丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，包括：第一抗HCV核心抗原单抗、第一HCV重组嵌合抗原、第一样品稀释液、第二样品稀释液、第一酶标记的第二抗HCV核心抗原单抗、第一配体标记的第二HCV重组嵌合抗原、第二酶标记的第二配体、显色剂和终止液；第一样品稀释液包括还原剂、第一表面活性剂和第一变性剂；第二样品稀释液包括第二表面活性剂和第二变性剂。这种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒原剂通过第一样品稀释液中打开包被抗原以及样品中抗原抗体复合物中错配的二硫键，第二样品稀释液破坏HCV核心抗原和HCV抗体复合物，释放更多抗原，从而提高检测的灵敏度。
【专利说明】
丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)引起的肝脏急慢性炎 症，据WHO统计表明，目前世界上约有2亿人感染丙型肝炎病毒，约占全球人口的3%，中国约 有4000万~6000万。丙型肝炎较乙型肝炎更易出现肝硬化、纤维化，导致肝癌，有预测显示， 在不久的将来丙型肝炎将取代乙型肝炎成为继艾滋病病毒后威胁人类健康的又一大病毒 杀手。丙型肝炎病毒虽然对人类健康危害甚大，目前也尚无疫苗可以预防，HCV早期诊断和 传染源筛查对临床治疗和疾病控制有指导作用。因此，寻找操作简单、灵敏快速、价格低廉、 测试准确的方法来实现对HCV的检测，对全球、尤其是发展中国家来说，都有重大的意义。
[0003] HCV为有包膜呈球形的正单链RNA病毒，属于黄病毒家族，全长约9500碱基。HCV基 因组两侧分别为5'和3'非编码区，中间为开放读码框(0RF)，分为结构区和非结构区。结构 区包括核心蛋白区（C)和两个包膜蛋白区（E1、E2)，分别编码核心蛋白和包膜蛋白。非结构 蛋白区包括NS2、NS3、NS4和NS5区，编码功能蛋白，如蛋白酶（NS2、NS3和NS4A区），螺旋酶 (NS3)以及依赖RNA的RNA多聚酶(NS5B区）。丙肝病毒核心蛋白约含190aa，在病毒复制中起 到非常重要的作用。通常采用基因工程表达上述结构和非结构蛋白作为包被抗原，来建立 抗-HCV检测的ELISA方法。HCV基因组具有显著的异质性，同一基因组不同区段变异程度有 显著差别。5 '非编码区最为保守，已成为HCV分子诊断研究的焦点。
[0004] 传统的丙型肝炎病毒检测技术主要有：（1)PCR法检测丙型肝炎病毒RNA;(2)免疫 学方法检测丙型肝炎病毒抗原或者抗体。PCR法检测主要用于抗病毒治疗的选择与疗效监 测，但它需严格按照PCR操作规程操作，检测人员需经过专业培训并取得相应资质，且样本 的质量控制要求高，必须是采血后2小时内低温条件送检，无菌抽提RNA，容易因为操作、设 备及环境等因素造成误差，从而产生假阳性或假阴性。丙肝免疫学方法检测又分抗体检测 和抗原检测。HCV抗体检测是目前最常用的检测方法，但其致命缺点是存在"窗口期"，即HCV 感染后至HCV抗体产生中间有40-70天的时间，献血员已经被感染并具有传染性，但是用目 前的抗体检测试剂没法检出，该阶段称为感染后血清阳转前的窗口期(Perseroconversion Window Phase，PWP)。窗口期的存在是输血感染的主要原因。目前丙型肝炎的输血后感染占 肝炎病例的70 %，而在丙型肝炎病毒感染者中更有80-90 %是属于输血后感染;而丙肝抗原 的检测可使检测的窗口期平均提前50天左右，缩短窗口期HCV感染的风险。在HCV核酸出现 后的1 -2天内，感染者体内就会出现HCV核心抗原，而且与HCV核酸的水平具有一定的相关 性，可以作为HCV检测的标志物。
[0005] 丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂是同时对HCV核心抗原和HCV抗体进行检测， 不但可以缩短检测的窗口期，还可以区分是HCV现症感染还是既往感染，可用于HCV的早期 检测及治疗评价，为指导临床提供重要的参考；同时，该试剂还能用于血源筛查，可有效提 高用血及输血安全，抗原抗体同时检测也提高了工作效率，节约了成本。
