专利名称：筛查荷斯坦奶牛blad携带者的方法及其专用引物与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用PCR-RFLP技术筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的方法及其专用引物与试剂盒。
背景技术：
牛白细胞粘附缺陷病(Bovine leukocyte adhesion deficiency，BLAD)是荷斯坦奶牛的一种常染色体上由单基因控制的隐性遗传疾病，是由编码嗜中性粒细胞表面糖蛋白的CD18基因的一个点突变引起的(Shuster D.E.，Bosworth B.T.，Kehrli M.E.Jr.Sequence of the bovine CD18-encoding cDNAcomparison with the human andmurine glycoproteins.Gene.1992，114(2)267-271.)。CD18基因已经被定位在1号染色体上。Shuster等对1头患BLAD的荷斯坦牛的CD18基因cDNA序列进行了分析，结果发现，自5’端第383位碱基由A突变为G，该突变是错义突变，导致128位的天门冬氨酸突变为甘氨酸(D128G)，致使白细胞表面的β2整合素表达明显减少或缺乏而引起临床发病。BLAD的生理基础是白细胞粘附及相关功能(包括吞噬和趋化作用)的缺陷。BLAD多发生于1-14月龄的荷斯坦奶牛，当隐性突变CD18基因纯合时奶牛表现为发病，当隐性突变基因杂合时奶牛表现为正常，但该牛是BLAD的携带者。
BLAD患病牛以重复性感染为典型临床症状，主要表现为食欲下降，鼻镜肿胀，有脱斑，颌下淋巴结肿大，体重明显下降。BLAD患病牛常发生口腔粘膜、牙龈和舌粘膜溃疡，牙龈萎缩等症状，病程长者还会发生前臼齿脱落，粘膜和肠道等软组织发生重复性感染和泛发性淋巴样增生。患病牛还易感染肺炎，需要频繁或长期使用抗生素治疗才能维持生存(Ackermann M.R.，Kehrli M.E..Jr.and Morfitt D.C.Ventraldermatitis and vasculitis in a calf with bovine leukocyte adhesion deficiency.J.Am.Vet.Med.Assoc.1993，202413-415.)。雄性犊牛还会出现阴囊血肿，5天后复发，持续注射抗生素10天才可以暂时恢复(Andrews A.H.，FishwicK J.and WatersR.J.Bovine leukocyte adhesion deficirncy(BLAD)in a one year and HolsteinFriesian bull-the first report in the united kingdom.Br.Vet.J.1996，152347-351.)。BLAD患牛出生后，生长发育极差，其中绝大多数将会在1年内死亡，只有极少数能存活2年左右，而且这些患病牛不具繁殖和哺育能力，因而给奶牛业造成了巨大的经济损失。
经系谱分析发现，已报道的BLAD患病牛犊都来自一个共同的祖先OsborndaleIvanhoe(生于1952年)(Kehrli M.E.Jr.，Schimalistieg F.C.，Anderson D.C.，VanDer Maaten M.J.，Hughes B.J.，Ackermann M.R.，Wilhelmsen C.L.，Brown G.B.，Stevens M.G.and Whetstone C.A.Molecular definition of the bovinegranulocytopathy syndromeidentification of deficiency of the Mac-1(CD11b/CD18)glycoprotein.Am.J.Vet.Res.1990，511826-1836.)，这头荷斯坦牛的生产性能记录十分优秀，在人工授精体系中使用频率极高，而且OsborndaleIvanhoe，Pennstate Ivanhoe Star，Carlin-M Ivanhoe Bell三者之间是祖父、父亲和儿子的关系，它们都是BLAD携带者，这三头优秀种公牛的使用频率都很高，因此对荷斯坦牛群做大规模的BLAD普查是极其必要的。目前还没有在其它品种牛中发现该病的报道。
1990年，Kehrli et al经研究发现，该病是由一种与白细胞粘附有关的细胞表面糖蛋白—整合素(CD11/CD18)表达缺陷所(Kehrli M.E.Jr.，Schimalistieg F.C.，Anderson D.C.，Van Der Maaten M.J.，Hughes B.J.，Ackermann M.R.，WilhelmsenC.L.，Brown G.B.，Stevens M.G.and Whetstone C.A.Molecular definition of thebovine granulocytopathy syndromeidentification of deficiency of the Mac-1(CD11b/CD18)glycoprotein.Am.J.Vet.Res.1990，511826-1836.)。整合素β2亚单位为CD18，分子质量为95kDa。CD18可分别与CD11a～CD11d(αL、αM、αX、αD)组成不同的整合素二聚体LFA-1(Lymphocyte Function-associated antigen-1，αLβ2，CD11a/CD18)、Mac-1(αMβ2，CD11b/CD18)、p150，95(αXβ2，CD11c/CD18)和αDβ2(CD11d/CD18)。这些蛋白都是由其中的一种α亚单位(CD11)和共同的β亚单位构成的。CD18表达于所有的白细胞中。CD18胞浆区可与多种细胞骨架相互作用。整合素在中性粒细胞上起作用需要Ca2+离子以细胞第二信使的形式参与。