Mvp作为抗病毒药物标靶的应用的制作方法

专利名称：Mvp作为抗病毒药物标靶的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体涉及MVP作为一种抗病毒药物标靶的应用。
背景技术：
1989年，美国Chiron公司和疾病控制中心的科学家们采用先研究核酸后研究蛋白质(抗原)的分子生物学方法，终于克隆出了慢性非甲非乙型肝炎的病原，这种病毒被命名为丙型肝炎病毒(HCV)，由其引起的肝炎称为丙型肝炎。日前公布的世界卫生组织报告显示，丙肝是全世界导致死亡的十大感染性疾病之一。我国目前有4000万丙肝病毒感染者，远远高于约65万的中国艾滋病病毒感染者和患病人数，而且与仅5%—10%的青少年和成人期感染乙肝病毒后的慢性化率相比，感染丙肝病毒后约50%-85%的患者将演变为慢性丙肝。根据中国疾病预防控制中心提供的数据，目前我国每年的新发丙肝病人数已从2003 年的2万多人发展为2005年的近6万人，逐年上升的趋势非常明显。由于目前丙肝检测没有列入常规检查项目，我国也缺乏对高危人群的有效筛查机制，因此不少丙肝患者不能被及时发现并接受治疗，进而导致传染源的进一步扩大。因为丙肝是一种没有疫苗的、传染性广泛的、慢性化率极高的、没有明显临床症状的病毒性肝炎，所以无论从疾病对患者健康的危害，还是对国家和个人造成的经济负担来考虑，丙肝都是一个不容忽视和亟待解决的公共卫生问题。丙型肝炎病毒属黄病毒科(/^^iririi/ae)，是直径约50nm的球形颗粒。病毒有一脂质包膜，结合着宿主来源的脂质或免疫球蛋白。包膜内部是密度较高的核心颗粒，由核心蛋白和病毒核酸相结合构成。近年来，全世界已报道了上百个HCV基因克隆。一般认为HCV 的基因组呈线状，是一条9. 4kb长的单股、正链RNA分子，含有一单一的长开放阅读框。HCV 的功能蛋白来自一个大的蛋白质前体的剪切和加工，形成至少10种结构及功能性蛋白核心蛋白蛋白、外膜蛋白E1/E2、非结构蛋白NS2、NS3A、NS3B、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。目前对丙型肝炎具有确切疗效的药物为IFN-α及利巴韦林。近年新出的聚乙二醇化IFN在抗HCV的治疗中获得一定进展。6型HCV中，1型对IFN有耐药现象，2 6型则对IFN敏感。我国80%患者感染的为HCV 1型，增加了抗HCV治疗难度。患者血清中 HCV滴度高者及存在HCV基因高变区变异者，IFN抗病毒疗效差。在IFN治疗3个月后，可产生IFN抗体，但不影响疗效。利巴韦林抗病毒作用弱，可通过调节辅助T淋巴细胞，增强 Thl作用，增强细胞免疫作用，清除细胞内病毒；并通过抑制体液免疫反应，加强IFN的抗病毒作用。聚乙二醇化IFN (PEG IFN)是大分子聚乙二醇与IFN-α侧面连接，这样就明显提高了 IFN抗HCV的疗效，延缓肾脏排出时间；随着PEG的降解，IFN缓慢释放，使血中的 IFN较长时间地维持在恒定有效水平。IFN是在人体对病毒感染的防御机制中最迅速的应答系统。IFN作为一种分泌蛋白，因基因不同，其表达产物按分子结构和抗原性可分为α、β、Y三型，分别由白细胞、成纤维细胞和免疫淋巴细胞产生，具抗病毒、抗细胞分裂和免疫调节活性。目前常用的IFN制剂是从病毒诱导产生的天然产物中提取加工而成。IFN可通过两种机制发挥抗病毒作用①直接抗病毒作用IFN并不直接灭活病毒，而是与肝细胞膜上的IFN受体结合，通过细胞内的信息传导，诱生多种抗病毒蛋白，这些蛋白可以阻断病毒核酸和蛋白质合成，抑制病毒复制。这些蛋白包括:A寡腺苷酸合成酶、磷酸二酯酶等。②免疫调节作用IFN可通过刺激CTL和NK细胞，同时刺激T淋巴细胞和巨噬细胞产生细胞因子，增强细胞免疫。此外， IFN可增强细胞膜上人类白细胞抗原表达，使CTL更易识别和杀伤靶细胞。长期应用，特别是小剂量有应用IFN可产生IFN抗体，影响IFN-的抗病毒作用。目前，临床上广泛采用的利用聚乙二醇IFN联合利巴韦林治疗慢性丙型肝炎，存在着给药剂量与疗效的矛盾，即给药剂量不足会引起疗效的降低，而较高的剂量会引起一定的毒副作用。本发明首次发现了穹窿主蛋白(简称MVP)具有抗病毒作用，揭示了 MVP的一个新功能，同时也表明，MVP可以作为一个新的药物靶点，开发出抗丙型肝炎等病毒的新药。

发明内容
本发明的目的在于提供MVP在制备抗丙型肝炎等病毒药物中的应用，从而为临床上抗丙型肝炎等病毒的治疗提供新的方法。穹窿主蛋白(MVP)被认为是一种介导多重耐药的蛋白。MVP是目前为止最大的核糖核蛋白——穹窿蛋白的主要组成成分，约占穹窿蛋白总质量的70%，人类MVP大小约为 llOKDa，为管状结构，将其氨基端序列做同源性比对，发现其与多重耐药肿瘤细胞系中过表达的肺耐药相关蛋白(LRP)同源性为100%，即MVP就是早期已发现的LRP，LRP定位于16 号染色体短臂上，靠近MRP基因位点。除了 MVP外，穹窿蛋白组成成分还包括端粒酶协同蛋白，VPARP以及非翻译的RNA分子。目前为止，诸多研究集中在探讨穹窿蛋白与抗癌药物的耐受性关系上，而MVP其他的功能报道较少。一、临床标本中MVP与丙肝的关系的分析