[0006] 然而，由于患者在感染丙型肝炎病毒约一段时间后(平均49天)会产生抗体，形成 抗原抗体免疫复合物，当产生抗原抗体免疫复合物后，因游离的抗原减少，使HCV抗原的检 出率大大降低。一般检测HCV抗原都会在样品稀释液里加去垢剂和变性剂，破坏复合物，释 放抗原，但这种去垢剂和变性剂同时也破坏样品中的HCV抗体，导致联检试剂中无法检测到 HCV抗体，造成对抗体的漏检。
[0007] 目前市面上的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒都是尽量采用温和的去垢 剂和变性剂，尽量减少对待测样品中HCV抗体的影响，但如果去垢剂和变性剂强度不强或者 浓度不够的话，待测标本中的免疫复合物破坏的就不完全，HCV核心抗原不能完全释放出 来，待测样品中的HCV核心抗原含量就少，针对HCV核心抗原和HCV抗体的检测灵敏度较低， 容易造成漏检。
【发明内容】
[0008] 基于此，有必要提供一种能提高针对HCV核心抗原和HCV抗体的检测灵敏度的联合 检测试剂盒。
[0009] -种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，用于检测样品中是否含有丙型肝炎 病毒或丙型肝炎病毒抗体，包括:第一抗HCV核心抗原单抗、第一 HCV重组嵌合抗原、第一样 品稀释液、第二样品稀释液、第一酶标记的第二抗HCV核心抗原单抗、第一配体标记的第二 HCV重组嵌合抗原、第二酶标记的第二配体、显色剂和终止液；
[00?0]所述第一抗HCV核心抗原单抗、所述第一酶标记的第二抗HCV核心抗原单抗、所述 第一 HCV重组嵌合抗原和所述第一配体标记的第二HCV重组嵌合抗原相互间不发生交叉反 应，所述第一配体可以与所述第二配体结合；
[0011] 所述第一样品稀释液按照质量百分浓度包括〇 . 05 %~5 %的还原剂、0.005 %~ 0.1 %的第一表面活性剂和0.005 %~0.5 %的第一变性剂；
[0012] 所述第二样品稀释液包括第二表面活性剂和第二变性剂；
[0013] 所述第二样品稀释液中，所述第二表面活性剂的质量百分浓度为0.5%~10%，所 述第二变性剂的浓度为〇.5mol/L~10mol/L。
[0014] 在一个实施例中，所述还原剂选自二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、半胱氨酸、β-巯 基乙醇和还原型谷胱甘肽中的至少一种；
[0015] 所述第一样品稀释液中，所述还原剂的质量百分浓度为0.3%~1%。
[0016] 在一个实施例中，所述第一表面活性剂选自十二烷基二甲基胺乙内酯、十二烷基 氨基丙酸、十二烷基肌氨酸钠、十二烷基磺酸钠和溴化十六烷基三甲基铵中的至少一种；
[0017] 所述第一样品稀释液中，所述第一表面活性剂的质量百分浓度为0.01 %~ 0.08%〇
[0018]在一个实施例中，所述第一变性剂选自盐酸胍、尿素、Tween-20和聚乙二醇辛基苯 基醚中的至少一种；
[0019]所述第一样品稀释液中，所述第一变性剂的质量百分浓度为0.01 %~0.1 %。
[0020]在一个实施例中，所述第二表面活性剂选自十二烷基二甲基胺乙内酯、十二烷基 氨基丙酸、十二烷基肌氨酸钠、十二烷基磺酸钠和溴化十六烷基三甲基铵中的至少一种；
[0021]所述第二样品稀释液中，所述第二表面活性剂的质量百分浓度为1%~5%。
[0022]在一个实施例中，所述第二变性剂选自盐酸胍、尿素、Tween-20和聚乙二醇辛基苯 基醚中的至少一种；
[0023]所述第二样品稀释液中，所述第二变性剂的浓度为lmol/L~5mol/L。
[0024] 在一个实施例中，所述第一样品稀释液的溶剂为磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液， 所述第二样品稀释液的溶剂为磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。
[0025] 在一个实施例中，所述样品、所述第一样品稀释液和所述第二样品稀释液的使用 比例为1~10:1~18:1~18。
[0026] 在一个实施例中，所述第一酶为辣根过氧化酶或碱性磷酸酶，所述第二酶为辣根 过氧化酶或碱性磷酸酶，所述第一配体为生物素或亲和素，所述第二配体为生物素或亲和 素。
