6结构域。图1K的示意设计K代表在tPA的N-端末端处融合EGF4、5、6结构域。图1L的示意设计L代表在tPA (组织纤溶酶原激活物)的N和C端处融合EGF4、
5、6结构域，其中tPA的固有egf被缺失。图1M的示意设计M代表在tPA的N-端末端处融合EGF4、5、6，其中tPA的固有egf被缺失。图1N的示意设计N代表在tPA的N-端末端处融合EGF4、5、6，其中tPA的固有egf和三环l(kringle I)被缺失。图10的示意设计O代表在tPA的C-端末端处融合EGF，其中tPA的固有egf被缺失。图1P的示意设计P代表在tPA的C-端末端处融合EGF结构域4、5、6，其中tPA的固有egf和三环I被缺失。图1Q的示意设计Q代表EGF4、5、6结构域与tPA的融合，其中tPA的固有egf被EGF4、5、6结构域替代。图1R的示意设计R代表EGF与tPA的融合，其中tPA的固有egf和三环I被EGF4、
5、6结构域替代。
图1S的示意设计S代表在SAK的C-端末端处融合EGF结构域。图1T的示意设计T代表在SAK的N-端末端处融合EGF结构域。图2.是在不同的融合构建体的制备中使用的PCR方法和克隆路线图的示意图。图2A的示意设计显示了在N_EGF_SK融合基因块的构建中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略。图2B的示意设计显示了在SK_EGF融合基因块的制备中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略。图2C的示意设计显示了在N_EGF_SK_EGF融合基因块的制备中使用的限制酶切消化和克隆策略。
图2D的示意设计显示了在结构域间SK_EGF(EGF4、5、6融合在SK的α和β结构域之间)融合基因块的制备中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略。图2Ε的示意设计显示了在结构域间SK_EGF(即EGF4、5、6融合在SK的β和Y结构域之间)融合基因块的制备中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略。图2F的示意设计显示了在tPA基因块的制备中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略。图2G的示意设计显示了在N_EGF_tPA和tPA_EGF融合基因块的制备中使用的限制酶切消化和克隆策略。图2H的示意设计显示了在tPA_EGF融合基因块的制备中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略，其中tPA的固有egf和三环I结构域被选择性地缺失。图21的示意设计显示了在N_EGF_tPA融合基因块的制备中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略，其中tPA的固有egf和三环I结构域被缺失。图2J的示意设计显示了在tPA_EGF融合基因块的制备中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略，其中tPA的固有egf结构域被EGF4、5、6结构域替代。图2K的示意设计显示了在tPA_EGF融合基因块的制备中使用的PCR、限制酶切消化和克隆策略，其中tPA的固有egf和三环I结构域被EGF4、5、6结构域替代。图3.纤溶酶原活化(吸光度405nm)的分光光度计法扫描显示了 N-端融合的EGF4、5、6和SK构建体对纤溶酶原活化的延迟，以及在有痕量的纤溶酶存在下的滞后的减少(细节参见‘在实施例中使用的 一般方法’)。应当指出，天然SK不会表现出纤溶酶原活化的任何显著滞后。图4.通过不同量(60_180nm)的不同融合构建体和指示的对照代表增加的凝血酶凝血时间测定。图5.在有不同的SK和EGF融合构建体和指示的适当对照存在下的蛋白C活化谱(细节参见‘一般方法’ )O图6.使用不同的tPA融合构建体(等摩尔；2nm)和指示的对照的凝血时间测定。图7.在有和没有可溶性纤维蛋白存在下，不同的tPA融合构建体以及指示的对照对纤溶酶原的活化。
具体实施例方式本发明涉及新的溶血栓融合多肽的设计和制备，与目前可得到的可利用形式(即组织纤溶酶原激活物、SK和SAK或它们的衍生物/修饰形式)相比，所述融合多肽表现出不同的功能优点，因为目前可得到的形式仅仅通过纤溶酶原活化而溶解纤维蛋白凝块，不能预防溶血栓以后的后果，所述后果在溶血栓治疗过程中导致早期再闭塞问题，这主要归因于凝血酶产生。本发明公开了使用直接和间接纤溶酶原活化剂制备融合构建体的方法，所述纤溶酶原活化剂与血栓调节蛋白的第4个、第5个和第6个EGF结构域融合，所述融合构建体保留不仅活化纤溶酶原、而且直接抑制凝血酶的能力，以及保留通过凝血酶介导的抗凝血途径活化蛋白C的能力。与蛋白的氨基酸序列有关的术语“变体”、“同系物”、“衍生物”、“片段”或“类似物”包括，对或向所述序列的一个(或多个)氨基酸的任何置换、变异、修饰、替代、缺失或添加，只要得到的蛋白或(多)肽具有的活性与未修饰的蛋白的活性等效。具体地，术语“同系物”涵盖就结构和/或功能而言的同源性。就序列同源性而言，优选地，与未修饰的蛋白的序列具有至少70%、更优选至少80%、甚至更优选至少85%同源性。优选地,与未修饰的蛋白的序列具有至少90%、更优选至少95%、最优选至少98%同源性。通常，就本发明的变体、同系物、衍生物、片段或类似物而言，可以产生的氨基酸置换的类型应当维持氨基酸序列的疏水性/亲水性。氨基酸置换可以源自例如1、2或3至10、20或30个置换，前提条件是，被修饰的序列保留根据本发明的作用能力。氨基酸置换可以包括使用非天然存在的类似物，例如以增加治疗上施用的多肽的血浆半衰期。例如，可以如下所示产生保守置换。在同一行中的氨基酸可以彼此置换:脂族的、非极性的 GAPILV极性的、不带电荷的 CSTMNQ极性的、带电荷的 DEKR芳族的 HFWY如上所指出的，通常通过重组方式，例如如本文所述，和/或通过使用合成方法使用技术人员众所周知的技术诸如固相合成，制备本发明的蛋白。本文使用的“缺失”定义为，核苷酸或氨基酸序列的变化，其中分别缺少一个或多个核苷酸或氨基酸残基。本文使用的“插入”或“添加”是核苷酸或氨基酸序列的变化，所述变化已经分别导致与天然存在的 蛋白相比一个或多个核苷酸或氨基酸残基的添加。本文使用的“置换”源自不同的核苷酸或氨基酸分别对一个或多个核苷酸或氨基酸的替代。本文使用的术语“4、5和6表皮生长因子样结构域”或“EGF4、5、6”可以是血栓调节蛋白的EGF4、5或6结构域中的任一个，或者可以表示共价地键合到一起成为肽或肽片段的血栓调节蛋白的所有3个EGF4、5和6结构域。4、5和6表皮生长因子样结构域中的每一个与表皮生长因子(EGF)蛋白的一个或多个结构域具有同源性。本发明公开了一种嵌合蛋白构建体，其包含与溶血栓蛋白融合的血栓调节蛋白的
4、5和6表皮生长因子样结构域(EGF4、5、6)，所述溶血栓蛋白选自:链激酶、组织纤溶酶原激活物、葡萄球菌激酶、尿激酶和它们的衍生物和类似物。在本发明的一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其中血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域在所述溶血栓蛋白或其衍生物或类似物的N-端、C-端或N和C两端处与所述溶血栓蛋白或其衍生物或类似物融合。本发明也公开了遗传构建体的设计，所述遗传构建体含有在编码溶血栓蛋白(SK、tPA或SAK)的N-端末端的部分处与溶血栓蛋白融合的EGF的最少必需抗血栓形成部分，其中翻译(在得到的‘嵌合的’ ORF中)从EGF的第4个结构域开始，继之以编码溶血栓多肽合成的部分。因而，成熟的多肽或折叠的蛋白不仅含有2种不同类型的蛋白，而且还具有二者的功能性。这些含有溶血栓蛋白的构建体被称作EGF N-端融合构建体。在另一个实施方案中，我们已经定义了在溶血栓蛋白的C-端侧融合的EGF结构域的设计原理和构建方法，其中首先融合编码相关部分(溶血栓药_EGF4、5、6)的寡核苷酸块，使得翻译从溶血栓蛋白开始，并在EGF的第6个结构域处终止，然后在表达系统中表达寡核苷酸杂合块，纯化杂合体，并试验它的纤溶酶原活化以及凝血酶抑制等。在这里，翻译的多肽从功能上有活性的溶血栓蛋白开始，且具有在C-端末端处的EGF结构域，因而也具有抗凝血酶和蛋白C活化能力。还已经公开了导致功能性多肽的制备的设计，其中嵌合多肽最初是无活性的，但是在被纤溶酶或凝血酶蛋白水解性截短以后获得它的纤溶酶原活化能力。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种包含链激酶的溶血栓蛋白，所述链激酶具有一个或多个氨基酸置换、插入、缺失或截短，且其中所述构建体具有纤溶酶原活化活性、凝血酶抑制活性和抗凝蛋白C途径活化活性。另一个实施方案含有制备N和C端融合构建体的方法，其中所述溶血栓蛋白同时含有在溶血栓蛋白的N和C端处的3个EGF结构域。在寡核苷酸块的表达以及使用确立的基因克隆方法等对它们的表达的辅助下设计这些构建体，其中通过共同的限制位点连接N-端和C-端EGF4、5、6融合构建体。在另一个实施方案中，公开了蛋白内融合体的设计，所述蛋白内融合体携带在溶血栓药(诸如链激酶和组织纤溶酶原激活物)内的EGF结构域。在另一个实施方案中，所述杂合/融合构建体具有组织纤溶酶原激活物，其中EGF4、5、6结构域替代tPA的三环I结构域。该构建体表现出良好的纤溶酶原活性以及抗凝血酶性质。另一个实施方案公开了 EGF结构域的氧化抗性形式，其中通过确定的定位诱变方法，在前述部分中描述的含有溶血栓药(SK、tPA和SAK)的N-端、C-端和N与C两端(同时)融合构建体中，用缬氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺氨基酸残基替代EGF4、5、6的甲硫氨酸。在本发明的另一个实施方案中，公开了血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域，它们融合在所述链激酶的α和β、或β和Y结构域之间，或者融合在链激酶衍生物或类似物的α和β、或β和Y结构域之间，其中所述链激酶衍生物或类似物包含一个或多个突变、添加、插入或截短，且其中所述构建体活化纤溶酶原、抑制凝血酶和活化抗凝蛋白C途径。