专利名称：：筛选拮抗Vpu降解BST-2活性的抗病毒药物的方法
技术领域：
：本发明涉及药物领域，特别是涉及抗艾滋病药物的筛选模型，即一种筛选拮抗Vpu降解BST-2活性的抗病毒药物的方法。
背景技术：
：艾滋病(acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)是由人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)感染导致人体免疫机能缺陷，而易于发生机会性感染和肿瘤的临床综合征。在过去的20多年里造成2000多万人死亡，目前全世界艾滋病病毒感染者已达4000万左右。艾滋病不仅成为我国严重的卫生健康问题，同时每年造成了上千亿的直接经济损失。据中国卫生部通报，至2009年年底，中国将约有74万艾滋病病毒感染者；2009年新发艾滋病感染者达到4.8万。目前临床使用的传统的抗艾滋病药物虽在抗HIV-1方面起到了很大的作用，但仍存在一些问题，如在人体内活性不高、口服生物利用度低、易产生耐药性或交叉耐药性及生产成本高等。抗艾滋病病毒药物治疗中所面临的问题表明研发针对崭新药物靶点的新型抗艾滋病药物仍然迫在眉睫。病毒的耐药性是目前艾滋病药物治疗中最亟需解决的问题。耐药是病毒的药物作用靶位蛋白变异的结果。因为耐药株经常对一组抗病毒药物耐药，并且同一类药物之间交叉耐药非常常见。HIV-1之所以能够迅速产生针对现有临床应用的抗病毒药物的耐药性，其主要根源在于这些药物所针对的靶点都是病毒本身。而病原病毒天然就具有高变异的特点，在药物的选择压力下，很容易引起病毒的迅速变异从而产生耐药。因此，解决HIV-1的耐药性问题的关键之一在于必须突破传统的"以病原病毒本身为耙"的药物发展模式。在生物进化的漫长过程中，宿主细胞会形成针对不同病原病毒的防御体系，而病毒也会形成特异性的拮抗机制，以逃避宿主细胞的抑制作用。在不影响宿主生存能力的前提下，特异性地上调宿主天然的抗病毒机制不仅可以有效地抑制病毒的复制，同时也可以明显减小甚至是避免药物对病毒的选择压力，从而降低耐药性突变发生的可能性。因此，"以宿主为靶"的药物发展模式已经成为解决目前抗病毒药物耐药性难题的重要研究策略之一。最近研究发现，宿主因子BST-2(也命名为Tetherin/HMl.24/CD317)阻止细胞膜表面HIV-1病毒的释放，而HIV-1的辅助蛋白Vpu则可以通过溶酶体途径降解BST-2来拮抗其活性，提高病毒释放量。宿主因子BST-2属n型整合膜蛋白，整个蛋白为同源二聚体，被异源糖基化，大小为30-36kDa，BST-2在Hela细胞系中为组成性表达，而在293T、HOS、HT1080细胞系中则不表达或表达量非常低，因此对于HIV-1病毒释放，Hela细胞系为Vpu依赖，而293T、HOS、HT1080细胞系为Vpu非依赖。干扰素可诱导表达BST_2，使得293T、HOS、HT1080细胞系由Vpu非依赖转变为Vpu依赖。如能阻止Vpu降解BST-2，提高细胞表面BST-2含量，则可以抑制病毒释放，从而达到抗病毒效果。
发明内容在上述研究的基础上，本发明的目的是提供一种筛选拮抗Vpu降解BST-2活性的抗病毒药物的方法。利用此方法可以快速、有效、高通量筛选待测药物的抗病毒活性，为筛选出安全可靠且有效的抗HIV病毒药物提供了切实可行的方法。细胞酶联免疫吸附试验(cell-ELISA)是用细胞代替可溶性抗原包被于酶联板(或细胞培养板)进行免疫学检测的一种有效方法。我们运用该技术，建立了筛选拮抗Vpu降解BST-2活性的高通量筛选模型。本发明的技术方案提供一种筛选拮抗Vpu降解BST-2活性的抗病毒药物的方法，其采用可稳定表达Vpu蛋白的单克隆Hela细胞系包被于细胞培养板中，运用cell-ELISA技术，用BST-2抗体和相应的辣根过氧化物酶HRP标记的二抗依次孵育包被于细胞培养板的细胞，最后通过TMB显色液显色，根据450nm处吸光值0D的大小来确定细胞表面BST-2抗原含量。细胞表面BST-2含量越高，则孵育结合的抗体越多，HRP酶活性越高，催化底物反应越快，在450nm处0D值越大。如加入的化合物能阻止Vpu降解BST_2，则450nm处OD值升高。本发明的方法，其中需要首先建立可稳定表达Vpu蛋白的单克隆Hela细胞系，所述单克隆Hela细胞系的构建方法的一种包括以下步骤(1)将扩增的vpu片段插入到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen)的多克隆位点，得到质粒pcDNA3.1-vpu;(2)接种培养Hela细胞，转染质粒pcDNA3.1-vpu;常规培养后，得到可稳定表达Vpu的多克隆Hela细胞系；(3)将多克隆细胞系单克隆化，得到可稳定表达Vpu的单克隆Hela细胞系。