[0027] 这种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒通过第一样品稀释液中的还原剂打 开包被抗原内部或者抗原之间错配的二硫键，同时打开样品中抗原抗体复合物中错配二硫 键，从而使表位更好的暴露在外，便于免疫结合反应，第一样品稀释液中的第一变性剂可以 复性抗原，提高抗原的特异性识别能力，同时还能降低抗体的非特异性结合，第二样品稀释 液中的第二表面活性剂和第二变性剂可以破坏HCV核心抗原和HCV抗体复合物，释放更多抗 原，从而提高抗原检测的灵敏度。相对于目前商业化的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试 剂盒，这种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒针对HCV核心抗原和HCV抗体的检测灵敏 度较高。
【附图说明】
[0028] 图1为样品检测过程中加第一样品稀释液处理后的原理示意图，其中，
t为第一抗 HCV核心抗原单抗：
为第一HCV重组嵌合抗原（错配二硫键结合），
为第一HCV重组嵌 合抗原，
为样品中的HCV核心抗原与HCV抗体结合物(错配二硫键结合）：
为样品中的
游离HCV核心抗原：
为样品中的游离HCV抗体；
[0029] 图2为样品检测过程中加第二样品稀释液处理后的原理示意图，其中，样品中 HCV核心抗原与HCV抗体结合物(非特异性结合）。
【具体实施方式】
[0030] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实 施例对本发明的【具体实施方式】做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于 充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术 人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施 的限制。
[0031] 一实施方式的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，用于检测样品中是否含有 丙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒抗体，包括：第一抗HCV核心抗原单抗、第一 HCV重组嵌合抗 原、第一样品稀释液、第二样品稀释液、第一酶标记的第二抗HCV核心抗原单抗、第一配体标 记的第二HCV重组嵌合抗原、第二酶标记的第二配体、显色剂和终止液。
[0032]第一抗HCV核心抗原单抗、第一酶标记的第二抗HCV核心抗原单抗、第一 HCV重组嵌 合抗原和第一配体标记的第二HCV重组嵌合抗原相互间不发生交叉反应，并且第一配体可 以与第二配体结合。
[0033]第一酶标记的第二抗HCV核心抗原单抗、第一配体标记的第二HCV重组嵌合抗原和 第二酶标记的第二配体可以自行制备，也可以直接购买。
[0034]本申请中，第一抗HCV核心抗原单抗、第一 HCV重组嵌合抗原、第二抗HCV核心抗原 单抗和第二HCV重组嵌合抗原均购自Meridian Life Science公司；第二酶标记的第二配体 购自南京盘古基因生物工程股份有限公司；第一酶标记的第二抗HCV核心抗原单抗和第一 配体标记的第二HCV重组嵌合抗原都为自行制备。
[0035]优选的，第一酶为辣根过氧化酶（HRP)或碱性磷酸酶，第二酶为辣根过氧化酶 (HRP)或碱性磷酸酶，第一配体为生物素或亲和素，第二配体为生物素或亲和素。
[0036] 第一样品稀释液按照质量百分浓度包括0.05 %~5 %的还原剂、0.005 %~0.1 % 的第一表面活性剂和0.005%~0.5%的第一变性剂。
[0037] 第一样品稀释液的溶剂可以为磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。