从北京301医院和湖北省人民医院采集到1 例HCV感染者血液样本，这些患者体内检测出HCV抗体，血清中检测到HCV RNA，谷丙转氨酶的水平也都在大于六个月的时间中持续升高，同时，这些患者也没有乙型肝炎、人类免疫缺陷病毒共感染的情况，没有酗酒史，没有接受过器官移植手术，也没有肝癌、肝纤维化的发生。应用荧光定量PCR(Real-time PCR)、酶联免疫共沉淀(ELISA)以及免疫组化等手段检测，结果显示与健康人相比，MVP在丙型肝炎患者的肝组织、血清以及血液中分离出得人PBMC中表达量增加，表明MVP和HCV 之间存在某种联系。二、在肝癌细胞系中探究MVP和HCV复制之间的关系
在感染了 HCV JFH-I的肝癌细胞系Huh7、Huh7. 5. 1中通过脂质体转染质粒pCMV_MVP 过表达MVP，检测HCV的滴度，用荧光定量PCR和蛋白质印迹(Western blot)技术分别检测了 HCV的RNA、病毒蛋白表达的变化，发现MVP能够降低HCV在细胞内的复制水平；同时，在过表达MVP的HCV带毒细胞中加入IFN的处理，发现更低的HCV复制水平，这说明MVP能够协助IFN-发挥抗病毒作用。除了从正面探讨MVP与HCV复制的关系，还采取了利用干扰 RNA手段干扰掉MVP得表达从而从反面探究两者之间的关系。S卩在感染了 HCV JFH-I的肝癌细胞系Huh7、Huh7. 5. 1中通过脂质体转染质粒sh-MVP干扰MVP的表达，检测HCV的滴度，用荧光定量PCR和蛋白质印迹技术分别检测了 HCV的RNA、病毒蛋白表达的变化，发现干扰掉MVP后，HCV在细胞内的复制水平升高；同时，加入IFN-处理干扰掉MVP的HCV带毒细胞，发现更低的HCV复制水平，这从反面说明MVP能够协助IFN-发挥抗病毒作用。三、MVP抗病毒的广谱性
除了探究MVP对HCV复制的影响，还进一步探讨了 MVP抗病毒作用是否具有广谱性。分别以水疱性口炎(VSV)、甲型流感病毒(IAV)、肠道病毒71型(EV71)为研究对象，探讨MVP 是否能够抑制其复制，从而起到抗病毒的作用。研究MVP对VSV复制的影响时，用1 Μ. 0. I的VSV病毒液感染过表达MVP的肝癌细胞Huh7，同时加入300 IU/ml IFN- α，设立对照，M小时候收集细胞上清，采用病毒噬斑检测病毒滴度。结果表明在Huh7细胞系中过表达了 MVP后，VSV的滴度下降，说明MVP能够抑制VSV的复制；当加入IFN-α后，VSV复制水平更低，这说明MVP能够增强IFN-α的抗病毒作用。MVP对Η3Ν2 (IAV—种亚型)复制的影响。用1 Μ. 0. I的Η3Ν2病毒液感染过表达MVP的狗肾细胞(简称MDCK细胞)，同时加入300 IU/ml IFN- α，设立对照，24h后，收集带病毒的上清液和细胞，通过血凝集实验检测H3N2的病毒滴度，通过荧光定量PCR检测NP 的mRNA，cRNA和vRNA表达量，评估H3N2的复制水平。结果显示MVP能够抑制H3N2的复制；并且MVP能够增强IFN- α的抗病毒作用。MVP对EV71复制的影响。用300 IU/ml IFN-α预处理过表达了 MVP的人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(简称RD细胞)，设立对照，1 后，收集细胞。用荧光定量PCR和蛋白印迹技术检测EV71 VPl的mRNA及蛋白水平的表达。研究结果表明在RD细胞系中过表达了 MVP 后，EV71的RNA、病毒蛋白VPl表达减少，说明MVP能够抑制H3N2的复制；当加入IFN-α 后，EV71的RNA以及蛋白VPl表达水平有更明显的下降，这说明MVP能够增强IFN-α的抗病毒作用。MVP过表达细胞中，VSV、H3N2、EV71的复制量都减少，联合MVP也能抑制HCV复制情况，这在一定程度上表明MVP抗病毒具有一定的广谱性，故针对MVP研发的新的抗病毒药物，将会具有广谱的抗病毒的作用。四、MVP能够诱导I型IFN的产生从而发挥抗病毒的作用
