专利名称：一种乙肝病毒感染者血清标志物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域。涉及一种新的乙肝病毒感染者血清标志物。 具体地说，本发明涉及可反映乙肝患者脏器炎症反应的血清标志物亲环素A(CyClophilin A, CypA)，其血清含量的测定方法，及其在慢性乙肝诊断和治疗中的用途。
背景技术：
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一种常见的传染性疾病。据世界
卫生组织统计，全球约有3.5亿人口由于无法清除病毒而发展为慢性携带者。随着病情的 发展，在这些持续性感染患者中，每年有超过100万人死于包括慢性活动性肝炎(chronic active hepatitis)、肝硬化(liver cirrhosis)及原发性肝癌(primary liver cancer)等在内的各类 由乙肝病毒感染引起的肝脏疾病。中国是乙肝病毒最为流行的地区之一，全国有6.9亿人 曾感染过乙肝病毒，其中1.2亿人长期携带乙肝病毒，据估计，目前全国有慢性乙肝病人 2000万人。乙肝病毒感染严重危害了人类的健康，同时也引发一系列社会问题，是我国 现阶段最为突出的公共卫生问题之一。目前国内外对乙肝病毒感染者诊断所采用的血清标志物均为乙肝病毒的蛋白抗 原及抗体(表面抗原及抗体，E抗原及抗体，核心抗体)，以及病毒的DNA。对于患者 的疾病是否活动则采用谷丙转氨酶水平作为指标。此外还根据病情需要可作肝组织活检 及超声波或其他仪器辅助的检测。乙肝病毒感染者血清中，除完整的成熟病毒颗粒外，能检测到大量由乙肝病毒 表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)组成的球形或管状亚病毒颗粒。在多数病 人血清中，HBsAg颗粒含量远远超过成熟病毒颗粒，HBsAg颗粒与病毒颗粒之比能高达 1000 1以上，甚至在检测不到病毒复制的情况下，HBsAg仍能持续大量存在。如此大 量且持续性表达病毒包膜蛋白是乙肝病毒独有的特性，因此目前已被公认为是感染乙肝 病毒的重要诊断指标。病人血清HBsAg持续阳性超过6个月仍未被清除即被认为罹患慢 性肝炎。此外，由于已知HBsAg诱生机体产生的抗体具有保护作用，因此HBsAg又是 制作预防性疫苗的主要组分。亲环素A(cyclophilinA，CypA)是免疫抑制剂环孢菌素(cyclosporing A，CsA)
的受体，是免疫亲和素家族(immunophilin，即PPIase酶)中的一员，也是细胞内的一种 伴侣蛋白，可影响细胞蛋白的折叠。研究发现，CypA是一个多功能的细胞蛋白，参与了 多个重要的细胞生理活动，并在肿瘤发生、炎症反应的免疫调节、HIV病毒感染以及心 血管疾病等诸多方面都起到了重要的作用。近年来发现免疫亲和素家族中的CypB可作 用于丙型肝炎病毒NS5B亚基因片段，利用该基因片段作为药靶，已开发研制抗丙型肝炎 药物。HBsAg在细胞内表达具有多种效应。近来有研究发现HBsAg在细胞内的表达和 分泌能显著促进CypA的分泌。迄今，国内外尚无以CypA作为一种乙肝病毒感染者的血 清标志物。
与本发明有关的文献Braaten, D.，and J.Luban.2001.Cyclophilin A regulates HIV—1 infectivity, asdemonstrated by gene targeting in human T cells.Embo J 20 1300—9.Castro, A.P., T.M.Carvalho, N.Moussatche, and C.R.Damaso.2003.Redistribution of cyclophilin A to viral factories during vaccinia virusinfection and its incorporation into mature particles.J Virol 77 