本发明的方法，构建好上述单克隆Hela细胞系后，取稳定表达Vpu的单克隆Hela细胞进行培养，接种细胞培养板，培养16-24h(优选24h)后，加入待筛选的药物处理。药物处理14-16h后，弃培养基，细胞经洗涤、固定、封闭后，加入BST-2抗体1:5000i:50000(优选i:20000)室温孵育i2h，清洗细胞，加入服p标记二抗i:10001:10000(优选1:1500)室温孵育0.52h，清洗细胞，加入TMB显色液避光放置2040min后，加入0.5MH2S04终止显色，立即于450nm处测定OD值。上述技术方案具有如下优点1)利用本发明的筛选方法可以快速、经济、高通量地确定待测药物的活性；2)作为细胞水平的筛选模型，可以避免由于细胞毒性等非特异因素造成的假阳性，提高筛选的准确率；3)可以排除细胞透过性比较差的活性化合物，提高先导化合物的成药性；4)以内源性BST-2作为靶分子，其表达、调控、细胞转运与分布均为正常生理状态。具体实施例方式下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明的筛选方法(筛选模型)的作用原理首先建立稳定表达Vpu蛋白的单克隆Hela细胞系，96孔酶标板或细胞培养板接种细胞培养16-24h，添加待测药物样品处理，再培养14-16h，运用cell-ELISA技术，根据4450nm处0D值的大小来确定细胞表面BST-2含量。如加入的化合物能阻止Vpu降解BST-2，则450nm处0D值升高。实施例1:稳定表达Vpu的单克隆Hela细胞系的构建(1)构建Vpu表达载体应用PCR扩增BH10质粒(NIHAIDSResearch&ReferenceReagentProgram)中的vpu基因片段。所用引物上游引物5'-TCTGCAGAATTCGGGAAAGACGCAAG-3'(如SEQIDNO.1所示)，下游引物5'AAGCCGCTCGAGCCATAATAGACTGTGAC-3'(如SEQIDNO.2所示)。反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>反应条件94。C45s，68。C60s，共30个循环。将扩增的vpu片段插入到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen)的多克隆位点(EcoRI和Xhol)，得到质粒pcDNA3.1-vpu，表达HIV-1辅助蛋白Vpu。(2)稳定表达Vpu的单克隆Hela细胞系的建立6孔板接种Hela细胞2X105个，37。C，5%的C02培养24h后，按照FuGENEHDTransfectionReagent(Roche)说明书转染质粒pcDNA3.l-vpu，转染比例为4:1。具体操作如下用100ii1高糖DMEM培养基稀释质粒pcDNA3.1-vpu1.0iig禾P4ii1FuGENEHDTransfectionReagent，室温孵育15min，加到6孔板的细胞培养上清中。转染24h后，弃培养基，用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液消化细胞，以1:20稀释接种。培养24h后，加入终浓度为400iig/mlG418(氨基糖苷类抗生素，上海浩然生物技术有限公司)进行选择性培养，每3d换液一次，培养15d后，得到稳定表达Vpu的多克隆Hela细胞系。应用有限稀释法将多克隆细胞系单克隆化，最终得到一株稳定表达Vpu的单克隆Hela细胞系，命名为Hela-Vpu。实施例2:药物的筛选过程(1)细胞培养取Hela-Vpu细胞进行培养，待细胞长满培养瓶后，弃旧培养基，用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液消化。待细胞变圆，弃消化液，立即加入含10%FBS(胎牛血清)的高糖DMEM培养基(HyClone)，用吸管轻轻吹打瓶底，使细胞完全脱离瓶底且使之分散为单细胞悬液。血球计数板计数后，96孔细胞培养板每孔接种细胞1X104个，培养24h后，加入药物处理。(2)样品制备化合物样品10mg纯品化合物溶到lmlDMSO中，50%DMSO稀释到lmg/ml，取1.0ill作用于100ill细胞体系，使其终浓度为10iig/ml。发酵液样品菌种发酵，从斜面上挑取一小块培养物种入盛有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28t:、190rpm旋转摇床培养4d。