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种构建体，其中EGF4、5、6结构域与链激酶或链激酶衍生物或类似物在一个或多个选自链激酶N-端、链激酶C-端、N-和C-链激酶两端的位置处或在链激酶的结构域间位置处发生框架内融合。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其中所述链激酶衍生物跨残基5-383或5-414。在本发明的其它实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其中所述链激酶衍生物跨残基16-383。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其中EGF4、5、6结构域在一个或多个选自链激酶N-端、链激酶C-端或N-和C-链激酶两端的位置处发生框架内融合，其中所述EGF4、5、6结构域的Met 41被缬氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺替代；或0端Met 435被缬氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺替代；或在同时的N-和C-端融合构建体中，Met 41和Met 435独立地被缬氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺替代。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其另外包含转谷氨酰胺酶识别序列。在本发明的其它实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其另外包含在EGF4、5、6结构域与溶血栓蛋白或其衍生物或类似物的接点处的一个或多个凝血酶可切割序列。在另一个实施方案中，所述杂合/融合构建体包含在EGF4、5、6和它们的氧化抗性形式的接点处的凝血酶可切割位点。在另一个实施方案中，所述杂合/融合构建体含有EGF4、5、6结构域，所述结构域被突变，以具有由于甲硫氨酸氧化和因此在它们制备过程中活性丧失的氧化抗性。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其包含在下述位置与组织纤溶酶原激活物(tPA)衍生物、类似物或片段融合的血栓调节蛋白的EGF4、5、6结构域:在tPA衍生物、类似物或片段的N-端处，在tPA衍生物、类似物或片段的C-端处，在tPA衍生物、类似物或片段的两端处，或在tPA衍生物、类似物或片段内部。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其中EGF4、5、6结构域和tPA衍生物、类似物或片段之间的融合体另外包含一个或多个接头片段。在本发明的其它实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其中所述一个或多个接头片段包含一个或多个促进所述构建体的柔性的氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其中所述一个或多个氛基酸选自:Gly、Asn、Pro、Ser> Gin、Arg 和 Lys。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其中所述tPA衍生物、类似物或片段包含一个或多个突变、添加、插入或截短，且其中所述tPA衍生物、类似物或片段活化纤溶酶原、抑制凝血酶和活化抗凝蛋白C。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其包含与一个或多个血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域融合的组织纤溶酶原激活物(tPA)的片段或其截短或修饰形式，使得tPA的EGF结构域被一个或多个血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域替代，且其中所述构建体具有抗凝血酶和纤溶酶原活化活性。在本发明的其它实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其包含与一个或多个血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域融合的组织纤溶酶原激活物(tPA)的片段或其截短或修饰形式，使得tPA的三环I和EGF结构域被一个或多个血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域替代，且其中所述构建体具有抗凝血酶和纤溶酶原活化活性。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其中在tPA片段的N-端或C-端处的tPA EGF结构域和三环I结构域被一个或多个血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域替代。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其另外包含一个或多个在tPA片段或其截短或修饰形式和血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域之间的接头片段，所述接头片段包含促进构建体柔性的氨基酸残基，使得所述构建体具有凝血酶抑制、蛋白C活化和纤溶酶原活化能力。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其中所述EGF4、5、6组分的甲硫氨酸41被丙氨酸、缬氨酸或谷氨酰胺替代。在本发明的其它实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其包含血栓调节蛋白的EGF4、5、6结构域，所述结构域与葡萄球菌激酶(SAK)的N-端或C-端末端发生框架内融
八
口 ο 在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其中所述血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域的甲硫氨酸41被丙氨酸、缬氨酸或谷氨酰胺替代。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其另外包含在SAK和EGF4、5、6结构域区域之间的凝血酶可切割序列。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其另外包含转谷氨酰胺酶交联序列。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其中所述构建体可溶于水溶液或盐水溶液中。在本发明中，在另Iv实施方案中，由在紧S调节的启动子控制下的质粒表达所述重组嵌合蛋白。在本发明的一个实施方案中，通过重组DNA技术，在合适的宿主(诸如细菌、真菌、酵母或动物细胞)中表达各种嵌合构建体。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其分泌进细胞外培
养基中。在另一个实施方案中，在原核和真核宿主中表达组织纤溶酶原激活物和EGF4、5、6融合构建体，从所述宿主收获所述多肽，以获得纯形式的有活性的杂合构建体。在另一个实施方案中，还在真核系统(如动物细胞系、酵母表达系统和植物细胞)中表达含有EGF构建体的各种组织纤溶酶原激活物融合体，其中表达盒整合进宿主基因组中，或作为附加体保留在细胞质中。表达的杂合蛋白可以是糖基化的或未糖基化的，取决于用于表达的宿主。

在本发明的另一个实施方案中，公开了一种治疗哺乳动物的血栓形成的方法，所述方法包括:给所述需要治疗的哺乳动物施用治疗有效量的嵌合蛋白构建体。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种抑制凝血酶的方法，所述方法包括:使用嵌合蛋白构建体。在本发明的其它实施方案中，公开了一种活化蛋白C的方法，所述方法包括:使用嵌合蛋白构建体。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种提供抗凝血酶和纤溶酶原活化的方法，所述方法包括:使用嵌合蛋白构建体。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种药物制剂，其包含药学有效量的嵌合蛋白构建体。在本发明的另一个实施方案中，公开了一种在哺乳动物中溶栓的方法，所述方法包括:给所述有此需要的哺乳动物施用治疗有效量的嵌合蛋白构建体。在另一个实施方案中，为合适的表达宿主优化所述杂合构建体的编码DNA序列。在另一个实施方案中，公开了一种核酸序列，其编码上述的嵌合蛋白构建体。在另一个实施方案中，公开了一种包含上述核酸序列的载体。在另一个实施方案中，公开了一种包含上述载体的宿主细胞。在另一个实施方案中，公开了一种嵌合蛋白构建体，其通过在宿主细胞表达系统中表达编码所述蛋白的核酸序列而制备。在另一个实施方案中，公开了一种制备嵌合蛋白构建体的方法，其中在宿主细胞表达系统中表达编码所述蛋白的核酸序列。