9052-68.Jin, Z.G., M.G.Melaragno, D.F.Liao，C.Yan, J.Haendeler, Y.A.Suh, J.D.Lambeth, and B.C.Berk.2000.Cyclophilin A is a secreted growth factorinduced by oxidative stress.Circ Res 87 789-96Sokolskaja, E., D.M.Sayah, and J.Luban.2004.Target cell cyclophilin Amodulates human immunodeficiency virus type 1 infectivity.J Virol78 12800—8.Watashi, K., and K.Shimotohno.2007.Chemical genetics approach tohepatitis C virus replication cyclophilin as a target for anti-hepatitis C virusstrategy.Rev Med Virol 17 245—52Zhao, C., C.Y.Fang, X.C.Tian, L.Wang, P.Y.Yang, and Y.M.Wen.2007. Proteomic analysis of hepatitis B surface antigen positive transgenic mouseliver and decrease of cyclophilin A.J Med Virol 79 1478-8
发明内容
本发明的目的是提供一种新的乙型肝炎病毒感染者血清标志物。尤其涉及可反 映乙肝患者脏器炎症反应的血清标志物亲环素A(CyClophilinA，CypA)，其血清含量的测
定方法。由于CypA蛋白在乙肝病毒表面抗原的作用下可自细胞内分泌至细胞外，进入血 液，从而可以在感染者血清中检测CypA蛋白；鉴于细胞外的CypA蛋白具有吸引炎症细 胞的作用，因此血清中的CypA蛋白可反映感染者肝脏内炎症的严重程度。本发明建立 了在乙肝病毒感染机体的血清中检测CypA的方法，并进一步采用以CypA为血清标志物 为判断乙肝病情发展严重程度提供参考标准。本发明的进一步目的是提供CypA在研制慢性乙肝诊断制剂和治疗药物中的用途。本发明的进一步目的是提供一种慢性乙肝诊断试剂盒，该试剂盒包含针对抗亲 环素A的抗体和应用酶联免疫法(enzyme linked immunosorbant assay, ELISA)检测血清
蛋白水平的试剂盒所含的常规组份。本发明所述的CypA蛋白，其对应的核苷酸序列以及氨基酸序列均可从公开发布的GenBank数据库中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得，其核苷酸序列的收录号为 NM_021130.3，其氨基酸序列的收录号为NP_066953.1。本发明通过Western Blot或ELISA方法检测血清CypA蛋白的含量变化，其包括
下述步骤1)采集标本采集慢性乙肝病人血液或者实验动物(小鼠)血液；2)分离血清室温8000转/分钟条件下，离心10分钟分离血清；3)检测血清CypA含量其中，
Western Blot的方法用SDS-PAGE凝胶电泳方法将标本血清蛋白分离后，用转 膜仪以200mA恒流1小时的条件将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，经5%脱脂奶粉溶液室温 封闭2小时后，用抗CypA抗体4°C孵育过夜，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵 育2小时后，用市售的通用型电化学发光液(electrochemiluminescence，ECL)检测膜上血 清CypA的含量；ELISA法用不带标记物的抗CypA抗体包板，加入病人血清或者小鼠血清， 37°C孵育1小时后，洗板，再加入另一种带有标记物(如辣根过氧化物酶)的CypA抗体 37°C孵育30分钟，洗板后加入显色液反应，用酶标仪在波长450nm处读取OD值后计算