分离健康人PBMC按一定的密度接种于六孔板中，至置37°C、5% CO2细胞培养箱中培养。 然后通过脂质体转染质粒sh-MVP在PBMC中干扰掉MVP，继而加入病毒刺激，设立对照，3 后收集细胞，用iTrizol裂解，提取RNA，检测I型IFN的RNA水平变化；用酶联免疫法检测细胞上清中I型IFN的表达。实验结果显示VSV能刺激PBMC细胞产生IFN-α、IFN-β， 同时，干扰掉MVP的PBMC较对照组，产生更少的IFN- α、IFN- β ；同样，荧光定量PCR的结果也显示,干扰掉MVP后，PBMC中IFN- α、IFN- β mRNA水平下降，这在mRNA水平证明MVP 能诱导IFN的表达。为了进一步验证MVP与I型IFN的关系，检测了 MVP对IFN通路下游基因表达的影响。在Huh7细胞中通过脂质体转染质粒pCMV-MVP过表达MVP，并用IFN- α处理，设立对照，收集细胞。用荧光定量PCR和蛋白质印迹技术分别检测了 I型IFN通路下游因子细胞转导与转录激活因子(简称STAT)如STAT1、STAT2，双链RNA依赖性蛋白激酶(简称H(R)、2， 5腺苷酸合成酶(简称OAS)的mRNA及蛋白质水平的变化。实验结果表明过表达MVP后， 相比于对照组，IFN下游因子STAT1、STAT2、PKR, OAS的mRNA、蛋白表达水平都升高，说明MVP能促进I型IFN的产生从而能够增强IFN-α的下游因子的表达，发挥抗病毒活性。综合研究成果过表达MVP能够抑制HCV、VSV、IAV、EV71的复制，降低病毒的滴度； 干扰掉MVP的细胞，病毒滴度较空白对照高，说明MVP是一种抗病毒蛋白。同时，过表达MVP 能够放大IFN-α的抗病毒作用，因为MVP能够刺激细胞IFN-α的表达，两者联合发挥了更好的抗病毒效应。五、MVP作为抗病毒药物
将MVP作为抗病毒药物应用于临床治疗可以从两方面进行研究开发。一方面，以MVP作为体内靶标，在筛选抗病毒药物上的应用。筛选出的药物用以促进体内MVP的表达，进而MVP刺激体内I型IFN的表达，发挥抗病毒的作用。另一方面，MVP本身在制备抗病毒药物中的应用。采用基因工程方法，体外表达并分离纯化MVP，可以将MVP作为一种口服或注射药物应用于临床治疗。MVP基因工程包括基因和载体的制备、切割和连接、重组脱氧核苷酸的转移、表达及产物分离等。基因的制备方法有多聚酶链反应、互补文库、基因组文库、染色体脱氧核苷酸的酶切分离、酶合成法及化学合成等。载体是能将外源性目的基因运输至宿主细胞的小分子脱氧核苷酸，目前主要有细菌质粒、噬菌体脱氧核苷酸及病毒脱氧核苷酸构建的人工载体，此外尚有酵母人工染色体脱氧核苷酸哺乳动物细胞人工染色体脱氧核苷酸等。载体和含基因的脱氧核苷酸分别经限制性酶切割后，两者混合通过连接酶链结构形成重组脱氧核苷酸，经转化、转导、转染、 激光打孔、微注射或基因枪等技术转移至宿主内，获得基因工程细胞，后者经培养和表达， 即可产生相应的MVP基因工程药物。本发明首次发现了 MVP具有抗病毒作用，揭示了 MVP的一个新功能。为临床上开发出新的抗丙型肝炎等病毒药物具有良好的指导作用。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果1、最初的IFN是从人或者动物的血清中分离纯化出来的，因为其表达量少，价格昂贵，纯度不高，安全性较低；人工合成的 IFN解决了 IFN来源少的问题，但是临床研究证明，重组的IFN有一定的副作用，MVP是一种内源的抗病毒蛋白，它能够诱导细胞内I型IFN的表达，从而起到抗病毒的作用，研究出以MVP为靶标的药物，通过MVP的过表达诱导产生内源性IFN，安全性将会有较大的提高； 2、目前临床上采用的联合聚乙二醇IFN和利巴韦林治疗慢性丙型肝炎，以抑制病毒复制减少传染性、改善肝功能、减轻肝组织病变、提高生活质量、减少或延缓肝硬化和肝癌的发生。 利巴韦林作为一种化学药品，根据其药理作用，大剂量长期使用会引起白细胞减少、贫血、 血清转氨酶和胆红素升高，对临床检验和诊断造成干扰，很多患者在治疗初期会出现不同程度的发热，同时伴有不同程度的肌肉酸痛，此时，治疗患者的利巴韦林用量就必须减少。 但是，低药剂量所获得的疗效并不乐观。MVP作为内源性蛋白，如果和IFN联合用于治疗慢性丙型肝炎，将会较现有的联合治疗药物有更高的安全性。3、联合利巴韦林和IFN治疗丙型肝炎时，IFN是注射的，利巴韦林是口服用药，治疗费用较为昂贵，以MVP为靶标开发治疗丙型肝炎等病毒引起的疾病的新药，将会开辟一种治疗的新途径，从而为临床患者提供新的选择，在某种程度上减轻治疗疾病带来的经济负担。