在另一个实施方案中，所述方法中的宿主细胞表达系统是真核表达系统。在另一个实施方案中，所述方法中的宿主细胞表达系统是细菌表达系统。在另一个实施方案中，所述方法中的细菌是大肠杆菌。在另一个实施方案中，所述方法中的真核表达系统是动物细胞或酵母细胞。在另一个实施方案中，所述方法中的酵母是巴斯德毕赤酵母。在另一个实施方案中，所述方法中的嵌合蛋白构建体从宿主细胞分泌进细胞外培养基中。在另一个实施方案中，所述纯化的构建体可用作治疗剂和用于药物组合物中，所述治疗剂和药物组合物用于治疗具有各种血栓性病症的哺乳动物。哺乳动物可以是人类、啮齿类动物或家养的动物。在另一个实施方案中，所述纯化的构建体与或不与额外的稳定剂和赋形剂一起用作治疗剂，以减轻各种循环病症。根据本发明的另一个实施方案，将所述纯化的构建体配制进一种或多种药物组合物中。含有一种或多种纯化的构建体的药物组合物可以配制成固体形式(即在管形瓶中冷冻干燥，用于以后在合适的溶液中重构)或液体形式。在一个具体实施方案中，这些含有纯化的构建体的组合物构成用于溶血栓疗法或治疗的试剂盒，所述试剂盒可以任选地包括其它组件，诸如:装有用于重构活性成分的溶液的容器，插管，装有用于静脉内施用的生理浆液的滴注袋，和使用说明书，等。所述药物组合可以以组合形式(即，其中所有活性成分组合在一个制剂中)或以单个形式(即，其中所述 活性成分没有组合(或没有全部组成)在一个制剂中)配制和使用，作为:用于口服给药的片剂、胶囊剂或酏剂；用于直肠给药的栓剂；用于注射给药的无菌溶液、混悬液；等。可以调节给药剂量和方法以实现最佳效力，但是取决于诸如下述因素:患者体重、饮食、并行的药物治疗和医学领域的技术人员会认识到的其它因素。通常，就本发明的纯化的构建体(包括用途、方法、药物组合物和产品)而言，取决于使用的纯化的构建体的效能，施用0.1-1OOOmg之间的量(作为单次剂量或多次剂量，视需要而定)。优选的实施方案包括为贮存和随后的施用而制备的药物组合物，其包含治疗有效量的纯化的构建体或本文所述的纯化的构建体在药学上可接受的载体或稀释剂中的富集组合物。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂是药学领域众所周知的，且描述在例如Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing C0.(A.R.Gennaro 编，1985)中。可以在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至矫味剂。例如，可以加入苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯作为防腐剂。另外，可以使用抗氧化剂和助悬剂。在体内联合治疗中采用所述纯化的构建体或它们的药物组合物或产品时，可以采用多种剂型以多种方式将所述组合物/产品施用给哺乳动物，所述方式包括肠胃外地(例如静脉内地、皮下地、肌肉内地、结肠地、直肠地、鼻地、含服的、透皮地、阴道地或腹膜内地)。本领域技术人员会容易地明白，要施用的有用体内剂量和具体给药模式将随治疗的哺乳动物物种、采用的具体组合物和这些组合物的具体用途而变化。有效剂量水平(也就是实现期望的结果所需的剂量水平)的确定，是在本领域技术人员的能力范围内。通常，在较低的剂量水平开始使用组合物，逐渐增加剂量水平，直到达到期望的效果。通常，在实现本发明的方法中，所述纯化的构建体或药物组合物的剂量可以随期望的效果和治疗适应症宽泛地变化。通常，所述纯化的构建体的合适的剂量是约0.1mg至IOOOmg,优选地约IOmg至500mg,更优选地约IOmg至150mg,最优选地约IOmg至120mg。施用优选地是肠胃外的，诸如静脉内的。施用也优选地是作为单次剂量或多次剂量，视需要而定。施用优选地是肠胃外的，诸如静脉内的。施用也优选地是作为单次剂量或多次剂量，视需要而定。可以以常规形式将注射剂制成液体溶液或混悬液、适用于在注射之前在液体中重构为溶液或混悬液的固体形式、或乳剂。合适的赋形剂是，例如，水/盐水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、清蛋白、谷氨酸钠、盐酸半胱氨酸等。另外，如果需要的话，可注射的药物组合物可以含有少量无毒的辅助物质，诸如润湿剂、PH缓冲剂等。如果需要的话，可以利用吸收增强制剂(例如脂质体)。就肠胃外施用而言，可以使用根据本发明的药学活性剂在芝麻油或花生油中或在丙二醇水溶液中的溶液。如果必要的话,可以适当地缓冲水溶液(优选地在pH4至pH9之间)，并首先使液体稀释剂是等张的。例如，将NIF用于pH为约7的水溶液中。但是，NIF在低至约PH4的水溶液中是稳定的。优选的“配偶体化合物” t-PA(或其变体)通常用于PH为约5的水溶液中。这些水溶液适用于静脉内注射目的。所述油溶液适用于关节内、肌肉内和皮下注射目的。通过本领域技术人员众所周知的标准制药技术，可以容易地在无菌条件下制备所有这些溶液。应当指出，可以低压冻干本发明的药物组合物和产品进行贮存，然后使用本领域技术人员众所周知的方法进行重构并随后施用。不论是作为冻干粉剂(Iyophile)还是以其它方式储存，本发明的组合中的活性组分可以在冷冻干燥之前或重构之后混合到一起(用于以后共同施用)，或单独储存(用于以后同时、分别或相继施用)。

在一个具体实施方案中，施用是肠胃外的，例如通过静脉内注射，或通过导管插入术局部地施用，用于在凝块附近原位施用。可以存在于本发明提供的药物组合的组合物中的纯化的构建体的量，可以在宽范围内变化，但是总是处于治疗上有效的量。使用本发明的药物组合的组合物的每个溶血栓治疗方案的剂量将取决于众多因素，包括患者的年龄、状况、要治疗的临床病症的严重程度、在每种情况下将要施用的纯化的构建体的给药途径和频率。在一个方面，本发明涉及用于溶血栓治疗的已经描述的本发明的药物组合或试剂盒。在另一个额外方面，本发明也涉及一种治疗和溶血栓治疗方法，所述方法包括:给患者施用治疗上有效量的一种或多种纯化的构建体。在这方面，根据本发明的组合物特别适合用于治疗缺血性心脏病和它的并发症、以及缺血性脑卒中、类风湿病和其它病状，在所述其它病状的发病机制中存在炎症反应、组织缺血、由血栓形成造成的血液流变学和血管微循环的紊乱。本发明公开了组织纤溶酶原激活物与血栓调节蛋白的EGF4、5、6结构域的融合构建体，其具有含有6个氨基酸的接头序列。可以改变或调节该接头序列长度和氨基酸序列次序，以进一步优化两种性质的功能。与具有接头的构建体相比，最初设计的没有接头序列的构建体仅表现出含有优化过的接头的不同构建体的蛋白C活性的小部分，大致20-25%。在另一个实施方案中，本发明公开了通过标准基因工程方法来制备编码非天然融合蛋白的基因块和它们的变体。此外，蛋白间融合接头序列优选地在EGF4、5、6结构域与纤溶酶原活化剂组分的接头部位处含有3个或更多个甘氨酸氨基酸残基，从而为EGF的第4个结构域提供必要的柔性，所述第4个结构域在蛋白C结合和活化中起关键作用。类似地，当它们与tPA的N-端区域融合时，将接头放在EGF的第6个结构域之后并与其紧邻，使得它会促进凝血酶结合。在将EGF4、5、6引入组织纤溶酶原激活物的有序结构/结构域之间的情况下，这特别适用。因而，当融合2个配偶体以保留两种配偶体蛋白的功能性时，接头的作用是显而易见的。以下述方式选择接头序列:其中将一个带正电荷的氨基酸(赖氨酸或精氨酸)与Val残基串联，但是在2个或3个甘氨酸残基的前面，使得它可以被在凝块附近(在溶解过程中，在此处短暂形成凝血酶的机会非常高)的纤溶酶切割，并且2个结构域可以在损伤部位处独立地发挥它们的作用。所述接头也含有一个脯氨酸氨基酸，该氨基酸实际上帮助改变EGF4、5、6结构域的定向，使得它们可以在结合凝血酶和活化蛋白C的同时最佳地工作。在另一个实施方案中，可以增加或减少设计的构建体接头长度，以及可以用天然的和非天然的氨基酸改变氨基酸序列，以便影响活化的速率。在另一个实施方案中，可以将凝血酶可切割序列、转谷氨酰胺酶识别序列和其它血液蛋白酶敏感的部位 引入接头中，而不影响纤维蛋白溶解功能和抗血栓功能。在另一个实施方案中，本发明公开了多种融合多肽和它们的更好变体的表达和纯化方法。在另一个实施方案中，本发明公开了多种非天然的多肽，它们表现出溶血栓性质和抗凝血酶性质以及蛋白C抗凝血性质的组合性质。在另一个实施方案中，将EGF4、5、6的氧化抗性形式与功能上改进的组织纤溶酶原激活物变体融合，所述变体具有与天然tPA (例如DNA SEQ ID 20)相比突变的变异。在另一个实施方案中，将EGF4、5、6的氧化抗性形式与链激酶的纤溶酶抗性形式融合。在另一个实施方案中，将EGF4、5、6的氧化抗性形式与溶血栓蛋白融合，其中一个或多个半胱氨酸残基是游离的。在另一个实施方案中,将表达的融合多肽用于治疗心血管疾病。在另一个实施方案中，合适的药物组合物具有表达的融合多肽和FDA批准的化学稳定剂如甘露醇、人血清清蛋白(HSA)等和增溶剂。表达的融合构建体可以配制用于给人类静脉内给药，其可以含有FDA批准的稳定剂。在另一个实施方案中，EGF4、5、6和它的变体可以与尿激酶型纤溶酶原活化剂融
口 ο在另一个实施方案中，可以用这样的蛋白制备不同的EGF融合构建体:所述蛋白表现出与SK、tPA和SAK的75-100%同源性，且表现出它们的天然蛋白的50-100%的纤溶
酶原活化潜力。在另一个实施方案中，将EGF4、5、6的变体与SK、tPA和SAK融合，其中EGF4、5、6变体与独立地表达的天然EGF4、5、6结构域相比表现出75-100%同源性/相似性和50-100%抗凝血酶和蛋白C活性。试剂遗传构律体:EGF4、5、6结构域序列是人血栓调节蛋白cDNA的结构域序列，所述cDNA为了在酵母巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中的最佳表达而商业地定制合成(GeneScriptInc.，美国)。以正确的次序连接合成的基因区段，并克隆进细菌质粒中。基本上通过下述方式的组合，制备血栓调节蛋白的EGF4、5、6结构域(在一个方面)和溶血栓药例如SAK、SK或tPA(或它们的衍生物/突变体)之间的融合构建体:(a)使用化学方法进行定制基因合成，和(b)使用充分确定的PCR技术，使用得自适当质粒的特异性地设计的引物，获得选择的基因区段(参见下面的实施例中使用的方法)，随后分离PCR制备的基因区段块，并使用专门的PCR方法诸如重叠延伸PCR等，将它们在框架内‘融合’。通常，使用具有适当的高持续合成能力的热稳定的DNA聚合酶(得自FermantasInc.或Stratagene Inc.的Pfu DNA聚合酶)或高保真度pfu turbo (Stratagene Inc.)酶,进行常规PCR。通过转化进下述的适当大肠杆菌菌株中，在基于17 RNA聚合酶启动子的表达载体pET-23d中克隆/表达杂合DNA构建体:菌株XL-Blue (用于常规质粒亚克隆，没有伴随的蛋白表达)，和菌株BL21(DE3)(用于在I7RNA Pol启动子下的蛋白表达)，它们从Novagen Inc.(Madison, WI,美国)获得，并也在甲醇诱导型启动子(其具有在载体PPIC-9K中的框架内a-交配因子信号序列)下在酵母(巴斯德毕赤酵母)中表达，并且将GSl 15细胞用于表达(InvitrogenLife Technologies, California,美国)。