血清CypA含量。 4)分析CypA含量结果比较实验组与对照组小鼠血清CypA含量或正常人与乙肝病人血清CypA含量的 不同，并分析CypA含量与血清HBsAg含量以及肝脏炎症反应程度的相关性。本发明通过高压尾静脉注射技术在动物实验中证明，HBsAg表达与CypA分泌 及肝内炎症反应具有相关性，而且使用药物环孢菌素AfcyclosporineA，CsA)处理小鼠阻 断CypA功能后即可降低炎症反应。并且这一现象也已在乙肝患者的血清标本中得到证 实。本发明利用血清CypA蛋白的检测技术，通过检测乙肝患者血清CypA的含量， 观察感染者肝脏中的炎症程度，对乙肝病人病程发展及预后可进行辅助诊断和监测。所 述的CypA蛋白可作为药靶，研发与之作用的抗乙肝药物。在药物研发中可采用CypA作 为标志物筛选抗乙肝的药物，并以此作为判断治疗效果和评价药物疗效的标志物。由于 每个个体CypA蛋白表达水平可有差异，还可采用CypA作为个体化治疗的参考，以及作 为判断病人对药物敏感性以及有效性的标志物。本发明的特点为不用肝穿刺等损伤性技术，通过检测血清CypA水平的变化，了 解乙肝感染者肝内的炎症反应变化，可简便快捷的诊断慢性乙肝病人的病情发展过程， 是一种新的对现有乙肝患者血清标志物的重要补充。
图1是.HBsAg阳性小鼠血清CypA含量及其与肝脏炎症反应的相关性，其中，用高压尾静脉注射技术将HBsAg表达质粒注入小鼠肝脏后，检测血清 HBsAg和CypA含量，以及肝脏组织的免疫组化染色和苏木精-伊红染色的结果；(A)血 清HBsAg含量；(B)血清CypA含量；(OD)注射HBsAg的小鼠肝脏组织免疫组化染色 和苏木精-伊红染色结果，C中箭头所示为HBsAg阳性肝细胞，D中箭头所示为炎症浸 润灶；(E-F)注射空载体质粒的对照组小鼠肝脏组织免疫组化染色和苏木精-伊红染色结^ ο图2.是CsA处理后HBsAg阳性小鼠血清CypA含量及其与肝脏炎症反应的相关 性，其中，用药物CsA(CypA的抑制剂)先腹腔注射小鼠再如图1处理小鼠，检测小 鼠血清HBsAg和CypA含量，以及肝脏组织的免疫组化染色和苏木精-伊红染色的结果； (A)血清HBsAg含量；(B)血清CypA含量；(OD) CsA处理组HBsAg阳性小鼠肝脏组织免疫组化染色和苏木精-伊红染色结果；(E-F)未经CsA处理组HBsAg阳性小鼠肝脏 组织免疫组化染色和苏木精-伊红染色结果；(G-H)注射空载体质粒的对照组小鼠肝脏 组织免疫组化染色和苏木精_伊红染色结果。图3是慢性乙肝病人和健康正常人血清CyPA含量比较，其中，可见慢性乙肝患者的血清CypA含量高于正常健康成人。图4是肝移植病人手术前后血清CyPA含量比较，其中，可见同一个体在肝移植前血清CyPA含量高，而移植后多数血清CyPA下降；同时显示个体间血清CyPA变化有所不同。
具体实施例方式实施例1动物实验研究(1)构建HBsAg真核表达质粒根据GenBank 中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开发表的 HBV 全基因组序 列C8(GenBank收录号为AF461363)为模板，用已知技术设计PCR引物(上游引物为 ctaggatccatggagagcacaacatcag，下游引物为 gccgaattctcaaatgtatacccaaagac),应用 PCR 技 术扩增完整的HBsAg编码序列。将扩增的HBsAg基因片段插入至Invitrogen公司的 pcDNA3.1质粒载体的多克隆位点区域的BamHI和EcoRI酶切位点之间，HBsAg基因表 达受CMV启动子控制，可在真核细胞中表达。(2)利用已知的高压尾静脉注射技术使HBsAg在小鼠肝脏中表达将10 μ g HBsAg真核表达质粒稀释于Ringer，s等渗缓冲液(154mM NaCl, 5.63mM KCl, 2.25mM CaCl2)后在5秒内由尾静脉快速注入C57BL/6J小鼠体内。