专利名称：应用as-pcr检测牛白细胞粘附缺陷的方法
技术领域：
本发明属于动物分子检测技术领域，具体涉及一种在体外检测牛白细胞粘附缺陷 (BLAD)的方法。
背景技术：
白细胞粘附缺陷(Bovine LeukocyteAdhesion Deficiency，简称 BLAD)是一 种可以影响牛免疫系统的常染色体隐性遗传缺陷，于1983年在美国牛群中首次发现 (Hagemoser et al.，1983)。该遗传缺陷主要是由白细胞表面的一种叫做整合素的糖蛋白 表达缺陷所致(Gerardi et al.，1996)，因为在炎症反应时，外周血液中的中性粒细胞会发 生一系列反应，包括被趋化物质和炎性刺激物致敏、粘附到血管内皮上、穿过血管壁、在基 质中向炎症部位趋化，最终到达病原侵入的部位，对病原体直接做出反应等，而其中最为关 键的是中性粒细胞与血管内皮粘附分子相互作用而粘附到血管内皮上，这个过程必须由中 性粒细胞表面的整合素糖蛋白分子介导才能发生(Springer et al. , 1990 ；Nagahata et al.，1995)。当整合素的表达水平低于时，临床上会出现严重的感染，甚至会危及生命。 整合素分子是由α亚基(⑶11)和β亚基(⑶18)以非共价键相连构成的异源二聚体；每 个整合素分子都是由α亚单位和共同的β亚单位构成才能行使功能(Kishimoto et al.， 1987 ；Springer et al.，1990)。Shuster et al. (1992)对患有 BLAD 的荷斯坦奶牛的 CD18 编码基因进行了序列分析发现了两个点突变，其中一个突变(A 383G)引起了该糖蛋白中 位于胞外高度保守区的第128位氨基酸的改变，由天门冬氨酸变成了甘氨酸，致使白细胞 表面的整合素表达明显减少或缺乏，从而引起临床发病。在临床上，发病个体的白细胞为正 常个体的7-20倍，白细胞表面整合素表达减弱或者无表达(Nagahataet al.，1997)，BLAD 患病个体还表现为不爱运动，生长发育受阻，肝、肾变性，脾大；反复的细菌感染广泛的卡 他性支气管肺炎等，还可观察到多发性肺坏死灶，胃炎，口膜溃疡，严重的牙周炎，牙龈萎 缩，坏死性喉炎，颂下软组织膨大、轻微腹泻等(Nagahata et al. , 1995 ；Van Garderen et al.，1994)我国荷斯坦种公牛主要从美国、加拿大、德国以及澳大利亚和新西兰等国进口，包 括进口的活牛和胚胎。以前我国对该疾病没有足够的认识和重视，引入了大量潜在的BLAD 携带者，同时引入的大量没有系谱资料的荷斯坦母牛，同样是潜在的携带者。这些引进的种 公牛在我国的大量使用，使得我国的DUMPS携带者数目增加，由于没有自主产权的检测技 术，因而无法公布母牛的检测结果，很难根据系谱推断DUMPS的传播途径。我国针对遗传性 疾病展开的工作刚刚起步，在奶牛实际育种中开展的工作还不多，并且仅局限在实验室中 (李艳华等，2008)，我们应该在生产实践中及时检测出冷冻精液及母牛中DUMPS的携带者 并予以淘汰，以减少经济效益的损失。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，寻找一种简便有效的在体外检测牛
3白细胞粘附缺陷的方法。实现本发明的技术路线如下所示本发明建立了一种快速、准确检测牛白细胞粘附缺陷的AS-PCR方法，其具体步骤 如下(1)引物设计根据GenBank提供的牛CD18序列(登录号281877)，并根据 AS-PCR的特性，利用生物学引物设计软件Premier 5，设计了 AS-PCR扩增引物。该引物由 上海生工生物工程技术服务有限公司合成。该引物序列详见具体实施方式
中的实施例1所
7J\ ο(2)等位基因特异性PCR(AS-PCR)提取牛血样基因组DNA，根据PCR扩增可直接 判断结果。若扩增的目的片段为818bp (见SEQ ID NO :2)，则为健康个体；若扩增出的目的 片段为818bp和500bp (见序列表SEQ ID NO 2和3)，则为杂合子，即BLAD疾病携带者；若 个体扩增出的目的片段为500bp (见SEQ ID NO :3)，则为致病纯合子。与现有技术相比，本发明的积极效果是提供了一种快速准确筛选分型BLAD的方法和特异性引物，直接应用于牛开展 BLAD的致病基因筛选，以利于BLAD患病个体的早期淘汰。