从 New England Biolabs (Beverly,MA)获得各种限制性内切核酸酶、T4 DNA连接酶和其它DNA修饰酶。寡核苷酸引物由加拿大的Biobasic，Inc.供给。使用可从Qiagen GmbH(德国)得到的试剂盒,进行DNA纯化和得自琼脂糖凝胶的PCR扩增产物的提取。在配有16-毛细管装置的Applied Biosystems 3130 xl基因分析仪上，使用突光染料进行自动化DNA测序。Glu-纤溶酶原购自Roche DiagnosticsGmbH(Penzberg,德国)，或通过亲和色谱法(Deutsch和Mertz, 1970)从人血衆中纯化。人蛋白C、凝血酶、水蛭素购自美国的Calbiochem,标准的兔血栓调节蛋白和重组血栓调节蛋白都购自美国的 American Diagnostica Inc.。用 Applied Biosystems 测序仪 491 型,进行N-端气相氨基酸测序。尿激酶、EACA、氰基硼氢化钠和L-赖氨酸购自美国圣路易斯的Sigma Chemical C0.。从 GE-Amersham (Uppsala,瑞典)获得苯基琼脂糖 6XL 和 DEAE 琼脂糖(Fast-Flow)，从Qiagen获得N1-NTA珠子。所有其它试剂都具有可得到的最高分析等级。在实施例中使用的一般方法:1.重组DNA融合方法:通称作重组DNA技术的多种方法现在是分子生物学领域众所周知的。几种技术、标准方案和它们的改进形式已经在基本参考书中进行了非常充分的描述，如:Sambrook 等人， Molecular Cloning:A laboratory Manual (第 II 版，ColdSpring Harbor Press, New York., 1989 ；McPherson, M.J., Quirke, P.,和 Taylor, G.R.,[编]PCR:A practical approach.，IRL Press, Oxford.，1991)。但是，在融合构建体的设计中需要几处改进，其中为特定应用引用得自不同公开文献的不同公开内容。在本发明中，当融合2个基因时,我们依赖于Ho等人(Ho, Hunt等人.1989)以及Mehta和Singh (Mehta和Singh 1999)的称作重叠延伸PCR的方法。对于最高达2Kb的小构建体扩增而言，使用pfuDNA聚合酶(Fermentas Inc.,美国)，对于其中为了点突变构建而需要高保真度聚合酶反应的更长PCR而言,使用pfu turbo (Stratagene)进行6_7Kb长的片段扩增和定位诱变(Wang 和 Malcolm 1999)。2.限制酶切消化和连接:限制酶切消化酶和连接酶得自美国的New EnglandBiolabs,并根据生产商的方案使用Fermantas Inc.的‘快速消化剂’限制性酶。关于几乎所有嵌合融合体构建实施例，在Xho I (四碱基切割酶)和Not I (六碱基切割酶)消化的载体和插入片段之间进行连接，使定向克隆的机会最大化。

3.将连接混合物电穿孔进大肠杆菌XL IB感受态细胞中和含有线性化的插入片段的载体在PPIC-9K中的转化:将反应的连接混合物电穿孔进XL IB感受态细胞中(Sharma和Schimke 1996)。按照说明书,用Qiagen的Midi制备试剂盒制备大量DNA。在Midi制备的最终步骤中，在高盐浓度中洗脱DNA，在这里我们使用在终浓度为pH5的0.3M醋酸钠，并使用70%乙醇除去多余的盐(SambiOok等人，1989)，所述盐可能干扰消化反应。通过该过程，我们得到50-60 μ g DNA，在Bgl II酶的帮助下对所述DNA进行线性化步骤，在消化以后，再次进行醋酸钠和乙醇沉淀步骤，最后将干燥的沉淀物溶解在7-8μ I高压灭菌的无盐水中，这时得到1-3 μ g/μ I的DNA。在这里，将7-10yg DNA用于转化进巴斯德毕赤酵母的His_GSl 15细胞的电感受态细胞中，最后铺板在最小限量葡萄糖上，这时仅His+转化体在平板上生长。以下述方式设计质粒pPIC-9k:使得通过与AOX I启动子的同源重组，可能实现目标基因的多拷贝插入(Ramchuran, Mateus等人,2005)。通过用递增的抗生素浓度监测庆大霉素抗性群体，通过细菌卡那霉素抗性基因(Tn903)，可以监测多拷贝靶基因插入。毕赤酵母可以耐受0.25mg/ml这样的庆大霉素抗性,但是0.5mg/ml和4mg/ml分别显示出1-2拷贝和7-12拷贝插入。庆大霉素抗性与目标基因的多插入直接相关。由于基因剂量效应，可以推论，目标基因产物的分泌越高，对应着越高的插入数目(Norden, Agemark等人.2011)。4.融合构建体包涵体的表达、分离和重折叠.在pET 23-d下表达了一些构建体，诸如EGF-SAK和SAK-EGF，其中所述嵌合蛋白以包涵体的形式积累在宿主大肠杆菌BI21-DE 3细胞中。在形成包涵体的情况下,得到最大量的过表达的蛋白(Misawa和Kumagai1999 ;Zhang，Xu等人.2009)。将大肠杆菌BL21 DE3细胞用于生产嵌合的融合蛋白包涵体，其中使用25ml得自过夜培养的BL21 DE3细胞培养物的LB (Luria Bertani)作为主要接种物，将其转移至500ml LB (继代培养)培养基。一旦OD6tltl达到0.6-0.8，在ImM IPTg帮助下诱导蛋白产生。诱导以后，将细胞在摇动条件下在40°C保持6小时。6小时温育以后，通过在4°C在6000rpm离心10分钟，收获细胞。最后，用50mM tris、IOOmM NaCl和ImM EDTA溶液洗涤收获的细胞，以从细胞团除去培养基组分。洗涤以后，将细胞悬浮于洗涤溶液中，至最终OD6tltl在35-40之间；在该稀释度，用基于探头的超声破碎器对细胞进行超声处理45分钟，其中使用30秒开/关循环。在溶解循环结束以后，通过在12，OOOrpm离心15分钟，收获细胞沉淀物。用 IOOmM NaCl、50mM Tris Cl pH7.4、lmM EDTA、0.1 % TritonX-100 和 2M含脲溶液洗涤得到的沉淀物2次。再次将这些包涵体再悬浮于溶液中，并通过在12000rpm离心15分钟进行收获。用IOOmM NaCl、50mM Tris Cl pH7.4和ImM EDTA溶液洗涤收获的沉淀物2次，从而除去Triton X-100。最后，将沉淀物再悬浮于8M脲(在20mM Tris Cl pH7.4中制备)和ImM DTT中保持2小时。通过在12000rpm离心20分钟，使溶解在该溶液中的大部分包涵体与沉淀物分离，最终的上清液含有最大部分的嵌合融合蛋白。现在，对该蛋白级分进行重折叠，其中将它稀释至0.2mg/ml，并在下述条件下重折叠:2M脲，氧化型和还原型谷胱甘肽摩尔比为1.5: 0.5，在50mM NaCl、50mM Tris_Cl、2%甘油中，在4°C保持36小时，进行极轻微的搅拌。在该重折叠步骤结束以后，将所述混合物在20mM Tris Cl pH7.6和50mM脲中透析48小时，使用疏水和离子交换色谱法，通过串联的色谱法纯化透析的反应混合物。通过DTNB反应(Riener，Kada等人.2002)监测二硫键形成，所述DTNB反应是二硫键形成和重折叠的直接指示。最后，对纯化的蛋白进行不同的活性测定。5.用于检测纤溶酶原活化的酪蛋白-纤溶酶原覆盖:在融合构建体中，在初步水平，通过该方法筛选纤溶酶原活化，其中在含有15mM NaCl和50mM Tris的水中与1%琼脂糖一起煮沸5% (w/v)脱脂奶。冷却后，将约200-400 ii g纤溶酶原加入该混合物中，并覆盖在含有氨苄西林的LB平板上，所述平板具有要筛选的菌落/克隆(Malke和Ferretti1984)。通过温育l_2h之间且最多18h的时段以后的水解带(由于降解酪蛋白的纤溶酶的形成，从而产生相对于白色背景的可容易看到的澄清带)，容易地检测具有纤溶酶原活化能力的所有融合的重组蛋白。6.通过检查纤溶酶原活化谱来筛选最佳生产克隆:在使用庆大霉素抗性的标志物选择含有较高拷贝数的转化体以后，进行最佳生产克隆的实际筛选。在该方法中，在2.5ml BMGY培养基(1%酵母浸出物、2%蛋白胨、IX甘油、IX不含氨基酸的酵母氮源和IOOmM磷酸钾缓冲液pH5.5)中在30°C培养原代培养物16-18小时。一旦光密度(OD6J达至IJ 3-4单位，通过加入7.5ml BMMY培养基(I%酵母浸出物、2%蛋白胨、IX甲醇、IX不含氨基酸的酵母氮源和IOO mM磷酸钾缓冲液、pH5.5)来诱导培养物。用最终的0.5v/v%甲醇进一步诱导这些培养物5天进行重组生产，从而在强甲醇诱导的启动子影响下生成重组融合蛋白。7.酶谱法:通过该方法，检测细胞外分泌的产物和希望的具有纤溶酶原活化能力的目标带，其中在非还原性的样品缓冲液中跑10-12.5% SDS-page凝胶。结束以后，通过在
2.5% triton X-100溶液中洗涤，除去多余的十二烷基硫酸钠。然后，用50mMTris (pH7.4)冲洗该凝胶2-3次。将该洗过的凝胶放在含有脱脂奶、琼脂糖和纤溶酶原的固体表面(琼脂凝胶)上。温育5-7小时以后，可以看到水解带的形成，其表明分离的蛋白的纤溶酶原活化能力。8.蛋白质印迹技术:在蛋白质印迹法帮助下，检测目标蛋白。通过在6000rpm离心的帮助，分离从巴斯德毕赤酵母细胞分泌进细胞外培养基中的所有融合构建体，并取上清液用于期望的产物鉴别。将上清液原样直接用于蛋白质印迹法，或首先通过5KDa或IOKDa截止范围浓缩器(Amicon)进行浓缩，或进行三氯醋酸沉淀、用丙酮洗涤并加载上10-12.5% SDS聚酰基酰胺凝胶。借助于含有25mM tris、175mM甘氨酸和20%甲醇的转移缓冲液，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。在250mA，在膜上进行凝胶印迹35分钟。将印迹的膜浸在10%脱脂奶中在4°C过夜，或在37°C温育2小时。用含有0.1%吐温-20的磷酸盐缓冲盐水进一步洗涤该印迹3次，除去多余的脱脂奶。将所述印迹在推荐稀释浸入第一抗体或polysera中进行lh，并用含有吐温-20的PBS洗涤3次。进一步，与HRP缀合的第二抗体一起温育该印迹，随后用PBS洗涤3次。最后，通过加入DAB (二-氨基联苯胺)溶液，使印迹显影。9.赖氨酸-琼脂糖色谱法:不同的组织纤溶酶原激活物与EGF4、5、6的融合构建体含有三环结构域，已知所述结构域对赖氨酸残基的亲和力(McCance, Menhart等人.1994 ；Ye, Rahman等人.2001)。在该方法中，将从巴斯德毕赤酵母发酵得到的上清液(其具有组织纤溶酶原激活物融合多肽)在磷酸盐缓冲液PH7.5中透析3-4小时，并以约