等渗 液体积为小鼠体重的10%。实验用小鼠为6-8周，体重在18-20g左右。在注射后第4 天，摘眼球采血法收集小鼠血液并分离血清，随后以脱颈椎法处死小鼠。取小鼠肝脏组 织，置于10%福尔马林溶液中固定，用于免疫组化及HE染色实验。(3)环孢菌素A或其衍生物药物抑制实验所述的CypA抑制实验可用环孢菌素A或由环孢菌素A改造的各类衍生物药物 进行，本发明中，选用药物环孢菌素AfcyclosporineA，CsA)为CypA的抑制剂(目前作 为免疫抑制剂广泛用于临床)，可与CypA结合并抑制其功能。将CsA用生理盐水稀释 至1.5mg/ml的浓度后以15mg/kg的剂量通过腹腔注射打入注射过HBsAg表达质粒的实
验小鼠中。(4)血清HBsAg以及CypA含量检测用上海科华生物工程有限公司的乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒以ELISA的 方法检测血清HBsAg的含量。取Iul血清用SDS-PAGE凝胶电泳的方法分离血清蛋白后，以200mA恒流转膜 1小时的条件将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，经5%脱脂奶粉溶液室温封闭2小时后，用 抗CypA抗体4°C孵育过夜，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2小时后，用市 售的通用型ECL电化学发光液检测膜上血清蛋白CypA的含量。分析HBsAg血清含量与CypA血清含量的相关性。(5)苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin，HE)染色染色和免疫组化染色
将经福尔马林固定过夜的肝脏组织用石蜡包埋，切片，随后经脱蜡和抗原修复 后用10%正常羊血清室温封闭15分钟。切片中加入1 100稀释的抗HBsAg单克隆抗 体，4°C湿盒孵育过夜。随后用生物素标记的二抗，湿盒37°C孵育1小时。最后加入 DAB-H2O2显色15分钟左右，水洗终止显色。用苏木精复染后，封片，镜检观察。观 察小鼠肝脏细胞HBsAg的表达水平和炎症浸润情况。(6)结果分析对实验结果进行分析，研究HBsAg表达、CypA分泌以及炎性细胞浸润三者的 相关性。结果表明，HBsAg能促进CypA的分泌，与对照组小鼠相比，HBsAg阳性的实 验组小鼠血清CypA含量明显上升。胞外CypA蛋白具有趋化因子的功能，能吸引炎症细 胞至HBsAg阳性的肝细胞周围，造成局部的炎症浸润现象。免疫组化和HE染色实验结 果显示，在HBsAg阳性的肝细胞常伴随有炎症细胞浸润的现象(图1)。此外，CsA抑 制实验显示，用CsA处理小鼠后，CypA的趋化功能受到抑制，肝脏炎症浸润现象明显减 少(图2)。结果表明CypA血清含量与HBsAg表达以及肝脏炎症反应具有相关性。CypA 可作为反映肝脏炎症反应和病毒蛋白表达情况的血清标志物。CsA抑制实验的结果表明 细胞蛋白CypA是潜在的HBV治疗的靶点，可利用CypA作为筛选抗乙肝药物的标志物， 以此判断治疗效果和评价药物疗效。实施例2慢性乙肝病人血清CypA含量研究1.收集慢性乙型肝炎病人和健康正常人的血清慢性乙肝诊断的标准为血清HBsAg持续阳性至少6个月，血清转氨酶水平升高 至少2倍以上，同时伴有其他相应的症状。相应的对照组为没有乙肝病毒感染且血清转 氨酶水平正常的将抗人群。所有样品均排除了丙型肝炎(hepatitis Cviras，HCV)、丁型 肝炎(hepatitis D virus, HDV)以及人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus 1， HIV-1)共感染的可能性。