[0038] 结合图1，第一样品稀释液含有还原剂和第一变性剂，还原剂主要是为了打开包被 抗原内部或者之间错配的二硫键，同时打开待测标本中抗原抗体复合物的错配二硫键，从 而使表位更好的暴露在外，便于免疫反应;第一变性剂主要功能是复性抗原，提高抗原的特 异性识别能力，同时还能降低抗体的非特异性结合。
[0039]还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、三（2-羧乙基)膦(TCEP)、半胱氨酸、β-巯基乙醇和 还原型谷胱甘肽中的至少一种。
[0040] 优选的，第一样品稀释液中，还原剂的质量百分浓度为0.3%~1%。
[0041] 特别优选的，第一样品稀释液中，还原剂为β-巯基乙醇，β-巯基乙醇的质量百分浓 度为0.5%。
[0042]第一表面活性剂选自十二烷基二甲基胺乙内酯、十二烷基氨基丙酸、十二烷基肌 氨酸钠(NLS)、十二烷基磺酸钠和溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)中的至少一种。
[0043]优选的，第一样品稀释液中，第一表面活性剂的质量百分浓度为0.01 %~0.08%。 [0044]特别优选的，第一样品稀释液中，第一表面活性剂为十二烷基磺酸钠，十二烷基磺 酸钠的质量百分浓度为〇. 05%。
[0045] 第一变性剂选自盐酸胍、尿素、Tween-20和聚乙二醇辛基苯基醚中的至少一种。 [0046]优选的，第一样品稀释液中，第一变性剂的质量百分浓度为0.01 %~0.1 %。
[0047]特别优选的，第一样品稀释液中，第一变性剂为Tween-20，TWeen-20的质量百分浓 度为0.03%。
[0048] 第二样品稀释液包括第二表面活性剂和第二变性剂。第二样品稀释液中，第二表 面活性剂的质量百分浓度为0.5%~10%，第二变性剂的浓度为0.5mol/L~10m 〇l/L。
[0049] 第二样品稀释液的溶剂可以为磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液。
[0050] 结合图2,第二样品稀释液中含有第二表面活性剂和第二变性剂，第二表面活性剂 和第二变性剂是为了破坏HCV核心抗原和HCV抗体复合物，释放更多抗原，从而提高抗原检 测的灵敏度。
[0051] 第二表面活性剂选自十二烷基二甲基胺乙内酯、十二烷基氨基丙酸、十二烷基肌 氨酸钠、十二烷基磺酸钠和溴化十六烷基三甲基铵中的至少一种。
[0052] 优选的，第二样品稀释液中，第二表面活性剂的质量百分浓度为1 %~5%。
[0053]特别优选的，第二样品稀释液中，第二表面活性剂为十二烷基肌氨酸钠，十二烷基 肌氨酸钠的质量百分浓度为3%。
[0054] 第二变性剂选自盐酸胍、尿素、Tween-20和聚乙二醇辛基苯基醚中的至少一种。 [0055]优选的，第二样品稀释液中，第二变性剂的浓度为lmol/L~5mol/L。
[0056]特别优选的，第二样品稀释液中，第二变性剂为尿素，尿素的浓度为3mol/L。
[0057]第一样品稀释液、第二样品稀释液均用于样品的稀释，样品、第一样品稀释液和第 二样品稀释液的使用比例为1~10:1~18:1~18。
[0058] 优选的，样品、第一样品稀释液和第二样品稀释液的使用比例为7~10:3~10:3~ 10。
[0059] 特别优选的，样品、第一样品稀释液和第二样品稀释液的使用比例为10:5:5。
[0060] 显色剂和终止液选择常规试剂即可。
[0061] 这种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒通过第一样品稀释液中的还原剂打 开包被抗原内部或者之间错配的二硫键，同时打开样品中抗原抗体复合物的错配二硫键， 从而使表位更好的暴露在外，便于免疫反应，第一样品稀释液中的第一变性剂可以复性抗 原，提高抗原的特异性识别能力，同时还能降低抗体的非特异性结合，第二样品稀释液中的 第二表面活性剂和第二变性剂可以破坏HCV核心抗原和HCV抗体复合物，释放更多抗原，从 而提高抗原检测的灵敏度。相对于目前商业化的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒， 这种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒的检测灵敏度较高。