图1 MVP 抑制 HCV JFH-I 的复制。在 Huh7 (Α、B)、Huh7. 5. 1 (C、D)细胞系中过表达MVP或者干扰掉MVP，然后用IFN-α处理或者不处理，用荧光定量PCR和蛋白质印迹检测病毒RNA水平和蛋白水平的表达变化。图2 MVP抑制VSV的复制。在Huh7细胞中转染pCMV_MVP质粒，然后用IFN- α处理，收集细胞上清，用噬斑法检测收集到的细胞上清中病毒滴度的变化。图3 MVP抑制Η3Ν2的复制。在MDCK细胞中转染pCMV_MVP质粒，然后用IFN- α 处理，收集细胞，提取细胞中的总RNA，用荧光定量PCR检测Η3Ν2 NP mRNA的表达情况(B)； 收集细胞上清，用血凝集实验检测细胞上清中H3N2滴度的变化(E)。图4 MVP抑制EV71的复制。在RD细胞中转染pCMV_MVP质粒，然后用IFN— α处理，收集细胞，用Western blot检测EV71病毒蛋白VPl的表达情况(C)，荧光定量PCR技术检测EV71的RNA水平的表达(F)。图5 MVP诱导I型IFN的产生。在PBMC中干扰掉MVP，然后用VSV刺激或者不刺激，用荧光定量PCR和酶联免疫吸附实验检测IFN-α (A) ,IFN-β (B) RNA水平和蛋白水平的表达变化。图6 MVP对IFN下游通路因子的影响。在Huh7细胞中过表达MVP，然后用IFN-α 处理或者不处理，收集细胞，用荧光定量PCR和蛋白质印迹方法检测IFN通路下游因子 STATU STAT2 , PKR, OAS RNA水平和蛋白水平的表达变化。
具体实施例方式MVP在通过诱导I型IFN的产生来抑制丙型肝炎等病毒复制，从而发挥抗病毒的应用。一、MVP对病毒复制的影响
1、材料细胞、病毒和质粒
MDCK细胞由中国科学院山东医学微生物研究所提供，Huh7细胞、Huh7. 5. 1细胞、RD细胞、Vero细胞均购于中国典型微生物保藏中心；
HCV JFH-1、H3N2、VSV、EV71购于中国典型微生物保藏中心；
pCMV-MVP、sh-MVP质粒由武汉大学病毒学国家重点实验室医学病毒学研究课题组朱应教授指导完成；
2、工具酶
LA-taq, LC-taq，M-MLV 反转录酶，5 XM-MLV 缓冲液，RNA exhibit 购自宝生物 (TaKara)公司；
3、其他试剂
DMEM粉剂购自Gibco公司；Lipo2000转染试剂，购自上海太阳马公司；TRIzol试剂购自Gibco公司；注射用重组人IFN-α加购买于沈阳三生制药有限责任公司；Light Cycler 480 II/96购买于Roche公司；生物发光仪购买于GE公司。4、pCMV-MVP表达质粒的构建
首先获得目的基因片段MVP 选择适当的表达载体pCMV-tag2B ；在NCBI网站搜索出 MVP序列，引入适当的酶切位点，设计出相应的引物；从Huh7细胞中提出全基因，用设计的引物扩增出目的基因MVP ；通过琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物；连接产物和载体；将获得的连接产物酶切、跑胶，测序鉴定克隆是否构建成功。
5、干扰RNA——sh-MVP的获得购买于上海吉玛制药技术有限公司。6、Real-time MVP检测引物的设计
为了通过荧光定量PCR技术检测细胞中MVP在mRNA水平的变化，根据 《qPCR-Handbook》指导，利用软件I^rimer Premier5. 0设计出特异性较高的MVP的检测引物。
A、MVP对HCVJFH-I复制的影响
首先，检测在HCV JFH-I感染后的Huh7细胞系中过表达MVP，HCV的复制情况。DHCV JFH-I带毒Huh7细胞的获取。T25细胞瓶中的Huh7细胞长到适当密度，加入I M. 0. I HCV JFH-I，感染时间为7天，获得带毒细胞。2)LipO2000脂质体法转染法。转染全过程必须严格无菌操作。a、在转染前一天将待转染的HCV JFH-1带毒Huh7细胞接种于6孔板中，37°C培养。 转染前的细胞密度以70-90%为准。转染前1小时换为无血清培养基以饥饿细胞。b、准备以下溶液
①稀释10μ1 Lipo2000试剂于250μ1无血清、无抗菌素的DMEM培养基。混勻后室温静置5分钟。②稀释待转染质粒pCMV-MVP于250μ1无血清、无抗菌素的DMEM培养基。混勻后室温静置。设立空载质粒为对照
C、将溶液①缓慢加入溶液②中，室温孵育20分钟。d、加入上述Lipo2000 — DNA混合物于6孔板。e、37°C温育4_6小时后换10%血清和抗生素的DMEM培养基，培养M小时。3)重组人IFN- α 2a的加入。分别在转染了空载和pCMV_MVP质粒的空中加入重组人IFN- α 2a,同时设立对照，24小时后，收样检测HCV复制情况。用荧光定量PCR和蛋白质印迹技术检测MVP和HCV复制之间的关系。荧光定量PCR检测细胞内过表达MVP对HCV JFH-I复制的影响
1)引物设计
2)病毒RNA的提取
a、六孔板每孔加入ImlTrizol勻浆；
b、移入1.5ml新离心管； C、冰上孵育5分钟；
d、离心(12，OOOrpm,4°C ) 5分钟，取上清液移入1. 5ml新离心管；
e、加0.2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟；