取Iul血清用SDS-PAGE凝胶电泳的方法进行分离后，以 200mA恒流转膜1小时，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，经5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 小时后，用抗CypA抗体4°C孵育过夜，然后用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2小 时后，用ECL化学发光液检测膜上血清蛋白CypA的含量。结果显示，与正常人相比， 慢性乙肝患者的血清CypA含量显著升高(图3)。2.收集因乙型肝炎而进行肝移植手术病人移植前后的血清 所有病人在肝移植手术前均为HBsAg阳性，手术后至少6个月内为HBsAg阴性 并且检测不出HBV病毒DNA。所有样品均排除了 HCV、HDV以及HIV共感染的可能 性。取Iul血清用western blot的方法用抗CypA抗体检测血清蛋白CypA的含量。结果显 示，与移植前相比，绝大多数病人在肝移植手术后HBV被清除的情况下，其血清CyPA 含量发生了明显下降(图4)。上述实验结果表明血清CypA的含量与乙肝病毒感染紧密相关，可以采用血清 CypA含量作为慢性乙肝病情诊断的标志物。
权利要求
1.一种乙型肝炎感染者血清标志物，其特征在于，其具有亲环素A蛋白的氨基酸序 列；其对应的核苷酸序列以及氨基酸序列为GenBank数据库登录，其核苷酸序列的收录 号为NM_021130.3，其氨基酸序列的收录号为NP_066953.1。
2.—种检测权利要求1所述的乙型肝炎感染者血清标志物的方法，其特征在于，通过 下述步骤1)采集标本采集慢性乙肝病人血液或者实验动物小鼠血液；2)分离血清室温8000转/分钟条件下，离心10分钟分离血清；3)血清CypA蛋白的含量测定采用Western Blot的方法用SDS-PAGE凝胶电泳方法将标本血清蛋白分离后，用转 膜仪以200mA恒流1小时的条件将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，经5%脱脂奶粉溶液室温 封闭2小时后，用特异性的抗CypA抗体4°C孵育过夜，然后用辣根过氧化物酶标记的二 抗室温孵育2小时后，用ECL化学发光液检测膜上血清CypA的含量；或，采用ELISA法用一种不带标记物的抗CypA抗体包板，加入乙型肝炎感染者血清 或者小鼠血清，37°C孵育1小时后，洗板，再加入另一种带有标记物辣根过氧化物酶的 CypA抗体37°C孵育30分钟，洗板后加入显色液反应，用酶标仪读取波长在450nm处的 OD值后计算血清CypA含量；4)分析CypA含量结果比较实验组与对照组小鼠血清CypA含量或正常人与乙型肝炎感染者血清CypA含量 的不同，并分析血清CypA含量与血清HBsAg含量以及肝脏炎症反应程度的相关性。
3.亲环素A在制备治疗慢性乙肝药物中的用途。
4.按权利要求3所述的用途，其中所述的药物是环孢菌素A或其衍生物。
5.亲环素A在制备慢性乙肝诊断制剂中的用途。
6.按权利要求5所述的用途，其中所述的诊断试剂是用于诊断慢性乙肝患者肝脏炎症 情况的诊断试剂盒，该试剂盒包含针对抗亲环素A的抗体和应用酶联免疫法检测血清蛋 白水平的试剂盒所含的常规组份。
全文摘要
本发明属于生物技术和医学领域。涉及一种新的乙肝病毒感染者血清标志物。具体涉及可反映乙肝患者脏器炎症反应的血清标志物亲环素A，其血清含量的测定方法，及其在慢性乙肝诊断和治疗中的用途。本发明通过Western Blot或ELISA方法检测血清CypA蛋白的含量变化，经实验表明，所述的CypA蛋白在慢性乙肝病人血清中显著升高，并与肝脏炎症反应相关，可作为一种无创伤性、简便、迅速的乙肝病程发展的血清标志物，进一步制备乙肝诊断试剂盒和抗病毒药物。建立的检测技术可用于乙肝感染者病程与预后的判断、疗效考核以及开发新型抗乙肝病毒药物。
文档编号G01N21/76GK102023218SQ20091019575
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月16日 优先权日2009年9月16日
发明者田晓晨, 闻玉梅 申请人:复旦大学