0.5ml/min的缓慢流速加载上用磷酸盐缓冲液预平衡的赖氨酸-琼脂糖柱(购自AmershamBiosciences,Uppasala,瑞典)。加载结束以后,再用4_5个床体积的磷酸盐缓冲液洗漆柱，最后在0.3M ε氨基己酸和IOOmM NaCl溶液中洗脱蛋白(Qiu，Swartz等人.1998)。10.凝血酶亲和色谱法:通过以前描述的操作(Salem, Maruyama等人.1984),在溴化氰活化珠子上进行凝血酶偶联。在这里，最后对得自不同纯化步骤的蛋白进行凝血酶亲和，其中在50mM Tris Cl pH 7.4中平衡柱，并在50mM Tris Cl pH 7.4中透析，用于以约0.5ml/min的缓慢流速加载；在加载结束以后，用相同的缓冲液洗涤柱。最后，用递增的NaCl梯度洗脱蛋白(Salem, Maruyama等人.1984)。然后试验不同的蛋白级分的蛋白C活化能力。11.疏水相互作用色谱法:通过不同的色谱方法，纯化EGF-SK、EGF_tPA和EGF-SAK的不同融合基因构建体，其中使用疏水和离子交换色谱法进行随后的不同融合多肽纯化(Goyal, Sahoo等人.2007)。在疏水色谱法中，使用苯基琼脂糖(Amersham Biosciences,Uppasala,瑞典)6%交联的珠子(平均粒度为100-300 μ M大小的直径)进行柱制备。借助于螺动泵，填充简单的ΧΚ16/20柱(Amersham Biosciences, Uppasala,瑞典)，制备大约25ml苯基琼脂糖床，并用4-5个床体积的0.3M NaCl和50mM tris平衡，通过透析将在巴斯德毕赤酵母发酵过程中并行得到的上清液(含有期望的融合构建体)维持在与平衡缓冲液相同的缓冲液强度和盐组合物中。以40ml/hr流速将平衡的上清液加载上填充的柱，并在上清液加载结束以后，使4-5个床体积的平衡缓冲液穿过，以除去培养基组分和非特性地结合的杂质，最后在水中洗脱希望的融合多肽。对洗脱的蛋白进行第二轮纯化(参见下文)，并关于纤溶酶原活化、凝血酶抑制和蛋白C活化测定进行试验。12.DEAE(二乙基氨基乙基)离子交换色谱法:在该色谱操作中，将DEAE琼脂糖 fast flow 装填进)(K 16/20 柱(Amersham Biosciences, Uppasala,瑞典)中，并且一般遵循生产商的说明书，其中主要使用20ml溶胀的基质进行填充。用20mM Tris Cl缓冲液PH7.4平衡该柱，将得自巴斯德毕赤酵母的上清液在20mM Tris Cl缓冲液pH7.4中充分透析以后，加载上经过平衡的柱(分批)，或者在通过疏水相互作用色谱法(上面)纯化以后，将它的离子强度维持与平衡缓冲液相同，加载上各个柱。在加载结束以后，用4-5个床体积的平衡缓冲液洗涤每个柱，这有助于除去非特异性地或松散地结合的杂质和多肽。通过将递增的IM NaCl梯度应用于5个床体积的基质上,洗脱蛋白。借助于Bradford方法(Bradford 1976)，进行蛋白量化，并与BSA的标准曲线进行对比。最后，通过20K Da截止浓缩器(Amicon)，浓缩纯化的蛋白 ，并用于各种分析测定和功能测定。13.EFG-溶血栓融合构建体的纤溶酶原活化测定:所有嵌合的融合多肽构建体含有溶血栓组分(SK、SAK和tPA)，所以通过纤溶酶的产色肽底物的颜色释放，测量了这些构建体的活化纤溶酶原的能力。在使用2iiM人纤溶酶原、50mM Tris、0.05% BSA和5mM生色底物的条件下，进行了链激酶和所有融合构建体的单阶段测定，并通过分光光度计法监测随时间而变化的生色底物的释放。它遵循非线性回归，因此吸光度和时间2之间的图遵循直线方程式。链激酶立即开始纤溶酶原向纤溶酶的转化，且实际上没有表现出活化的延迟，但是在一些融合构建体的情况下，将纤溶酶原活化成纤溶酶需要延长的时间。这指示，痕量的纤溶酶会形成活性复合物，因为纤溶酶原向纤溶酶的酶原活化(途径I)是没有活性的。当逐渐加入痕量(纳摩尔)的外部纤溶酶会逐渐减少延迟时间时，这得到确认。在组织纤溶酶原激活物活化纤溶酶原的情况下，进行快速的且简单的分光光度测量方法，其中使用简单的生色肽(H-D-Val-Leu-Lys-pNA ;S_2251 ;购自Chromogenix Inc.)检测通过组织纤溶酶原激活物的作用而形成的纤溶酶(Verhei jen,Mullaart等人.1982)。该方法也用于验证在有纤维蛋白存在下增强的纤溶酶原活化和组织纤溶酶原活化(van Zonneveld, Veerman等人.1986)。在该活化测定中，在有和没有可溶性纤维蛋白(购自American Diagnostics,美国)存在下，且在没有纤维蛋白存在下，使用不同量的纯化蛋白与2 PM纤溶酶原、0.05MTris Cl ph 7.2、100mM NaCl、0.05%和 0.5mM S-2251 温育。以 I 分钟间隔时间，监测在405的吸光度最多2小时。14.使用不同的融合构建体的凝血时间实验:为了观察在有不同的嵌合构建体存在下对凝血酶诱导的凝块形成的影响，制备了具有不同凝血酶浓度的标准曲线，使用6.6IU的凝血酶从该标准曲线得到20秒凝血时间。然后将相同量的凝血酶与递增浓度的构建体一起温育，以测量凝血时间与对照相比倍增时的浓度(Lougheed, Bowman等人.1995)。15.不同的融合/嵌合构建体对蛋白C的活化:以剂量依赖性的方式，对组织纤溶酶原激活物、葡萄球菌激酶和链激酶的不同的融合构建体进行凝血酶介导的蛋白C活化测定。在该测定中，在有50mM Tris-Cl、5mM CaC12和0.05% BSA存在下，将不同量的蛋白(在nM范围内)与IOnM凝血酶一起在37°C温育20min。该时间以后，将0.5 y M蛋白C加入孔中，并在25°C温育20分钟。此后，加入0.5mM水蛭素以抑制凝血酶，并继续在25°C温育5分钟，然后以0.5mM终浓度加入生色底物，并如以前所详述地(Eisenberg，Miletich等人.1988 ；Ewald 和 Eisenbergl995 ；Lougheed, Bowman 等人.1995 ；Meininger, Hunter 等人.1995 ；Dahlback和Villoutreix2005)，在405nm监测有色的pNA相对于时间的释放。实施例给出下述实施例来例证本发明，因此它们不应当解释为限制本发明的范围。实施例1链激酶和EGF4、5、6结构域之间的不同融合基因的制备:(i)在编码SK的开放读码框(ORF)上游的、用于表达框架内融合的EGF结构域的杂合基因构建体:使用引物N_EGF_SKFp I和N_EGF_SKRp 2 (引物序列参见表I)，构建了双链(ds) DNA块，其编码EGF-SK蛋白融合体，其中编码EGF4、5、6的序列在编码N-端的SK ORF侧框架内融合。Nihalani等人，1998已经描述了细菌表达载体pET23_d_SK的设计和构建。它包括:从PBR 322中的 类马链球菌H46A克隆SK基因(Pratap等人，1996)，随后亚克隆进pET-23d中，所述pET-23d是含有得自噬菌体T7主要衣壳蛋白的非常有效的核糖体结合位点的表达载体(Studier和Moffatt, 1986),并进一步修饰该基因的5'末端，以使形成二级结构的倾向最小化。从pET-23-d_SK构建体表达的链激酶是Met-SK。其它细节参见美国专利号7，163,817。该构建体用作扩增SK基因(DNA SEQ ID I和对应的蛋白SEQ ID 113)的模板。
使用与序列ID 2相对应的合成基因(DNA多核苷酸)作为模板，选择性地扩增与EGF4、5、6结构域(SEQ ID 2和对应的蛋白SEQ ID 111)相对应的双链多核苷酸块，所述合成基因通过定制DNA合成来制备,并在克隆进pET 23-d (Novagen)载体中以后,通过对序列ID2的自动化的DNA测序进行验证。引物N_EGF_SK Fpl也含有(关于引物的详细描述，参见表I)在它的5’末端处的Xho I限制位点，使得在PCR以后得到的结果基因块可以入坞进酵母表达质粒中。引物N_EGF_SK Rp 2含有在5’末端处的序列(除了与EGF4、5、6的第6个结构域的末端杂交的核苷酸以外)以及与SK基因ORF的5侧对合的额外核苷酸。PCR循环条件如下:热启动，在95°C完全变性5分钟；共28个在95°C变性45秒、在45°C退火45秒、在72°C延伸I分钟的循环，最后在72°C延伸10分钟，以完成任何不完全PCR产物的扩增。为了扩增SK基因块，使用引物N_EGF_SK Fp3 (上游)和引物N_EGF_SK_Rp 4 (下游引物)(关于引物的详细描述，参见表I)。PCR条件如下:PCR条件:热启动，在95°C完全变性5分钟，共28个在95 °C变性45秒、在45 °C退火45秒、在72 °C延伸3分钟的循环，最后在72 °C延伸10分钟，以完成任何不完全PCR产物的扩增。通过凝胶提取纯化试剂盒(Qiagen)，从琼脂糖凝胶对PCR产物进行凝胶纯化。对这2种纯化的PCR产物进行剪接重叠延伸(SOE)PCR(细节参见上面的‘在实施例中使用的一般方法’部分)，以便构建邻接的EGF4、5、6-SK杂合基因构建体，其中编码EGF4、5、6的序列与SK基因编码序列(以终止子密码子结尾)在框架内融合。以纯化形式从琼脂糖凝胶中分离出该基因块，并用Xho I和Not I限制性酶(R.E.酶)消化，连接进类似地切割的pET 23-d质粒载体中(参考图1A和图2A)，然后将其转化进大肠杆菌XLlB(rec ^和611(1 A_)细胞中，所述多肽在所述细胞中并不表达，尽管质粒DNA将会扩增。对该质粒进行Sanger氏二脱氧测序方法，以便验证正确地融合的EGF和SK组分的DNA序列(SEQ ID N0.4和对应的蛋白SEQ ID 112)。在该构建体中，从琼脂糖凝胶中分离出Xho I和NotI消化的盒，并‘入坞，进pPIC-9K中。在该得到的构建体中，将上游EGF4、5、6序列与α -分泌信号序列以及Kex2加工位点一起放入框架内，使得杂合基因构建体EG-4、5、6-SK在整合进宿主基因组中以后在巴斯德毕赤酵母(菌株GS115)中从位于载体中的醇氧化酶启动子表达(Norden, Agemark等人.2011)。从该表达载体表达的杂合多肽也有效地跨膜运 输(参见下面的实施例)，并且可以以纯的形式从其中分离出。