AS-PCR技术与酶切技术相比不 需要内切酶，且省去了酶切反应过程，具有简便、成本低、适用大规模检测、可检测所有SNP 等优势；AS-PCR技术对引物设计要求引物的3’末端需要刚好落在突变碱基上，又不能影响 PCR扩增，因此引物设计和AS-PCR反应条件就尤为重要。为了提高引物的特异性，可以在 3’端的第三位或者第四位引入一个错配；传统的单管AS-PCR技术是将两对引物放入同一 体系进行扩增，引物之间可能存在竞争，导致某一片段占优势而使其他片段的扩增变弱，影 响结果的判断，并且在摸索条件时，要考虑4个引物的浓度比、各引物的退火温度等因素的 影响。而本发明建立的两步AS-PCR技术是将两引物分开扩，建立两个PCR反应体系对同一 份DNA样本进行扩增，然后取等量扩增产物混合点样进行检测即可判断基因型，大大减小 了 AS-PCR反应条件摸索的难度。
序列表SEQ ID NO :1是本发明扩增的目的片段总序列(包括500bp和818bp目的 片段)。其中，1-19位碱基为序列表SEQ ID 4是扩增牛白细胞粘附缺陷基因⑶18的特异 引物(即说明书实施例1步骤3中编号1的引物)，481-500位碱基为序列表SEQ ID 5是扩 增牛白细胞粘附缺陷基因CD18的特异引物(即说明书实施例1步骤3中编号2的引物)， 这一对引物扩增出的目的片段为500bp ；464-481位碱基为序列表SEQID 6是扩增牛白细 胞粘附缺陷基因CD18的特异引物(即说明书实施例1步骤3中编号3的引物)，1264-1281 位碱基为序列表SEQ ID 7是扩增牛白细胞粘附缺陷基因CD18的特异引物(即说明书实 施例1步骤3中编号4的引物)，这对引物扩增出的目的片段为818bp ；481位碱基位突变 位点。在序列表SEQ ID NO :1中，有两个引物中包括突变位点481，这是根据等位基因特异 性 PCR(allele specific polymerase chain reaction，AS-PCR 的原理所设计的，即针对 不同的等位基因设计两对平行引物，一对野生型引物PQ和一对突变型引物WM，用这两对引 物分别扩增含对应等位基因的目的片断。如图4所示引物P和M的3’末端位于等位基因
4上，P和M引物方向相反；PQ这对引物扩增含等位基因a的目的片段，丽这对引物扩增含等 位基因b的目的片段，然后根据目的片段长度和数量差异来区分不同的等位基因。AS-PCR 技术不需要限制性内切酶，只需一步PCR扩增和凝胶电泳检测即可区分不同的基因型。序列表SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3是本发明扩增的牛白细胞粘附缺陷的目的片 段，其中SEQ ID NO 2-3中包括了扩增牛白细胞粘附缺陷基因⑶18的特异引物。序列表SEQ ID :4是扩增牛白细胞粘附缺陷基因CD18的特异引物(即说明书实施 例1步骤3中编号1的引物)序列表SEQ ID 5是扩增牛自细胞粘附缺陷基因CD18的特异引物(即说明书实施 例1步骤3中编号2的引物)。序列表SEQ ID :6是扩增牛白细胞粘附缺陷基因CD18的特异引物(即说明书实施 例1步骤3中编号3的引物)。序列表SEQ ID :7是扩增牛白细胞粘附缺陷基因CD18的特异引物(即说明书实施 例1步骤3中编号4的引物)。图1 是本发明的技术流程图。图2 用血样DNA对⑶18基因进行AS-PCR扩增，琼脂糖检测电泳图。琼脂糖凝胶 浓度为2%。图中编号说明如下1，2泳道为健康牛群基因型，扩增的产物长度为818bp ；3 为隐性携带者牛群基因型，扩增的产物长度为818bp和500bp ；M为Marker (2000bp)。图3 是本发明扩增的牛白细胞粘附缺陷的目的片段，图中下划线的序列是扩增 的818bp片段和500bp片段的共用区。该基因片段开始和末尾的粗体字是引物序列。图4 是等位基因PCR原理图。
具体实施例方式下面结合实施实例并对照附图对本发明作进一步详细说明。实施例1 牛白细胞粘附缺陷(BLAD)基因型鉴定1、奶牛血样的采集及处理取奶牛血样约10mL，加入0. 5mol/L的EDTA500 μ L (使终浓度为25mmol/L)抗凝， 4°C离心(SOOOrpm) IOmin,弃上层清液，分离白细胞，加入蒸馏水，摇勻，使红细胞破裂，离心 lOmin，弃上层清液。重复两次后，在沉淀中加入IXSETl mL和10%十二烷基硫酸钠(SDS， 终浓度为0. 5% )，再缓慢加入蛋白酶K(终浓度为50 100 μ g/mL)，置于55°C水浴锅消化 8 10h，4°C冰箱中保存备用。2、从奶牛血样中提取总NDA(1)取消化后的试样，加入等体积的平衡酚(pH 8. 0)，缓慢颠倒离心管10min，4°C 离心(8000rpm) IOmin。(2)小心吸取含有DNA的上清液，移至另一离心管中，再次加入平衡酚，重复上述 操作。(3)吸取的上清液中加入等体积的平衡酚/氯仿/异戊醇(体积比为 25 24 1)，缓慢颠倒离心管 10min，4°C离心(8000rpm) lOmin。(4)吸取上清液后加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比为24 1)，缓慢颠倒离心 管 10min，4°C，8000rpm 离心 IOmin0