f、离心(12，OOOrpm，4°C)10分钟，取上层液移入1. 5ml新离心管；
g、加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟；
h、离心(12，OOOrpm4°C)5分钟，弃去上清液；
i、加入1ml 75%乙醇，震荡；
j、离心(7，500rpm,4°C)5分钟，弃去上清液；
k、室温下使之变透明；
1、加入0. 1%DEPC处理水19 μ 1溶解RNA。
3)反转录为cDNA
a、将溶解了的RNA溶液70°C水浴变形，去二级结构。b、逆转录体系为
RNA (溶于 DEPC 水)19 μ 1
RNA酶抑制剂0. 5 μ 1
5XMLV缓冲液6μ 1
2. 5Mm dNTP 混合液2 μ 1
随机引物Ιμ
MLV反转录酶1 μ 1
总体系30 μ 1
37°C 1. 5h ；75°C IOmin04)荧光定量PCR检测病毒的复制情况反应体系为
ddH207. 5 μ 1
预混液10 μ 1
引物I1μ 1
引物II1μ 1
模板0. 5 μ 1
HCV检测引物
正义链5，-TCGTATGATACCCGATGCT-3，(SEQ ID NO 1) 反义链5，-GTTTGACCCTTGCTGTTGA-3，(SEQ ID NO 2) GAPDH引物
正义链5’ -GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3’ (SEQ ID NO 3) 反义链 5，-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3，(SEQ ID NO 4) 用Excel分析实验数据。蛋白质印迹方法检测细胞内过表达MVP对HCV JFH-I复制的影响 1)样品制备。六孔板中细胞吸弃上清，PBS洗后Iml胰酶消化，3000rpm离心5min，收集细胞； 加入细胞裂解液，蛋白酶抑制剂cocktail，DTT ；冰上超声破碎至上清澄清；12000rpm离心 IOmin ；收集上清。2)测定蛋白浓度。加磷酸缓冲液800 μ 1，蛋白样品1 μ 1，Bio-Rad染料200 μ 1,混勻，595nm测定吸光度。参照制作的蛋白质溶液标准曲线计算出蛋白样品的浓度。3) PAGE
将蛋白样品加入上样缓冲液煮沸5min，12000rpm离心5 min ；制备PAGE胶浓度为1 的分离胶和浓度为5%的积层胶，待胶凝固后，加入Tris电泳缓冲液；点样，70V电压跑胶至溴酚蓝出胶。4)转膜。把PAGE胶取下，放入含有转膜缓冲液的平皿中，再将硝酸纤维素膜、滤纸浸入；在
9转模板负极依次放下支持物-三层滤纸-胶-硝酸纤维素膜-三层滤纸-软支持物，用铅笔把气泡排除；将转模板放在转膜槽中，加满转膜缓冲液，40C，40V, 80mA转膜过夜。5)显色。取下膜，用PBST-T配置的5%脱脂牛奶封闭Ih ；—抗孵育池；洗掉一抗；在PBST-T 配置的3%脱脂牛奶中加入二抗，孵育Ih ；PBS-T洗二抗Ih ；显色，曝光；分析实验结果。
其次，检测在HCV JFH-I感染后的Huh7细胞系中干扰MVP后，HCV的复制情况。DHCV JFH-I带毒Huh7细胞的获取。T25细胞瓶中的Huh7细胞长到适当密度，加入I M. 0. I HCV JFH-I，感染时间为7天，获得带毒细胞。2)LipO2000脂质体法转染法。转染全过程必须严格无菌操作。a、在转染前一天将待转染的HCV JFH-I带毒Huh7细胞接种于6孔板中，37°C培养。 转染前的细胞密度以70-90%为准。转染前1小时换为无血清培养基以饥饿细胞。b、准备以下溶液
①稀释10μ1 Lipo2000试剂于250μ1无血清、无抗菌素的DMEM培养基。混勻后室温静置5分钟。②稀释待转染质粒sh-MVP于250μ1无血清、无抗菌素的DMEM培养基。混勻后室温静置。设立质粒sh-NC为对照
C、将溶液①缓慢加入溶液②中，室温孵育20分钟。d、加入上述Lipo2000 — DNA混合物于6孔板。e、37°C温育4_6小时后换10%血清和抗生素的DMEM培养基，培养M小时。3)重组人IFN- α 2a的加入。分别在转染了空载和pCMV_MVP质粒的空中加入重组人IFN- α 2a,同时设立对照，24小时后，收样检测HCV复制情况。4)用荧光定量PCR和蛋白质印迹技术检测MVP和HCV复制之间的关系。具体方法如上所述，获得实验数据结果。在Huh7. 5. 1细胞系中重复上述实验，获得实验数据结果，分析。荧光定量PCR的实验结果表明在Huh7(图l，A)、Huh7. .5. 1(图1，C)细胞系中，过表达MVP后，相比于对照组，HCV RNA量减少(P<0. 