取10ml发酵液用10ml的丙酮抽提，挥干后，用1ml的DMSO溶解。取lOiU力BlOiU水倍比稀释，取1.0ill作用于100细胞体系。ConcanamycinA购自Sigma公司，DMSO溶解，浓度为10线取0.5ii1作用于lOOiU细胞体系。ConcanamycinA是溶酶体降解途径抑制剂，在本筛选模型里作为阳性化合物。(3)样品活性检测实验组分为三组，阴性对照组加入1.0ill50%匿SO于细胞培养上清中，该组反映Vpu对BST-2的降解程度。阳性药对照组加0.5ill的10iiMConcanamycinA于100的细胞体系中，使ConcanamycinA的终浓度为50nM。该组反映溶酶体降解途径抑制剂ConcanamycinA对Vpu降解BST-2的抑制程度。样品实验组加入筛选的样品1.0ill于100ill的细胞体系中。该组反映筛选样品对Vpu降解BST-2的抑制程度。药物处理14-16h，弃培养基，PBS洗细胞2次，4X多聚甲醛室温固定20min，PBS洗细胞3次，5%脱脂奶粉室温封闭lh，BST-2抗体(NIH提供)1:20000室温孵育2h，PBS洗细胞3次，HRP标记donkeyanti-rabbitIgG(购自SantaCruz)1:1500室温孵育lh，PBS洗细胞3次，每孔加入1001TMB显色液(购自康为世纪)，避光放置30min后，每孔加入50ill0.5MH2S04终止显色，立即于450nm处测定0D值。降解抑制率=(样品实验组0D-阴性对照组OD)/(阳性组0D-阴性对照组OD)X100%筛选结果为，从组合化学库共筛选3000个样品，得到阳性化合物(降解抑制率>50%)11个，阳性率为0.37%。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。权利要求一种筛选拮抗Vpu降解BST-2活性的抗病毒药物的方法，其特征在于，采用可稳定表达Vpu蛋白的单克隆Hela细胞系包被于细胞培养板中，然后用BST-2抗体和相应的辣根过氧化物酶HRP标记的二抗依次孵育包被于细胞培养板的细胞，最后通过TMB显色液显色，根据450nm处吸光值OD的大小来确定细胞表面BST-2抗原含量。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述可稳定表达Vpu蛋白的单克隆Hela细胞系的制备方法包括以下步骤(1)将扩增的vpu片段插入到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen)的多克隆位点，得到质粒pcDNA3.1-vpu;(2)接种培养Hela细胞，转染质粒pcDNA3.1-vpu;常规培养后，得到可稳定表达Vpu的多克隆Hela细胞系；(3)将多克隆细胞系单克隆化，得到可稳定表达Vpu的单克隆Hela细胞系。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，取稳定表达Vpu的单克隆Hela细胞进行培养，接种细胞培养板，培养16_24h后，加入待筛选的药物处理。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，药物处理14-16h后，弃培养基，细胞经洗涤、固定、封闭后，加入BST-2抗体l:50001:50000室温孵育12h，清洗细胞，加入HRP标记二抗l:10001:IOOOO室温孵育O.52h，清洗细胞，加入TMB显色液避光放置2040min后，加入0.5MH2S04终止显色，立即于450nm处测定OD值。全文摘要本发明公开了一种筛选拮抗Vpu降解BST-2活性的抗病毒药物的方法，采用可稳定表达Vpu蛋白的单克隆Hela细胞系包被于细胞培养板中，然后用BST-2抗体和相应的辣根过氧化物酶HRP标记的二抗依次孵育包被于细胞培养板的细胞，最后通过TMB显色液显色，根据450nm处吸光值OD的大小来确定细胞表面BST-2抗原含量。本发明的方法可以快速、有效、高通量筛选待测药物的抗病毒活性，为筛选出安全可靠且有效的抗HIV病毒药物提供了切实可行的方法。文档编号G01N33/531GK101793898SQ20101012300公开日2010年8月4日申请日期2010年3月12日优先权日2010年3月12日发明者刘振龙,周金明,岑山,张全,李晓宇,贾平平,魏晓露申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所