(5)吸取上清液，加入1/10体积3mol/L NaAC及2倍体积的无水乙醇，迅速转动离 心管，可见白色的絮状物，即总DNA，于_20°C放置30min。(6)取出冷冻后的样品，于IOOOOrpm转速离心5 8min，去掉上层乙醇，加入70% 的乙醇ImL洗涤沉淀，离心(80000rpm) 5 8min。(7)加入70%的乙醇重复洗涤一次，离心(80000rpm)5 8min。(8)弃去乙醇，在室温下挥发残留乙醇，加入适量的TE溶解DNA。(9)将DNA样稀释成一定的浓度，存放于_20°C冰箱保存备用。3、引物设计根据牛白细胞粘附缺陷基因CD18序列(登录号281877)，利用生物学引物设计软 件Premier 5，设计AS-PCR扩增引物。该引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
引物序列如下
突变型(扩增的产物长度为500bp)
引物 1 (正向引物)5' AAGATGACGAGGAGCAGAA 3‘
示)， 引物 2 (反向引物)5 ‘ GTCCATCAGGTAGTACAGGC 3 ‘ 示)；野生型(扩增的产物长度为818bp)引物 3 (正向引物)5' CAAGGGCTACCCCATCGA 3 ‘ 示)，引物 4 (反向引物)5' CAGGACTGCGTGGCTAAA 3 ‘
(见序列表SEQ ID NO 4所
(见序列表SEQ ID NO 5所
(见序列表SEQ ID N0:6所
(见序列表SEQ ID N0:7所
示)°4、AS-PCR 扩增PCR反应总体积为20 μ L (见表1)。扩增程序是94°C预热IOmin — 94°C变性 45s — 65°C 45s — 72延伸45s (从第二步94°C变性到第四步72延伸进行35个循环)，72°C 延伸 IOmin — 15°C IOmin0表IPCR反应体系
反应体系
体积
10倍缓冲液 25mM Mg2+ IOuM引物1、引物3 IOuM引物2、引物4 Tag酶(5υ/μ1) IOmMdNTP 1F/1R与2FAR扩增出的PCR产物，分别取3μ L混合，2%琼脂糖凝胶电泳(100V， 电泳20min)，溴化乙锭(EB)染色后，在凝胶成像系统观察条带。5、BLAD基因型结果判定牛白细胞粘附缺陷(BLAD)基因型鉴定结果如图2所示，在基因⑶18的AS-PCR产 物电泳图谱中，若个体扩增出的目的片段为500bp，则为致病纯合子；若扩增出的目的片段 为818bp和500bp，则为杂合子，即BLAD疾病携带者；若扩增的目的片段为818bp，则为健康 个体。参考文献1. Hagemoser W A. Roth J A, Lofstedt J, et al. Granulocytopathy in a Holstein heifer. J Am V etM ed A ssoc, 1983，183 1093 10942. Gerardi A S. Bovine leukocyte adhesion deficiency -.a review of a modern disease and its imp licat ions. Res V et Sci, 1996,61 :183 186.3. Springer TA. Adhesion receptors of the immune system. Nature,1990, 346(4) 425 434.4. Nagahata H, Taniyama H, Izum isaw a Y, et al. Radiographic and immunohistochemical anylysis of leukocyte adhesion deficiency in Holsteins heifers. Can J V et Res,1995，59 :316 318.5. Kishimoto, Τ. K. , Hollander, N. , Roberts, Τ. Μ. , Anderson, D. C. &Springer, Τ. Α. Heterogeneous mutations in the beta subunit common to the LFA-I, Mac-I, and pl50,95glycoproteins cause leukocyte adhesion deficiency. Cell, 1987, 50 :193-202.6. Shuster D E, KehriliM E Jr, Ackermann M R, et al. Ident ificat ion and prevalence of a genetic defect that causes leukocyte adhesion deficiency in Hostein cattle. Proc Natl Acad Sci,1992,89 9225 ~ 9229.7. Nagahata H, Saw ada C, H iguch i H, et al. Fcreceptor-mediated phagocytosis, superoxide production and calcium signaling of beta2 integrin-deficient bovine neut rophils. Microbiol Immunol,1997,41 747 ~ 750.8. Van Garderen E,muller K E,ffent ink G H,et al. Post-mortem findings in calves suffering from bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD). V et Q,1994, 16 24 26.9.李艳华，张胜利，刘振君等.中国荷斯坦牛脊椎畸形综合征的研究现状与展 望·中国奶牛，2008，(6) =27-29.
权利要求
应用AS PCR在体外检测牛白细胞粘附缺陷的方法，其步骤如下1)设计特异性引物对，该引物对的DNA序列如下所示基因CD18的扩增引物突变型扩增产物长度为500bp，引物1，正向引物5′AAGATGACGAGGAGCAGAA 3′，引物2，反向引物5′GTCCATCAGGTAGTACAGGC 3′；野生型扩增产物长度为818bp；引物35′CAAGGGCTACCCCATCGA 3′，引物45′CAGGACTGCGTGGCTAAA 3′；2)PCR过程如下将同一份DNA样本使用2个20μL体系进行扩增20μL体系包括10×Buffer2.0μL，25mMMg2+1.5μL，10μM用于AS PCR反应的引物各0.5μL，10mMdNTP0.4μL，5U/μLTaq酶0.4μL，500ng/μLDNA1.0μLddH2O13.7μL，混匀、瞬时离心；PCR反应条件94℃预热10min，94℃变性45s，65℃45s，72℃延伸45s，从第二步94℃变性到第四步72延伸进行35个循环，72℃延伸10min，15℃10min。然后各取3μLPCR产物混合点样，1.5％琼脂糖凝胶电泳检，并记录结果。
2.权利要求1所述的引物对在AS-PCR在体外检测牛白细胞粘附缺陷中的应用。
全文摘要
本发明属于家畜分子检测技术领域，具体涉及应用AS-PCR方法在体外检测牛白细胞粘附缺陷的方法。制备了一种用于牛粘附缺陷检测方法的特异性PCR引物，它包括CD18基因扩增引物突变型扩增产物长度为500bp；引物15’AAGATGACGAGGAGCAGAA 3’，引物25’GTCCATCAGGTAGTACAGGC 3’；野生型扩增产物长度为818bp；引物35’CAAGGGCTACCCCATCGA 3’，引物45’CAGGACTGCGTGGCTAAA 3’。本发明制备的牛白细胞粘附缺陷的方法的特异性引物，可直接应用于在体外开展牛粘附缺陷的致病基因的筛选，以利于对牛粘附缺陷个体进行早期淘汰。
文档编号C12Q1/68GK101899511SQ20101022560
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日
发明者刘耘, 张淑君, 张滢寅, 李翔, 杨利国, 梁爱心, 江一波, 滑国华, 熊家军, 王成, 贾启涛 申请人:华中农业大学