01 )，说明MVP能抑制HCV的复制；当加入 IFN-α后，与空白对照组相比，HCV RNA下降(P<0. 01 )，说明MVP能够增强IFN-α的抗病毒作用。在Huh7 (图l，B)、Huh7. 5. 1(图1，D)细胞系中，干扰掉MVP后，相比于对照组，HCV RNA量增加(P<0. 01)，当加入IFN-α后，与空白对照组相比，HCV RNA也上升(P<0. 01 )，这从反面证明MVP能抑制HCV的复制，能够增强IFN- α的抗病毒作用。蛋白质印迹的实验结果表明在Huh7 (图l，A)、Huh7. .5. 1(图1，C)细胞系中，过表达MVP后，相比于对照组，HCV的核心蛋白Core和非结构蛋白3 NS3的表达量下调，说明MVP能抑制HCV的复制；当加入IFN- α后，两种HCV蛋白表达更少，说明MVP能够增强 IFN-α的抗病毒作用。在Huh7 (图l，B)、Huh7. .5. 1(图1，D)细胞系中，干扰掉MVP后，不论是否加入IFN-α处理，相比于对照组，两种HCV蛋白表达增加，这在蛋白水平上，从反面证明MVP能抑制HCV的复制，能够增强IFN-α的抗病毒作用。B、MVP对其他病毒(VSV、IAV、EV71)复制的影响 1、MVP对VSV复制的影响。
1)用胰酶将生长良好的Huh7细胞分散成单个细胞悬液，接种于六孔板。2) 置37°C、5% CO2细胞培养箱中培养Mh，吸弃培养基，换上无血清无抗性的培养基，用Lipo2000转染pCMV-MVP，设立空白对照。3) 转染后Mh，加入1 Μ. 0. I的VSV病毒液，同时加入300 IU/ml IFN-α，设立对照。4) 24h后，收集带病毒的上清液。5)病毒噬斑检测病毒滴度。将生长良好的Huh7细胞制成细胞悬液，接种于M孔板中，待其长满；吸弃细胞上清，将以上收集的带VSV的细胞上清300μ 1/孔加入M孔板，37°C、5% 0)2细胞培养箱中吸附1. 5h ；吸出病毒，用PBS洗一遍；将1:1体积熔化的1. 5%琼脂糖与2 XMEM(6%胎牛血清， 2%双抗)混勻，300 μ 1/孔加入M孔板，待其凝成冻状；37°C、5% CO2细胞培养箱中培养，每天观察；观察完毕后，用结晶紫300 μ 1/孔加入M孔板染色2h，染色后用自来水冲洗，数清病毒噬斑。pFu/ml=(空斑数X稀释倍数)/加入体积
结果显示(图2，D)，在Huh7细胞系中过表达了 MVP后，VSV的滴度下降(P<0. 01)，说明MVP能够抑制VSV的复制；当加入IFN- α后，与对照组相比，VSV的滴度有更明显的下降 (Ρ<0. 01)，这说明MVP能够增强IFN-α的抗病毒作用。2、MVP对IAV复制的影响
1)用胰酶将生长良好的MDCK细胞分散成单个细胞悬液，接种于六孔板。2)置37°C、5% CO2细胞培养箱中培养Mh，吸弃培养基，换上无血清无抗性的培养基，用Lipo2000转染pCMV-MVP，设立空白对照。3)转染后48h，加入1 Μ. 0. I的H3N2病毒液，同时加入300 IU/ml IFN-α，设立对照。4) 24h后，收集带病毒的上清液，通过血凝集实验检测H3N2的病毒滴度。5)收集细胞，用Trizol裂解，提取细胞内H3N2病毒RNA，反转录为cDNA，通过 Real-time 检测 NP 的 mRNA，cRNA 和 vRNA 表达量。Real-Time PCR 引物为
NP cRNA: 5’-AGTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTTAATTGTCAT-3’ (SEQ ID NO 5) NP vRNA: 5，-CTCACCGAGTGACATCAACATCATG-3’ (SEQ ID NO :6) NP 正义链5，-GGATTTGGCGTCAAGCGAACA-3’ (SEQ ID NO :7) NP 反义链5，-GTCCCTACCCCCTTTACTGC-3，(SEQ ID NO :8) y-Actin 正义链5，-TCTGTCAGGGTTGGAAAGTC-3，(SEQ ID NO :9) y-Actin 反义链5，-AAATGCAAACCGCTTCCAAC-3，(SEQ ID NO :10) 结果显示(图3，Ε、B)，在MDCK细胞系中过表达了 MVP后，Η3Ν2的病毒滴度下降 (Ρ<0· 01)，说明MVP能够抑制Η3Ν2的复制；当加入IFN-α后，与对照组相比，Η3Ν2的病毒滴度有更明显的下降(Ρ<0. 01)，这说明MVP能够增强IFN-α的抗病毒作用。3、MVP对EV71复制的影响
