专利名称：电磁辐射诱发Raji细胞癌变的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种电磁辐射致癌性的检测方法，尤其是电磁辐射诱发Raji细胞癌 变的检测方法。
背景技术：
随着科学技术的飞速发展，电磁技术已经成为工业、医疗、通讯等领域中不可或缺 的重要工具之一。电磁技术在方便人们日常生活的同时，对人体的影响也受到越来越多的 关注。电磁波可以透入生物体，并与生物组织发生相互作用，导致不同生物层次上的形态、 结构及功能发生改变，甚至诱发癌症。如何预防或减少电磁辐射对人体的伤害，已日益成为 生命科学、环境科学和医疗卫生领域的研究热点。通过对电磁辐射的生物效应进行深入研 究，目前已经提出了多种作用机理的模型、假说和理论。1982年美国政府制订了一套基于热 效应的射频辐射标准，用比吸收率(Specific Absorption Rate, SAR，单位为W/kg)值来衡 量电磁辐射的热效应，该标准逐渐被全世界所接收并沿用至今。但是，越来越多的现象表明 仅仅用SAR值来衡量电磁辐射对人体的影响是不够的，因为长期的电磁辐射给人体造成一 系列的健康问题无法用热效应解释和评价。于是，大量研究尝试分析其它一些参数指标来 确定电磁辐射的危害。 Leszczynski等人(D丄eszczynski， et al. Differentiation. 2002， 70 :120 129)研究了电磁辐射对人内皮细胞的影响，发现能引起热休克蛋白27(HSP27)的短暂磷 酸化，并能激活多种细胞信号转换路径，并提出电磁辐射诱导的HSP27活化能阻止细胞 色素C的凋亡路径，从而导致脑瘤的发生。Di carlo等人(A.DiCarlo， et al. J. Cell. Biochem. 2002,84 :447 454)用功率为3. 5mW的电磁辐射对鸡胚胎进行每日30 60分钟 的辐射，连续辐射4天，结果发现与对照组相比热休克蛋白70(HSP70)水平下降了 27%，从 而胚胎防御缺氧应激的能力降低，提示长期暴露于电磁辐射会由于HSP70水平降低而导致 细胞自我保护能力降低，从而增加发生肿瘤的可能性。Kramarenko等人(A. V. Kramarenko， et al. Int. J. Neurosci. 2003， 113 :1007 1019)研究了高频电磁辐射对人脑电图的影响， 发现用手机照射人脑后，在颞骨部位出现2. 5 6. 0Hz的慢波，每15 20秒出现一次，持续 约1秒；在儿童中有类似的发现，但慢波出现较早、振幅较大、持续时间长且间隔短，表明手 机辐射会影响人的大脑，而且可能更容易对儿童大脑造成损伤。然而，并非所有实验都证明 电磁辐射会对人体的正常生理指标产生影响。比如在Tahvanainen等人(K. Tahvanainen， et al. Bioelectromagnetics. 2004,25 :73 83)的研究中，他们用900MHz和1800MHz的 手机辐射作用于志愿者35分钟，结果发现动脉血压和心率与对照组没有显著差异。
以上这些研究由于受到实验条件的限制，不能确定长期的电磁辐射所造成的危害 及程度，特别是不能对电磁辐射的致癌作用进行评价。由于在实验研究中利用不同的生物 学体系，如不同的细胞或动物亚型及生物体处于不同的生理状态等个体差异，或使用不同 的辐射装置、实验程序等分析电磁辐射的生物学后果，有的甚至得出相反的结论，从而对确 定电磁辐射的致癌作用带来了困难。因此，目前亟需一种可靠的方法来定量地检测电磁辐射的致癌性。 Raji细胞是一种淋巴瘤细胞系，常用于致癌剂和促癌剂的检测。Raji细胞携带 Epstein-Barr(EB)病毒基因，EB病毒与许多恶性淋巴瘤和上皮性恶性肿瘤有关，其中尤以 与Burkitt淋巴瘤和鼻咽癌的关系最为密切。正常情况下，EB病毒在Raji细胞中处于潜 伏状态，不能自发地产生EB病毒增殖后期的抗原和病毒粒子。但当Raji细胞被激活时，EB 病毒的早期抗原被激发，其表达会增加。到目前为止，利用Raji细胞的这一特性检测电磁 辐射诱发细胞癌变的方法尚未见国内外文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、重复性好的电磁辐射诱发Raji细胞癌变的 检测方法。 本发明所提供的一种电磁辐射诱发Raji细胞癌变的检测方法，包括以下步骤