[0062] 这种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，能够保证待测样品里的抗原抗体复 合物打开，释放HCV核心抗原，又能不破坏待测样品里的HCV抗体，极大的提高了抗原和抗体 检测的灵敏度。
[0063] 下面对上述丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒的使用方法进行简单说明。
[0064] 上述丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒的使用方法与目前商业化的丙型肝 炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒相似，区别仅在于加入第一样品稀释液后孵育30min~ 50min，不洗板再加入第二样品稀释液孵育。
[0065]具体过程如下：配制第一抗HCV核心抗原单抗和第一HCV重组嵌合抗原的混合溶 液，加入到微孔板上，经吸附、洗涤、封闭、干燥后完成包被，接着加样品和第一样品稀释液， 孵育30min~50min后不洗板再加入第二样品稀释液，孵育30min后洗板，接着加入第一酶标 记的第二抗HCV核心抗原单抗、第一配体标记的第二HCV嵌合抗原和第二酶标记的第二配体 的混合溶液，孵育30min后洗板，加显色液充分反应后加终止液，最后测量0D值。
[0066]以下为具体实施例，实施例中出现的各种仪器和试剂如果没有特别说明，均采用 本领域常规仪器或试剂。
[0067] 实施例中采用的第一抗HCV核心抗原单抗记为AB1，AB1购自美国meridian life science公司（货号：C8A216M);第二抗HCV核心抗原单抗记为AB2，AB2购自美国meridian life science公司（货号：C8A017M);第一HCV重组嵌合抗原记为AG1，AG1购自美国meridian life science公司（货号：R01599);第二HCV重组嵌合抗原记为AG2，AG2购自美国meridian life science公司（货号:R01600);HRP标记的亲和素购自南京盘古基因生物工程股份有限 公司，货号:TRP_10005。
[0068] AB1、AB2、AG1、AG2彼此间不发生交叉反应。
[0069] AB2采用HRP标记，HRP标记的AB2采用过碘酸钠标记法制备，具体过程如下：（1)称 取5mgHRP溶解于lmL蒸馏水中；（2)于上液中加入0.2mL新配的0.1M NaI〇4溶液，室温下避光 搅拌20分钟。（3)将上述溶液装入透析袋中，对ImM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜。 (4)加20yL 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的PH升高到9.0~9.5，然后立即加入 10mg AB2到lmLO.OlM碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。（5)加0. lmL新配的4mg/mL NaBH4液，混匀，再置4 °C 2小时。（6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4PBS透析，4 °C过 夜。（7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量 0.15M PH7.4的PBS中。（8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去 除铵离子后（用萘氏试剂检测），l〇,〇〇〇rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物；（9) 加入等量甘油，分装后，冰冻保存。
[0070] AG2采用生物素标记，生物素标记的AG2的制备过程如下：
[0071] (1)PH 7.4 20mmro缓冲液4度透析抗原2小时。（2)按照AG2:BI0(1:5)质量比例混 合后在4度放置1.5小时。（3)PH 7.4 20mmPB缓冲液4度透析AG2和BI0混合物3小时。分装后， 冰冻保存。