1)用胰酶将生长良好的RD细胞分散成单个细胞悬液，接种于六孔板。2)置37°C、5% CO2细胞培养箱中培养Mh，吸弃培养基，换上无血清无抗性的培养基，用Lipo2000转染pCMV-MVP，设立空白对照。3)转染后24h，加入300 IU/ml IFN- α，设立对照。4)转染后36h，加入加入1 Μ. 0. I的EV71病毒液。4)病毒感染1 后，收集细胞。5)用荧光定量PCR检测EV71 VPl的mRNA水平，蛋白质印迹检测EV71的蛋白水平的表达。引物设计
VPl 正义链5，-CCCTTTAGTGGTTAGGATTT-3， (SEQ ID NO: 11) VPl 反义链5，-CACCAGTTGGTTTAATGGAG-3，(SEQ ID NO 12)
研究结果表明(图4，F、C)，在RD细胞系中过表达了 MVP后，EV71的RNA水平下降 (Ρ<0· 01)，病毒蛋白VPl表达减少，说明MVP能够抑制Η3Ν2的复制；当加入IFN- α后，与对照组相比，EV71的RNA以及蛋白VPl表达水平有更明显的下降(Ρ<0. 01)，这说明MVP能够增强IFN-α的抗病毒作用。二、MVP通过诱导I型IFN的表达从而发挥抗病毒作用 A、MVP诱导I型IFN的产生
1、分离 PBMC。2、用抗凝管收集血液，摇勻，加入RPMI-1640培养液等体积稀释血液；
1)将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上，室温，2000rpm，离心20min， 此时离心管内形成5层最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是PBMC，淋巴细胞分离液和最下面红细胞层之间是粒细胞层；
2)吸去最上层血浆，然后用另一支毛细吸管收集血浆层和淋巴细胞分离液之间的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC加入到加有RPMI-1640的离心管中，避免吸到过多的分离液和血浆；
3)离心(1000rpm，10min)，弃上清，用20mlRPMI-1640再洗一次，用红细胞裂解液裂解 15min。4)离心(IOOOrpm, IOmin),弃上清；
5)加入适量RPMI-1640重悬细胞，按一定的密度接种于六孔板中，至置37°C、5% CO2细胞培养箱中培养。3、病毒诱导
六孔板中的PBMC转染sh-MVP和sh-NC，转染12h后加入病毒，对照组不加病毒，病毒感染3 后，收集上清和细胞，检测相应指标。
4、检测I型IFN的表达
1)用酶联免疫法检测细胞上清中I型IFN的表达
a、标准品额稀释与加样在Elisa板的每个空中梯度稀释标准品，每孔体积50 μ 1，使最终浓度为 Mng/ml，16ng/ml，8ng/ml，4ng/ml，2ng/ml。b、设空白孔不加样品、酶标试剂；待测样品孔样品稀释液40μ 1，待测样品 10 μ 1。加入到酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，晃勻。c、温育用封板膜封板，37°C温育30min。
1
d、配液将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。e、洗涤小心揭开板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次拍干。 f、加酶加入酶标试剂50 μ 1，空白孔除外。g、温育同 C。h、洗涤同 e。i、显色每孔加显色剂Α50μ 1，显色剂Β50μ 1，，振荡混勻，37°C避光显色15min。j、终止每孔加终止液50 μ 1，终止反应。k、空白孔调零。450nm波长测每孔OD值。计算出浓度，用Excel作图分析。2)用荧光定量PCR检测细胞中I型IFN的表达
用1 ml Trizol裂解六孔板中细胞，提取细胞中总RNA，反转录为cDNA，然后用相应引物，应用Real-time PCR检测IFN- α、IFN- β的mRNA表达情况。IFN-α 引物
正义链5，-TTTCTCCTGCCTGAAGGACAG-3，(SEQ ID NO 13) 反义链5，-GCTCATGATTTCTGCTCTGACA-3，(SEQ ID NO 14) IFN-β引物
正义链5，-TGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAA-3，(SEQ ID NO 15) 反义链5，-TCCTTGGCCTTCAGGTAATGCAGA-3，(SEQ ID NO 16) 实验结果表明(如图5，Α、Β)，相比于对照组，加入VSV刺激后，PBMC上清中IFN-α、 IFN- β表达量增加，同时，干扰掉MVP的PBMC较对照组，产生更少的IFN- α、IFN- β，两者具有极显著差异(P<0. 01 )，说明MVP能诱导IFN的表达；同样，荧光定量PCR的结果也显示， 干扰掉MVP后，PBMC中IFN-α、IFN-β mRNA水平下降，并与对照组有显著性差异(Ρ<0. 01)， 这在mRNA水平证明MVP能诱导IFN的表达。B、MVP对IFN通路下游基因表达的影响 1) Huh7细胞转染