(l)Raji细胞的培养与传代 将Raji细胞在37°C、5% C02培养箱内用RPMI-1640培养液培养并进行传代， RPMI-1640培养液含有10%小牛血清、1%青霉素、1%链霉素、1%谷胺酰胺； [OOW] (2)暴露实验 将Raji细胞中加入促癌剂丁酸钠、巴豆油、12-0-十四烷酰巴豆醇-13_乙酸酯 (12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate， TPA)或丁酸钠+巴豆油，用RPMI-1640培养 液培养，将装有Raji细胞的培养板置于横电磁波传输小室(TransverseElectromagnetic Transmission Cell,简称TEM小室)中，再将TEM小室置于5% C02培养箱中，同时，将Raji 细胞暴露于功率密度为30 90W/m2的电磁辐射下，设定培养箱温度为36. 5。C，每天辐射2 小时，培养3 15天；
(3)免疫酶检测 将上述细胞离心、涂片、晾干、固定处理后，滴加鼻咽癌患者阳性血清，并在37t:培
养箱中培养40分钟，取出后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗干净，晾干，加辣根过氧化物酶标 记的羊抗人免疫球蛋白A进行酶标，并在37t:培养箱中培养40分钟，然后放入酶底物溶液 中5 10分钟，最后用PBS冲洗干净后镜检。 上述步骤(1)中的促癌剂优选12-0-十四烷酰巴豆醇-13-乙酸酯。 上述步骤(3)中的磷酸盐缓冲溶液含有NaCl 8. Og/L，KCl 0. 2g/L， Na2HP04l. 44g/
L， KH2P040 . 24g/L， pH 7. 4。 上述步骤(3)中的酶底物溶液含有3，3'-二氨基联苯胺0.5g/L，三羟甲基氨基甲 烷盐酸盐(Tris-HCl)O. 05mol/L，0. 003% H202， pH 7. 6。 本发明方法以Raji细胞作为抗原靶细胞，经过电磁波照射后，再用免疫酶法检测 Raji细胞中EB病毒早期抗原(Epstein-Barr virus early antigen, EBV-EA)的表达。
本发明方法中的促癌剂丁酸钠、巴豆油和TPA 可以激活类淋巴细胞内潜伏状态 的EB病毒，诱发Raji细胞中EBV-EA的表达。 本发明将Raji细胞作为体应用于检测电磁辐射的致癌作用，使用免疫酶法对阳 性细胞进行检测，了一种通过检测Raji细胞中的EBV-EA来检测电磁辐射致癌性的方法，无 需特，检测过程简单。
本发明方法可以应用于工业、科学、医疗以及日常生活中电磁辐射的致癌性预评 价，这将对预防电磁辐射对人体健康的期危害具有重要价值。
具体实方
实1 (l)Raji细胞的培养与传代 将Raji细胞在37°C、5% C02培养箱内用RPMI-1640培养液培养，当细胞生长增殖 形成单层细胞后，小心吸出培养液，再加入的培养液，用吸将细胞成单细胞液，然后将细胞 液吸出分装至3个培养中，放入C02培养箱中续培养；
(2)暴露实验 在Raji细胞培养板上加入度为500ng/m 丁酸钠，用RPMI-1640培养液培养，将装 有Raji细胞的培养板放入TEM中，再将TEM置于5% C02培养箱中，同时，将Raji细胞暴 露于功率密度为30W/m2的电磁辐射下，设定培养箱温度为36. 5t:，每天辐射2小时，培养3 天，电磁辐射由Agilent 8648C信号产生，经20W功率放大放大，电磁辐射度由Narda制；