(ii)构建编码SK_EFG4、5、6的基因构建体，其中编码EGF4、5、6的结构域在SK编码基因的下游/C-端编码末端处在框架内融合:通过使用SK_EGF Fpl (上游)和SK_EGFRp2 (下游)引物组(引物序列参见表I)，使用pET23-d-SK质粒作为模板，扩增与SK相对应的核苷酸序列(DNA SEQ ID I和对应的蛋白SEQ ID 114)(参见‘在实施例中使用的一般方法’)。引物SK_EGF Fpl含有在它的5’末端处的Xho I限制位点，而SK_EGF Rp2含有在它的5’末端处的最多1149 bp的SK序列，继之以三甘氨酸(Gly-Gly-Gly)编码段以及转谷氨酰胺酶识别位点编码序列，最后以这样的序列结尾:所述序列与编码EGF4、5、6的第4个结构域的5’末端重叠。得到的基因块含有在它的5’末端处的相同的Xho I限制位点，且下游(3’ -末端)含有第4个结构域的重叠核苷酸序列。在第二个PCR中，使用SK_EGFFp3和SK_EGF Rp4(引物序列参见表I)引物组，从作为模板的pET23_d_EGF4、5、6 (含有为EGF4、5、6合成的定制基因)扩增EGF4、5、6结构域。引物SK_EGF_Fp3含有SK的下游序列(最多1149bp)，继之以三甘氨酸密码子段和朝向它的5’末端的转谷氨酰胺酶识别位点编码序列；其它引物(即SK_EGF_Rp4)含有EGF4、5、6的第6个结构域的末端的部分序列和在它的5’末端处的Not I限制位点。在PCR以后，得到的基因块2 (通过使用这组引物得到)含有在它的5’末端(上游)处的SK的第1149个碱基对，继之以编码三甘氨酸的序列和转谷氨酰胺酶识别位点编码序列，另一方面，在它的3’末端处，它含有Not I限制位点，以便利克隆进pET-23-d载体中。PCR条件如下:在95 °C完全变性5min，然后进行28个在95 °C保持45秒、在45°C将引物退火45秒和在72°C保持Imin的循环；最后，在72°C延伸lOmin，以完成任何部分长度PCR产物。
使用QIagen凝胶提取试剂盒，从凝胶纯化两种PCR块(SK的PCR块和编码具有部分重叠序列的EGF4、5、6的PCR块)。对这些纯化的PCR产物进行剪接重叠延伸PCR，以便构建邻接的SK_GGG_转谷氨酰胺酶_EGF4、5、6杂合基因构建体，最后借助于SK_EGF Fpl和SK_EGF Rp4(引物序列参见表I) ‘末端’引物组进行扩增。然后用Xho I和Not I限制性酶消化最终的PCR产物(参考图1B和图2B)。从凝胶纯化以后，将最终的消化的并纯化的PCR块连接进pET23-d(预先用Xho I和Not I类似地消化，并经过凝胶纯化)中。得到的质粒称作pET23-d_SK_GGG_TG_EGF，将其在大肠杆菌XLlB(recA_、end A_)细胞中扩增。对该质粒进行Sanger氏二-脱氧链终止方法,并验证完成的克隆的插入序列(DNA SEQ ID 6和对应的蛋白SEQ ID 114)。使用Xhol和Notl酶，从该质粒构建体，分离出杂合基因构建体，并连接进PPIC-9K中，其中上游XhoI位点帮助SK-GGG-TG-EG4、5、6块的框架内入坞进 分泌信号序列(在表达质粒中的杂合基因的上游)中。在它整合进宿主基因组中并通过功能筛选来选择纤溶酶原活化剂-阳性克隆以后，在醇氧化酶启动子控制下在巴斯德毕赤酵母(GS 115)中表达该杂合基因-构建体。
(iii)用于将EGF4、5、6结构域框架内插入链激酶编码基因段中的DNA杂合基因的构建:还设计了 ‘结构域间SK’ -EGF构建体的构建，其中将EGF4、5、6的序列以翻译地框架内方式散布在SK序列内，以得到杂合基因构建体，然后使用合适的引物(引物序列参见表I)进行制备。将EGF序列插入编码结构域间柔性区段的SK基因区域中(Wang等人，1998;Yadav和Sahni, 2009),也就是 说,一方面,在α和β结构域之间,或者另一方面,在β和Y结构域之间。为此目的，首先采用引物组IDa.Fpl和IDaRp 2(关于序列细节，请参见表I)，进行编码SK的a -结构域的DNA的扩增。引物ID a.Fpl含有在它的5’末端处的Xho I限制位点；另一方面，引物ID a Rp 2含有在它的5’末端处的EGF的第4个结构域的重叠序列。就该反应而言，使用下述PCR条件:热启动，在95°C完全变性5分钟，随后进行28个在95°C变性45秒、在45°C退火45秒、在72°C延伸1.5分钟的循环，最后在72°C ‘延伸’ 10分钟，以完成任何不完全PCR产物。还使用引物组ID EGF Fp3和IDEGF Rp4(关于这些引物的序列，参见表1)，单独地扩增了编码EGF4、5、6的DNA块。使用该引物组，得到了编码EGF4、5、6序列的DNA块，其中朝向5’末端的上游序列与SK的a -结构域的下游序列部分地重叠；同样，该块的3’末端含有与SKi3 -结构域的上游序列重叠的序列。使用引物组ID β Fp5和ID Y Rp6 (关于这些引物的序列，参见表I)，通过PCR得到编码SK的β和Y结构域的第3个PCR块。就该反应而言，使用下述PCR条件:热启动，在95°C完全变性5分钟，随后进行共28个在95°C变性45秒、在45°C退火45秒、在72°C延伸1.5分钟的循环，最后在72°C延伸10分钟，以完成任何不完全PCR产物的扩增。将ID β Fp5引物设计成，使得其5’末端与EGF的第6个结构域的下游序列同源，而下游引物ID Y Rp6含有终止子密码子，后者继之以NotI限制位点。借助于凝胶纯化试剂盒(Qiagen)，从琼脂糖凝胶中纯化出所有3个基因块，并进行一锅剪接重叠延伸反应，以便得到单个邻接的基因产物，其中基因区段的次序如下51(0 46 4、5、6-51(0-51(￥。将所有3种区段以1:1:1摩尔比加入简单的PCR反应中，其中在没有引物存在下进行前10个循环，并通过加入各自0.6 μ M终浓度的ID a Fpl和ID y Rp6，进行接下来的18个循环，以便进一步扩增3-片段SOE中间体。就该反应而言，使用下述PCR条件:热启动，在95°C完全变性5分钟，随后(在每个循环中)在95°C变性45秒、在45°C退火45秒、在72°C延伸3分钟，最后在72°C延伸10分钟，以完成任何不完全PCR产物 。对最终的PCR产物进行凝胶纯化，并用Xho I和Not I限制性酶消化(参考图1G和图2D)。然后将该杂合基因构建体连接进pET 23-d载体中，并转化进大肠杆菌XLlB(rec八_和611(1 Al感受态细胞中，其中所述DNA可以在没有蛋白表达下扩增(因为宿主不会提供必需的噬菌体-编码的RNA聚合酶)，使用所谓的二 -脱氧链终止方法对其进行Sanger氏自动化测序(DNA SEQ ID 3和对应的蛋白SEQ ID 116)。结果完全验证了杂合基因构建体。此后，通过用Xho I和Not I酶消化它，从pET-23-d结构域间SK_EGF质粒中分离出杂合基因盒。然后将该盒连接进PPIC-9K中，在α-分泌信号序列上游且与其在框架内，并转化进巴斯德毕赤酵母(GS115)中，进行克隆，并象以前一样通过关于纤溶酶原活化的功能筛选进行选择，在整合进宿主基因组中以后，在甲醇诱导以后，在载体的醇氧化酶启动子影响下进行表达，如在方法部分中所述。
(iv)构建杂合SK-EGF基因，其中SK组分在两侧侧接EGF4、5、6编码结构域:还如下构建了另一种构建体，其中SK编码序列在两侧侧接框架内融合的EGF4、5、6结构域:制备pET23-d N_EGF_SK质粒构建体(参见上面子部分i和ii)，并对它进行Xho I和AflII (在pET23-dN_EGF_SK构建体中的独特位点)消化，还对pET-23-d_SK_EGF构建体进行相同的处理，并在琼脂糖凝胶上分离两种消化产物。与更大的SK_EGF消化片段连接从N_EGF_SK构建体得到的Xho I和Afl-1I段，其结果得到在pET23-d载体中的N_EGF_SK_EGF (DNA SEQID7和对应的蛋白SEQ ID 115)(参考图1.C和图2.C)。通过Xho I和Not I消化，从该质粒分离出表达盒(象以前一样，首先通过DNA测序验证该构建体)，并连接进α -分泌信号序列的PPIC-9K框架内在EGF-SK-EGF杂合盒的上游，象以前一样，在功能筛选以后(参见下文)，在整合进宿主基因组中以后，在醇氧化酶启动子控制下，在巴斯德毕赤酵母中表达。
(V)构建编HN_EGF_SK、SK EGF和N EGF SK EGF的基因区段，其含有编码与EGF4、5、6相对应的氧化抗性多肽区段的序列:在N_EGF_SK、SK_EGF和N_EGF_SK_EGF多肽中，甲硫氨酸残基存在于EGF4、5、6结构域的第41个氨基酸残基处，或SK_EGF的第434个氨基酸残基处，以及分别在N_EGF_SK_EGF的第41个和第434个氨基酸位置处，因为已知EGF4、5、6结构域部分的氧化倾向性，后者会阻碍抗凝血酶活性，特别是这些结构域的蛋白C活化功能。因此，牢记这一点，在我们的各种SK-EGF融合/基因融合区段的设计中，我们在基因水平用缬氨酸/丙氨酸/谷氨酰胺氨基酸残基替代该甲硫氨酸。象以前一样，通过使用高保真度酶pfu turbo DNA聚合酶(Stratagene),实现了该目的，并使用适当的引物(Wang和Malcolm 1999)，在不同的模板中引入位点特异性的突变。为了制备这些构建体，设计了 3组引物，它们允许在不同的构建体中在基因构建体的EGF4、5、6结构域/段的原始Met残基位置处分别掺入缬氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺。引物组命名如下:
M rep V Fp,和M rep V Rp (关于引物序列，参见表I)
M rep A Fp,和M rep A Rp (关于引物序列，参见表I)
M rep Q Fp,和M rep Q Rp (关于引物序列，参见表I)