a、转染前一天，将生长良好的Huh7细胞制成细胞悬液，接种于六孔板中。b、用Lipo2000转染质粒pCMV-MVP，空载质粒入Huh7细胞中。2) IFN-α 的加入
转染后Mh，细胞内加入IFN-α，同时以不加IFN-α为空白对照。2)转染后48h，收集细胞，用荧光定量PCR检测IFN通路下游基因STAT1、STAT2、 PKR, OAS的mRNA水平变化，蛋白质印迹法检测四种蛋白在蛋白水平的变化。实验结果表明(如图6，A，B)在Huh7细胞系中，过表达MVP后，相比于对照组，IFN 下游因子STAT1、STAT2、PKR、OAS的mRNA、蛋白表达水平都升高，说明MVP能促进IFN产生；当加入IFN-α后，四种因子mRNA、蛋白表达更多，说明MVP能够增强IFN-α的下游反应。STATl 引物
正义链5，-GTGGAAAGACAGCCCTGCAT-3，(SEQ ID NO 17) 反义链5，-ACTGGACCCCTGTCTTCAAGAC-3，(SEQ ID NO 18) STAT2引物正义链:5，- CCCCATCGACCCCTCATC -3，(SEQ ID NO 19) 反义链5，-GAGTCTCACCAGCAGCCTTGT-3，(SEQ ID NO 20) PKR引物
正义链5，- AAAGCGAACAAGGAGTAAG -3，(SEQ ID NO 21) 反义链:5，- GATGATGCCATCCCGTAG -3，(SEQ ID NO 22) OAS引物
正义链:5，- TTCCGTCCATAGGAGCCAC -3，(SEQ ID NO 23) 反义链:5，- AAGCCCTACGAAGAATGTC -3，(SEQ ID NO 24) 三、利用基因工程方法制备MVP A. pCMV-tag2B-MVP表达质粒的获得
用Trizol裂解Huh7细胞，提取RNA，并逆转录为cDNA。设计MVP的PCR引物，扩增MVP 基因片段。将聚合链式反应(PCR)产物经琼脂糖凝胶电泳回收，并通过测序、序列比对鉴定回收产物是否为MVP。将PCR扩增获得的目的基因MVP片段连接到载体pCMV-tag2B-MVP中， 经过琼脂糖凝胶电泳回收连接产物，测序、序列比对获得正确的重组质粒pCMV-tag2B-MVP。 将pCMV-tag2B-MVP转化入大肠杆菌DH5 α，获得大量的质粒pCMV_tag2B_MVP。获得体外表达的MVP
以常数和可变比生长速率进行分批补料发酵工艺，用于对表达MVP的大肠杆菌 BL2KDE3)进行高细胞密度培养。通过控制气流和搅拌速度，并在必要时充以纯氧，使溶氧水平保持在空气饱和度的20% 30%。葡萄糖是唯一的碳源和能源。分别以常数和可变比生长速率补料策略进行分批发酵，在3 之后获得的终细胞密度分别达到了 IOOg干细胞重/L。采用新的阴离子和阳离子交换色谱纯化程序，从包涵体出发纯化MVP。纯化的MVP的功能检测
用HPLC检测MVP的纯度，并进行无菌度、致热性和DNA含量测试，以确保终产品中无有毒性物质和五coli的其它组分。通过病毒细胞病变效应分析检测MVP的抗病毒比活。
权利要求
1.MVP作为标靶在筛选抗病毒药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述病毒为HCV、VSV、IAV、EV71。
3.MVP在制备抗病毒药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述病毒为HCV、VSV、IAV、EV71。
全文摘要
本发明公开了MVP蛋白作为抗病毒药物标靶的应用。本发明证实丙型肝炎患者的肝组织、血清以及血液中分离出的人外周单核细胞中能检测到MVP的高表达；同时，体外实验表明，在丙型肝炎病毒感染Huh7、Huh7.5.1细胞后，细胞内MVP的mRNA、蛋白表达水平上调，此外，VSV、IAV、EV71也可诱导MVP表达从而抑制病毒的复制达到抗病毒作用。进一步探究其机理证实，病毒刺激机体后，MVP的表达上调，MVP诱导Ⅰ型干扰素的产生从而抑制病毒复制，达到抗病毒的作用。本发明提供的MVP在抗病毒反应中的作用，可以作为新的药物靶标，开发出治疗HCV引起的肝炎以及其他病毒引起的疾病。
文档编号G01N33/53GK102517387SQ20111042314
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者刘实, 吴建国, 彭南方, 朱应 申请人:武汉大学