[0072]选取10份阳性标本和10份阴性标本进行抗原抗体联检测试，阳性标本和阴性标本 都是经过药监局认定的试剂盒确认的，具体信息如下：
[0073]
[0075] 实施例1
[0076] 采用磷酸盐缓冲液配制第一样品稀释液和第二样品稀释液，具体成分如下。
[0077] 第一样品稀释液:0 · 5wt %的β-巯基乙醇、0 · 05wt %的十二烷基磺酸钠、0 · 03wt % 的Tween-20。
[0078]第二样品稀释液:3wt%的十二烷基肌氨酸钠和3mol/L的尿素。
[0079]用碳酸盐缓冲液稀释AB1至浓度为3yg/mL，用碳酸盐缓冲液稀释AG1至浓度为6yg/ mL，将二者按照体积比为1:1混合，得到包被液。
[0080]然后将包被液加入聚苯乙烯微孔板内，经吸附、洗涤、封闭、干燥后完成包被。
[0081 ] 每孔加100yL样品/阳性对照/阴性对照和50yL第一样品稀释液，37°C孵育30min后 不洗板每孔再加入50yL第二样品稀释液，37°C孵育30min后洗板6次。
[0082] 加入200yL HRP标记的AB2、生物素标记的AG2及HRP标记的亲和素混合溶液，37°C 孵育30min后洗板6次。
[0083] 每孔100yL显色液A液和100yL显色液B液，37°C避光反应30min后每孔加50yL终止 液，l〇min后，在450nm和630nm双波长测0D值。
[0084] 实施例2
[0085] 采用磷酸盐缓冲液配制第一样品稀释液和第二样品稀释液，具体成分如下。
[0086] 第一样品稀释液:0· 3wt%的二硫苏糖醇、0 .Olwt%的十二烷基磺酸钠、O.Olwt% 的盐酸胍。
[0087] 第二样品稀释液：1 wt %的十二烷基二甲基胺乙内酯和5mo 1/L的尿素。
[0088]用碳酸盐缓冲液稀释AB1至浓度为3yg/mL，用碳酸盐缓冲液稀释AG1至浓度为6yg/ mL，将二者按照体积比为1:1混合，得到包被液。
[0089]然后将包被液加入聚苯乙烯微孔板内，经吸附、洗涤、封闭、干燥后完成包被。
[0090] 每孔加100yL样品/阳性对照/阴性对照和50yL第一样品稀释液，37°C孵育30min后 不洗板每孔再加入50yL第二样品稀释液，37°C孵育30min后洗板6次。
[0091] 加入200yL HRP标记的AB2、生物素标记的AG2的混合溶液及HRP标记的亲和素，37 °C孵育30min后洗板6次。
[0092] 每孔100yL显色液A液和100yL显色液B液，37°C避光反应30min后每孔加50yL终止 液，l〇min后，在450nm和630nm双波长测0D值。
[0093] 实施例3
[0094]采用磷酸盐缓冲液配制第一样品稀释液和第二样品稀释液，具体成分如下。
[0095] 第一样品稀释液：lwt %的半胱氨酸、0.08wt %的十二烷基磺酸钠、0. lwt%的盐酸 狐。
[0096] 第二样品稀释液:5wt%的十二烷基二甲基胺乙内酯和lmol/L的聚乙二醇辛基苯 基醚。
[0097]用碳酸盐缓冲液稀释AB1至浓度为3yg/mL，用碳酸盐缓冲液稀释AG1至浓度为6yg/ mL，将二者按照体积比为1:1混合，得到包被液。
[0098]然后将包被液加入聚苯乙烯微孔板内，经吸附、洗涤、封闭、干燥后完成包被。
[0099] 每孔加100yL样品/阳性对照/阴性对照和50yL第一样品稀释液，37°C孵育30min后 不洗板每孔再加入50yL第二样品稀释液，37°C孵育30min后洗板6次。
[0100] 加入200yL HRP标记的AB2和生物素标记的AG2的混合溶液，37°C孵育30min后洗板 6次。
[0101] 每孔100yL显色液A液和100yL显色液B液，37°C避光反应30min后每孔加50yL终止 液，l〇min后，在450nm和630nm双波长测0D值。
[0102]根据实施例1~3,得到下表1。
[0103] 表1:实施例1~3中在450nm和630nm双波长下的0D值。
[0106] 由表1可以看出，实施例1~3都能够实现HCV抗原抗体的检测，并且实施例1中第一 样品稀释液和第二样品稀释液的组分比例不管是检测HCV核心抗原还是HCV抗体效果都是 最佳的。