在下一步中，使用pET 23-d_N_EGF_SK和pET23_d_SK_EGF质粒作为模板，并使用上述的引物组。对于每组引物，PCR循环方案如下:在95°C完全变性，然后进行28个在95°C变性45秒、在45°C退火45秒、在68°C延伸7分钟的循环，进一步在72°C延伸lOmin。用Dpn I限制性酶消化通过该反应得到的最终的PCRi夹，所述Dpn I限制性酶切割甲基化的DNA并增加在转化以后获得阳性克隆的可能性。将该PCR产物转化进大肠杆菌XLlBlue细胞中，并铺板在含有氨苄西林的LB琼脂平板上，在37°C温育16-18h。随机挑取几个克隆，在含有氨苄西林的LB培养基中培养成7-10ml培养物。分离质粒，并测序，以验证期望的突变的存在。通过采用该操作，在两种构建体中在基因水平用缬氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺氨基酸替代甲硫氨酸。通过标准的亚克隆操作，使用这些构建体在N_EGF_SK_EGF基因中产生缬氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺突变。最后，将这些突变体转移至PPIC-9K，并在巴斯德毕赤酵母的GS115菌株中检查它们的表达(参见‘在实施例中使用的一般方法’)。
(vi)构建Λ SK_EGF构建体，其具有含5个氨基酸缺失的SK的N-端:在该构建体中，涉及的最终的目的是，在SK的N-端区域处除去5个氨基酸。使用pET 23-d_SK_GGG_TG_EGF(氧化抗性的，其中用缬氨酸替代在EGF4、5、6段中的第41个met ;参见上文)作为模板，借助于PCR引物Δ SK_EGF Fp I和Δ SK_EGF Rp 2 (关于这些引物的序列，参见表I)，除去这些编码5个氨基酸的核苷酸。引物ASK_EGF Fpl含有Xho I限制位点和在它的5’末端处从第16个碱基对开始的SK的重叠序列。ASK_EGF Rp 2含有EGF4、5、6的第6个结构域的序列和在它的5’末端处的Not I位点。用于该反应的PCR循环如下:在95°C完全变性5分钟，随后进行28个在95°C变性45秒、在55°C退火45秒、在72°C延伸3分钟的循环，最后在72°C延伸10分钟，以结束不完全PCR产物的扩增。对最终的PCR产物进行凝胶洗脱，并用Xho I和Not I酶消化，连接进pET 23-d载体中，并测序，以验证完整的且正确的开放读码框。最后，将ASK_EGF(参考图1D)盒连接在PPIC-9K中，并通过以前所述的标准化操作检查它的表达。
(vii)在氧化抗性的N_EGF_SK和N_EGF_SK_EGF编码基因块的接点处框架内引入编码凝血酶可切割位点的DNA序列:从N_EGF_SK的表达、纤溶酶原活化的纯化和动力学分析(其确立了纤溶酶原活化的延迟性质)显而易见，不同于天然的/未修饰的SK，该构建体可以不直接地活化人纤溶酶原，而是需要预形成的纤溶酶的存在。这自动地在这样的构建体中赋予凝块特异性的活化的优点，因为体内凝块是富含纤溶酶的，而纤溶酶在全身循环中被快速地灭活。 类似地，纤维蛋白凝块也是富含凝血酶的；因此，我们在构建体中突变了合适的位点，以使它也是凝血酶可活化的。为此，我们通过凝血酶可切割位点突变了 EGF和SK的结构域间连接区，其结果应当在纤溶酶原活化中产生凝血酶可切割的活化开关。这可以如下在单阶段测定中监测:加入递增的少量的凝血酶，并观察(如在前述的类似的纤溶酶富集实验的情况下)N-端EGF4、5、6融合的SK构建体的纤溶酶原活化的滞后的逐渐减少。将凝血酶可切割的因子XI的序列引入在EGF和SK基因构建体的接点处。这通过重叠延伸PCR来实现，其中使用含有重叠序列的接头引物和编码凝血酶可切割的氨基酸的核苷酸。在第一个PCR反应中，使用引物N_EGF_TCS Fp I和N_EGF_TCS Rp 2 (关于这些引物的序列，参见表I)来扩增EGF4、5、6结构域。引物N_EGF_TCS Fp I含有Xho I限制位点和在它的5’末端处的EGF的第4个结构域的序列；另一方面，N_EGF_TCS Rp2含有EGF的第6个结构域序列，继之以编码凝血酶可切割位点的序列，继之以SK的下游部分。PCR条件如下:在95°C变性5分钟，然后进行28个在95°C变性45秒、在50°C退火45秒、在72°C延伸I分钟的循环，最后在72°C延伸10分钟，以便完成不完全PCR片段。通过该反应得到的PCR块含有在它的5’末端处的Xho I限制位点和编码凝血酶可切割位点的核苷酸序列以及在3’末端处的SK的重叠部分。在接下来的PCR反应中，使用TCS_SK Fp 3和SK Rp 4(关于这些引物的序列，参见表I)，其中上游引物(TCS_SK Fp 3)按照5’至3’的次序含有第6个结构域的序列、EGF4、5、6的重叠部分、编码凝血酶可切割位点的核苷酸序列以及编码SK的核苷酸序列；在另一侧，SK Rp 4含有在它的5’末端处的Not I可切割位点。PCR条件如下:在95°C变性5分钟，然后进行28个在95°C变性45秒、在50°C退火45秒、在72°C延伸I分钟的循环，最后在72°C延伸10分钟，以便完成任何部分长度子代片段的合成。得到的PCR块应当在上游含有第6个结构域的重叠序列和编码凝血酶可切割位点的核苷酸，而其在下游应当含有Not I限制位点。对两种PCR块进行凝胶纯化，并以1:1摩尔比混合在单锅反应中，并通过末端-引物TCS Fpl和SK Rp6进行扩增，这得到所需的N_EGF_TCS_SK PCR块(参考图1.E) (TCS:凝血酶可切割序列)，对其进行凝胶纯化，并用Xho I和Not I酶消化，最后通过标准规程连接进类似地消化的pET23-d中。在大肠杆菌XL Blue中亚克隆以后，验证该构建体序列的开放读码框。这确立，在所述基因中在EGF4、5、6和SK的接点处建立了具有下述氨基酸序列的因子XI凝血酶可切割位点:Ile-Lys-Pro-Arg-1le-Val-Gly。在该序列中，凝血酶特异性导致在精氨酸和异亮氨酸的接点处的切割，使得在凝血酶的作用以后，从SK的N-端末端除去I个氨基酸，并且，第2个氨基酸改变成缬氨酸(在天然SK中，N-端残基是Ile-Ala-Gly-)。此后，将N_EGF_TCS_SK盒连接进pPIC_9K中，并在巴斯德毕赤酵母中进行它的表达。在所述纯化的构建体的情况下，在用凝血酶处理以后，的确发现了凝血酶切割，并通过N-端蛋白测序进行了确认。
(viii)EGF4、5、6结构域翻译地框架内融合在SK的β和Y结构域的接点处:为此目的，使用pET23_d_SK作为模板，采用引物IDa ^Fpl和IDa β Rp2 (关于这些引物的序列，参见表I)，进行结构 域的扩增。引物ID a PFpl含有在它的5’末端处的Xho I限制位点，另一方面，ID a i3Rp2含有SK的β结构域的下游序列以及EGF4、5、6的第4个结构域的部分重叠序列。通过这些引物组得到的PCR块含有在上游序列处的Xho I限制位点，且在下游含有β -结构域的末端序列和EGF的第4个结构域的重叠序列。在下一步中，使用IDE4Fp3和IDE6Rp4(关于这些引物的序列，参见表I)引物组，分离出编码EGF4、5、6的per块2。引物IDE4Fp3含有在它的5’末端处的SK的β -结构域的下游序列，IDE6Rp4含有在它的5’末端处的Y结构域上游重叠序列。通过这些引物组得到的PCR块2含有在5’末端处的下游β_结构域的重叠序列，其它末端含有Y结构域的上游序列。该扩增的PCR条件如下。在95°C完全变性5min，接着进行27个在95°C保持45秒、在45°C退火45秒、在72°C延伸I分钟的循环，最后在72 °C延伸10分钟。在下一步中，使用IDyFp5和IDyRp6(关于这些引物的序列，参见表I)引物组，分离出SK的Y结构域。如下设计引物ID YFp5:其中IDyFp5’的5’末端含有EGF4、5、6的第6个结构域的同源下游序列，而ID Y Rp6含有终止密码子和随后的Not I限制位点。使用下述per方案扩增块3 ;在95°C热启动5分钟，进行共28个在95°C变性45秒、在47°C退火45秒和在720°C延伸1.5分钟的循环，最后在72°C延伸10分钟，以完成任何不完全扩增产物。通过凝胶提取试剂盒(Qiagen)，对所有得到的PCR进行凝胶纯化，并通过A26tl分光光度计法进行定量。在最终的pet反应中，对所有3种基因块进行单锅剪接重叠延伸反应，以便获得单个邻接的基因块，其中得到的构建体的次序如下:SK a -SK β -EGF4、5、6-SK Y，以1:1:1摩尔比将所有3种per产物混合在聚合酶链式反应中，其中在没有任何引物存在下进行前10个循环，并通过加入0.6 μ M终浓度的ID α β Fpl和ID y Rp6引物进行接下来的18个循环，以便扩增3种片段中间体完全基因块。PCR条件如下:在95°C热启动5分钟，进行共28个在95°C变性45秒、在45°C退火45秒和在72°C延伸3分钟的循环，其中在没有引物存在下进行前10个循环，最后在72°C扩增10分钟。最后，得到的基因块含有在它的5’末端处的Xho I位点和在它的3’末端处的NotI位点。用Xho I和Not I酶消化该基因块，并克隆至pET 23-d和pPIC 9K。在巴斯德毕赤酵母中检查它的表达、纯化和表征。该基因块含有在SK的β和Y结构域之间的EGF4、5、6结构域(DNA SEQ ID 5和对应的蛋白SEQ ID 129 ;参见图1H和图2Ε)。
(ix)将转谷氨酰胺酶识别序列掺入在N_EGF_TCS_SK杂合基因块(含有甲硫氨酸氧化抗性突变)的N-端编码末端:为了在EGF-SK构建体的EGF4、5、6结构域的第4个结构域的开始处或其前面掺入转谷氨酰胺酶识别序列，设计了引物TG_N_EGF_Fp I和AfI IIRp 2 (关于引物的详细序列，参见表I)，其中TG Fpl含有Xho I限制位点和在它的上游区域处的编码血液因子XIII转谷氨酰胺酶识别氨基酸序列的核苷酸序列，而引物Afl II Rp2含有具有Afl II限制酶切消化位点(SK的第165-170个核苷酸含有Afl II限制位点，其位于该引物的中央)的区域的核苷酸序列。从这些引物，我们通过PCR得到了含有下述内容的基因块=Xho I限制位点、编码转谷氨酰胺酶识别位点的核苷酸和EGF4、5、6的第4个结构域的序列以及含有Afl II限制位点的块的下游部分。从凝胶中提取该基因块(氧化抗性的，且含有凝血酶可切割序列)。用Xho I和Afl II消化质粒pET 23-dN_EGF_TCS_SK和pET 23-d N_E GF_TCS_SK_EGF。其结果得到Xho I和AfI II基因块以及得自两种质粒构建体的较大和较小部分。将消化的基因块与构建体的较大部分连接，并转化进大肠杆菌XLBlue中，以得到含有TG_N_EGF_TCS_SK和TG_N_EGF_TCS_SK_EGF(参考图1F)的质粒。对这些测序，并验证正确的开放读码框，即在以前描述的EGF-SK构建体的背景下转谷氨酰胺酶编码序列的存在。然后将两种盒连接进巴斯德毕赤酵母中，并检查这些构建体的表达(请参阅’在实施例中使用的方法’)。