(3)免疫酶检测 将对照组和实验组细胞离心后，重细胞并细胞数，取lOOuL细胞涂片，晾干，然后 用预的在4t:箱中固定15分钟，晾干，滴加鼻咽癌患者阳性血清，将涂片放入，在37t:培养 箱中培养40分钟，取出后用PBS冲洗干净，晾干，加辣根过氧化物酶标记的羊抗人免疫球蛋 白A (，经科化学试剂)进行酶标后放入，在37t:培养箱中培养40分钟，取出，再用PBS冲洗 干净，将涂片放入lOOmL酶底物溶液中5 10分钟，最后用PBS冲洗干净后镜检，并数500 个细胞中出现的阳性细胞数。 免疫酶检测EBV-EA细胞阳性率为4. 2% 。
实2 步骤(2)中使用度为500ng/mL巴豆油，其它步骤同实1。免疫酶检测EBV-EA细胞 阳性率为5.7%。
性率为8.1%。
实3
步骤(2)中使用度为500ng/mL TPA，其它步骤同实1。免疫酶检测EBV-EA细胞阳
免疫酶检》:
7. 6%。
9. 3%。
14. 2%
实4
步骤(2)中使用度为500ng/mL 丁酸钠+度为500ng/mL巴豆油，其它步骤同实1。
EBV-EA细胞阳性率为6. 9%。 实5
步骤(2)中培养时间为15天，其它步骤同实1。免疫酶检测EBV-EA细胞阳性率为 实6
步骤(2)中培养时间为15天，其它步骤同实2。免疫酶检测EBV-EA细胞阳性率为
实7
步骤(2)中培养时间为15天，其它步 同实3。免疫酶检测EBV-EA细胞阳性率为
实8 步骤(2)中培养时间为15天，其它步骤同实4。免疫酶检测EBV-EA细胞阳性率为 12. 7%。
权利要求
一种电磁辐射诱发Raji细胞癌变的检测方法，包括以下步骤(1)Raji细胞的培养与传代将Raji细胞在37℃、5％CO2培养箱内用RPMI-1640培养液培养并进行传代，RPMI-1640培养液含有10％小牛血清、1％青霉素、1％链霉素、1％谷胺酰胺；(2)暴露实验将Raji细胞中加入促癌剂丁酸钠、巴豆油、12-O-十四烷酰巴豆醇-13-乙酸酯或丁酸钠+巴豆油，用RPMI-1640培养液培养，将装有Raji细胞的培养板置于横电磁波传输小室中，再将该小室置于5％CO2培养箱中，同时，将Raji细胞暴露于功率密度为30～90W/m2的电磁辐射下，设定培养箱温度为36.5℃，每天辐射2小时，培养3～15天；(3)免疫酶检测将经过电磁辐射的Raji细胞离心、涂片、晾干、固定处理后，滴加鼻咽癌患者阳性血清，并在37℃培养箱中培养40分钟，取出后用磷酸盐缓冲溶液冲洗干净，晾干，加辣根过氧化物酶标记的羊抗人免疫球蛋白A进行酶标，并在37℃培养箱中培养40分钟，然后放入酶底物溶液中5～10分钟，最后用磷酸盐缓冲溶液冲洗干净后镜检。
2. 根据权利要求1的方法，其特征在于促癌剂为12-0-十四烷酰巴豆醇-13-乙酸酯。
全文摘要
本发明涉及一种电磁辐射诱发Raji细胞癌变的检测方法。该方法首先培养Raji细胞并传代，然后加入促癌剂丁酸钠、巴豆油、12-O-十四烷酰巴豆醇-13-乙酸酯或丁酸钠+巴豆油，暴露于30～90W/m2的电磁辐射下，培养3～15天，最后用免疫酶法检测EBV-EA细胞阳性率。本发明方法中的促癌剂可以提高检测的灵敏性。该方法无需特殊仪器，检测过程简单。本发明方法可以应用于工业、科学、医疗以及日常生活中电磁辐射的致癌性风险预评价，对预防电磁辐射对人体健康的远期危害具有重要价值。
文档编号G01N33/53GK101782576SQ20101012336
公开日2010年7月21日 申请日期2010年3月12日 优先权日2010年3月12日
发明者崔亚松, 曾毅, 赵丽娇, 钟儒刚 申请人:北京工业大学