[0107] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，用于检测样品中是否含有丙型肝炎病 毒或丙型肝炎病毒抗体，其特征在于，包括:第一抗HCV核心抗原单抗、第一 HCV重组嵌合抗 原、第一样品稀释液、第二样品稀释液、第一酶标记的第二抗HCV核心抗原单抗、第一配体标 记的第二HCV重组嵌合抗原、第二酶标记的第二配体、显色剂和终止液； 所述第一抗HCV核心抗原单抗、所述第一酶标记的第二抗HCV核心抗原单抗、所述第一 HCV重组嵌合抗原和所述第一配体标记的第二HCV重组嵌合抗原相互间不发生交叉反应，所 述第一配体可以与所述第二配体结合； 所述第一样品稀释液按照质量百分浓度包括〇. 05 %~5 %的还原剂、0.005 %~0.1 % 的第一表面活性剂和0.005 %~0.5 %的第一变性剂； 所述第二样品稀释液包括第二表面活性剂和第二变性剂； 所述第二样品稀释液中，所述第二表面活性剂的质量百分浓度为0.5%~10%，所述第 二变性剂的浓度为〇. 5mol/L~10mol/L。2. 如权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述还原 剂选自二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、半胱氨酸、β-巯基乙醇和还原型谷胱甘肽中的至少一 种； 所述第一样品稀释液中，所述还原剂的质量百分浓度为0.3%~1%。3. 如权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述第一 表面活性剂选自十二烷基二甲基胺乙内酯、十二烷基氨基丙酸、十二烷基肌氨酸钠、十二烷 基磺酸钠和溴化十六烷基三甲基铵中的至少一种； 所述第一样品稀释液中，所述第一表面活性剂的质量百分浓度为0.01%~0.08%。4. 如权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述第一 变性剂选自盐酸胍、尿素、Tween-20和聚乙二醇辛基苯基醚中的至少一种； 所述第一样品稀释液中，所述第一变性剂的质量百分浓度为〇.01 %~〇. 1 %。5. 如权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述第二 表面活性剂选自十二烷基二甲基胺乙内酯、十二烷基氨基丙酸、十二烷基肌氨酸钠、十二烷 基磺酸钠和溴化十六烷基三甲基铵中的至少一种； 所述第二样品稀释液中，所述第二表面活性剂的质量百分浓度为1 %~5%。6. 如权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述第二 变性剂选自盐酸胍、尿素、Tween-20和聚乙二醇辛基苯基醚中的至少一种； 所述第二样品稀释液中，所述第二变性剂的浓度为lmol/L~5mol/L。7. 如权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述第一 样品稀释液的溶剂为磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液，所述第二样品稀释液的溶剂为磷酸盐 缓冲液或碳酸盐缓冲液。8. 如权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述样 品、所述第一样品稀释液和所述第二样品稀释液的使用比例为1~1 〇: 1~18:1~18。9. 如权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗原抗体联合检测试剂盒，其特征在于，所述第一 酶为辣根过氧化酶或碱性磷酸酶，所述第二酶为辣根过氧化酶或碱性磷酸酶，所述第一配 体为生物素或亲和素，所述第二配体为生物素或亲和素。
【文档编号】G01N33/576GK106093402SQ201610378119
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】胡道奇, 毛金武, 周咏武, 李光
【申请人】湖南康润药业有限公司