表1.用于不同的EGF4、5、6和链激酶基因融合构建体制备的引物
序列 SEQ ID Nos.引物名引物序列编号___^__
权利要求
1.嵌合蛋白构建体，其包含与溶血栓蛋白融合的血栓调节蛋白的4、5和6表皮生长因子样结构域(EGF4、5、6)，所述溶血栓蛋白选自由以下组成的组:链激酶、组织纤溶酶原激活物、葡萄球菌激酶、尿激酶和它们的衍生物和类似物。
2.根据权利要求1所述的嵌合蛋白构建体，其中所述血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域与所述溶血栓蛋白或其衍生物或类似物在所述溶血栓蛋白或其衍生物或类似物的N-端、C-端或N和C两端处融合。
3.根据权利要求1所述的嵌合蛋白构建体，其中所述溶血栓蛋白包含具有一个或多个氨基酸置换、插入、缺失或截短的链激酶，且其中所述构建体具有纤溶酶原活化、凝血酶抑制和抗凝蛋白C途径活化活性。
4.根据权利要 求1所述的嵌合蛋白构建体，其中所述血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域融合在所述链激酶的α和β或β和Y结构域之间，或者融合在链激酶衍生物或类似物的α和β或β和Y结构域之间，其中所述链激酶衍生物或类似物包含一个或多个突变、添力口、插入或截短，且其中所述构建体活化纤溶酶原、抑制凝血酶和活化抗凝蛋白C途径。
5.根据权利要求2所述的嵌合蛋白构建体，其中所述EGF4、5、6结构域与链激酶或链激酶衍生物或类似物在一个或多个位置处发生框架内融合，所述位置选自:链激酶N-端、链激酶C-端、N-和C-链激酶两端、或链激酶的结构域间位置。
6.根据权利要求5所述的嵌合蛋白构建体，其中所述链激酶衍生物跨残基5-383或5-414。
7.根据权利要求6所述的嵌合蛋白构建体，其中所述链激酶衍生物跨残基16-383。
8.根据权利要求2所述的嵌合蛋白构建体，其中所述EGF4、5、6结构域在一个或多个选自链激酶N-端、链激酶C-端或N-和C-链激酶两端的位置处发生框架内融合，其中所述EGF4、5、6结构域的Met 41被缬氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺替代；或C-端Met 435被缬氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺替代；或在同时的N-和C-端融合构建体中，Met 41和Met 435独立地被缬氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺替代。
9.根据权利要求1所述的嵌合蛋白构建体，其另外包含转谷氨酰胺酶识别序列。
10.根据权利要求1所述的嵌合蛋白构建体，其另外包含在EGF4、5、6结构域与溶血栓蛋白或其衍生物或类似物的接点处的一个或多个凝血酶可切割序列。
11.治疗哺乳动物的血栓形成的方法，所述方法包括:给需要治疗的所述哺乳动物施用治疗有效量的根据权利要求1-10中的任一项所述的嵌合蛋白构建体。
12.嵌合蛋白构建体，其包含血栓调节蛋白的EGF4、5、6结构域，所述结构域与组织纤溶酶原激活物(tPA)衍生物、类似物或片段在下述位置处融合:在tPA衍生物、类似物或片段的N-端处，在tPA衍生物、类似物或片段的C-端处，在tPA衍生物、类似物或片段的两端处，或在tPA衍生物、类似物或片段内部。
13.根据权利要求12所述的嵌合蛋白构建体，其中EGF4、5、6结构域和tPA衍生物、类似物或片段之间的融合体另外包含一个或多个接头片段。
14.根据权利要求13所述的嵌合蛋白构建体，其中所述一个或多个接头片段包含一个或多个促进所述构建体的柔性的氨基酸。
15.根据权利要求12所述的嵌合蛋白构建体，其中所述tPA衍生物、类似物或片段包含一个或多个突变、添加、插入或截短，且其中所述tPA衍生物、类似物或片段活化纤溶酶原、抑制凝血酶和活化抗凝蛋白C。
16.根据权利要求12所述的嵌合蛋白构建体，其包含与一个或多个血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域融合的组织纤溶酶原激活物(tPA)的片段或其截短或修饰形式，使得tPA的EGF结构域被一个或多个血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域替代，且其中所述构建体具有抗凝血酶和纤溶酶原活化活性。
17.根据权利要求12所述的嵌合蛋白构建体，其包含与一个或多个血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域融合的组织纤溶酶原激活物(tPA)的片段或其截短或修饰形式，使得tPA的三环域I和EGF结构域被一个或多个血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域替代，且其中所述构建体具有抗凝血酶和纤溶酶原活化活性。
18.根据权利要求17所述的嵌合蛋白构建体，其中所述tPAEGF结构域和三环I结构域在tPA片段的N-端或C-端处被一个或多个血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域替代。
19.根据权利要求17或18中任一项所述的嵌合蛋白构建体，其另外包含在tPA片段或其截短或修饰形式与血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域之间的一个或多个接头片段，所述接头片段包含促进构建体柔性的氨基酸残基，使得所述构建体具有凝血酶抑制、蛋白C活化和纤溶酶原活化能力。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的嵌合蛋白构建体，其中EGF4、5、6组分的甲硫氨酸41被丙氨酸、缬氨酸或谷氨酰胺替代。
21.嵌合蛋白构建体，其包含血栓调节蛋白的EGF4、5、6结构域，所述结构域与葡萄球菌激酶(SAK)的N-端或C-端末端发生框架内融合。
22.根据权利要求21所述的嵌合蛋白构建体，其中所述血栓调节蛋白EGF4、5、6结构域的甲硫氨酸41被丙氨酸、缬氨酸或谷氨酰胺替代。
23.根据权利要求21或22中的任一项所述的嵌合蛋白构建体，其另外包含在SAK和EGF4、5、6结构域区域之间的凝血酶可切割序列。
24.根据权利要求22-23中的任一项所述的嵌合蛋白构建体，其另外包含转谷氨酰胺酶交联序列。
25.根据权利要求1-10或12-24中的任一项所述的嵌合蛋白构建体，其中所述构建体可溶于水溶液或盐水溶液。
26.抑制凝血酶的方法，所述方法包括:使用根据权利要求1-10或12-24中任一项所述的嵌合蛋白构建体。
27.活化蛋白C的方法，所述方法包括:使用根据权利要求1-10或12-24中任一项所述的嵌合蛋白构建体。
28.提供抗凝血酶和纤溶酶原活化的方法，所述方法包括:使用根据权利要求1-10或12-24中任一项所述的嵌合蛋白构建体。
29.药物制剂，其包含药学有效量的根据权利要求1-10或12-24中的任一项所述的嵌合蛋白构建体。
30.在哺乳动物中溶栓的方法，所述方法包括:给有其需要的所述哺乳动物施用治疗有效量的根据权利要求1-10或12-24中任一项所述的嵌合蛋白构建体到有其需要的受试者。
31.根据权利要求1-10或12-24中任一项所述的嵌合构建体，其通过在细菌系统中表达来制备。
32.根据权利要求1-10或12-24中任一项所述的嵌合构建体,其通过在真核系统中表达来制备。
33.根据权利要求32所述的嵌合构建体，其中所述真核表达系统选自由动物细胞、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和真菌组成的组。
34.根据权利要求33所述的嵌合蛋白构建体，其分泌进细胞外培养基中。
35.根据权利要求13所述的嵌合蛋白构建体,其中一个或多个氨基酸选自由Gly、Asn、Pro、Ser、Gin、Arg 和 Lys 组成的组。
36.核酸序列,其编码根据权利要求1-10、12-25或31-35中的任一项所述的的嵌合蛋白构建体。
37.载体，其包含权利要求36的核酸序列。
38.宿主细胞，其包含权利要求37的载体。
39.根据权利要求1-10、12-25或31-35中的任一项所述的嵌合蛋白构建体，其通过在宿主细胞表达系统中表达编码所述蛋白的核酸序列来制备。
40.制备根据权利要求1-10和12-25或31-35中的任一项所述的的嵌合蛋白构建体的方法，所述方法包括:在宿主细胞表达系统中表达编码所述蛋白的核酸序列。
41.根据权利要求40所述 的方法，其中所述宿主细胞表达系统是真核表达系统。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述宿主细胞表达系统是细菌表达系统。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(E.coli)。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述真核表达系统是动物细胞或酵母细胞。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述酵母是巴斯德毕赤酵母。
46.根据权利要求40-45中的任一项所述的方法，其中所述嵌合蛋白构建体从宿主细胞分泌进细胞外培养基中。
全文摘要
本发明公开了具有纤溶酶原活化剂性质和抗血栓性质(包括凝块特异性作用)的新的杂合蛋白，所述性质使得它们非常有利地用于治疗涉及纤维蛋白凝块形成的循环病症，所述维蛋白凝块形成归因于血管中的基础组织损伤，导致心肌梗塞、卒中等。也公开了新蛋白和得到它们的方法，所述蛋白通过以纤溶酶或凝血酶依赖性的方式活化纤溶酶原来帮助溶解血块，并且还通过固有的血液凝固途径抑制凝血酶的活性和产生。
文档编号A61K39/00GK103179982SQ201180048291
公开日2013年6月26日 申请日期2011年8月5日 优先权日2010年8月5日
发明者尼拉·马赫什瓦里, 吉里什·萨尼 申请人:科学与工业研究委员会