当用化学物质刺激时，BLAD牛中性粒细胞内的Ca2+浓度会发生异常变化。如Nagahata et al用酵母聚糖和伴刀豆球蛋白刺激白细胞时，会使健康嗜中性粒细胞内Ca2+浓度增高，有短暂增高阶段和稳定增高阶段，而BLAD牛中性粒细胞内的Ca2+浓度只有短暂增高阶段，缺乏稳定增高阶段(Nagahata H.，Higuchi H.，Noda H.and Tamoto K.Adhesiveness for extracellular matricex and Lysosomal Enzyme release fromnormal andβ2 integrin-deficient bovine neutrophils.J.Vet.Med.Sci.1996，40(10)783-786.)。正常的暂短增高阶段是细胞受到刺激时，细胞内储存的Ca2+释放所致，稳定增高阶段是由Mac-1(CD11b/CD18)与iC3b结合，激活Ca2+进入胞内信号传导途径产生的，进而胞外的Ca2+进入胞内。由于BLAD牛的中性粒细胞的CD18功能发生变异，使Ca2+进入胞内信号传导途径被削弱而缺乏稳定增高阶段。1992年，Shusteret al对患有BLAD的荷斯坦牛的CD18基因cDNA序列进行了克隆测序，并将其与人类和大鼠的CD18序列进行了序列比对，结果发现，BLAD牛的CD18基因第383位的碱基发生点突变，腺嘌呤被鸟嘌呤所取代(A383G)，从而导致胞外的高度保守区糖蛋白128位天门冬氨酸被甘氨酸所取代(D128G)，致使白细胞表面的整合素表达明显减少或缺乏，引起临床发病。
但是，仅仅根据系谱分析无法准确定位奶牛个体是否为BLAD携带者，而只是群体水平上的推断，只有将系谱分析与分子检测相结合才能够彻底排除BLAD可疑携带者。为准确诊断患病牛(BLAD)和携带者(BL)，减少其为奶牛育种造成的经济损失，有必要建立一种快速、准确、有效地筛查BLAD携带者的方法。
限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)是最早发展起来的分子标记技术。RFLP是指用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，产生大小不同的DNA片段，通过电泳和Southern印迹转移到支持膜上，利用克隆或已标记的序列(探针)进行分子杂交，从而显示与探针同源顺序的酶切片段在长度上的差异。RFLP标记有如下特点(1)它是一种共显性标记，对基因型直接分型，能够提供单个位点上较完整的信息；(2)无表型效应，不受基因与环境互作的影响；(3)稳定性及重复性好。但早期的RFLP技术信息含量低、操作过程复杂，而且一般需要放射性同位素来检查，因而此技术受到了限制。
PCR技术产生之后，新的PCR-RFLP技术应运而生。它是将PCR技术与RFLP分析联合应用，快速检测DNA多态性和变异的方法。PCR-RFLP方法先采用PCR技术，再将致病基因的扩增产物经限制性内切酶消化后，产生与正常基因的扩增片段长度不同的片段，通过电泳区分基因型，可以提示这种差异，据此判断是否存在致病基因。
PCR-RFLP的优点在于克服了标准RFLP分析需要大量DNA的缺陷，可对微量的DNA样品进行研究，而且经PCR扩增的产物经限制性内切酶消化后，可直接用EB染色法检测，快速简便，唯一的缺点是需要事先选择并设计扩增序列的引物。对于扩增片段比较长，只有一个或不超过2个切点的片段可以使用这种方法。PCR-RFLP技术在遗传病检测中应用较为广泛，例如陈等等人曾用PCR-RFLP方法分析了中国汉族人群中多发性痴呆病患者和正常人群的载脂蛋白基因态性分布的差异(陈等，张俊武，张振馨，赵华路，李晓青，吴亚宁，屈秋明.载脂蛋白E基因多态性与阿尔茨海默病.遗传学报.2003，30(12)1167-1170)。
发明内容
本发明的目的是提供一对利用CD18基因的限制性酶切片段长度多态性(RFLP)筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者方法及其专用引物。
本发明所提供的用于筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对。
将由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对命名为F/R，序列表中的序列1由18个碱基组成，序列表中的序列2由19个碱基组成。
本发明的第二个目的是提供一种筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的方法。本发明所提供的筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的方法，是以待测牛的基因组DNA为模板，在由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，回收PCR扩增片段，然后对其用限制性内切酶Taq I进行酶切，对酶切片段进行检测，经酶切获得大小为193bp和131bp DNA片段的待测牛为正常牛，经酶切获得大小为324bp、193bp和131bp DNA片段的待测牛为BLAD携带者，经酶切获得大小为324bp DNA片段的待测牛为BLAD病牛。
在上述筛查方法中，所述待测牛的基因组DNA的来源是广泛的，可以从血液(新鲜或冷冻)、精液(新鲜或冷冻)、组织样品(如耳组织等)或含有毛囊的牛毛样品等中提取。
其中，以25μl总体积为例，PCR扩增的反应体系包括模板DNA(100ng/μl)1μl，上、下游引物(25pmol/L)各0.5μl，10×PCR扩增缓冲液2.5μl，4种dNTP混合物(dNTPs，2.5mmol/L)0.5μl，Taq DNA聚合酶(2.5U/uL)0.5μl，用重蒸水补充反应体系至25μl。10×PCR扩增缓冲液的组成是Tris·HCl(pH8.0)100mM，KCl 500mM，MgCl220mM，0.1％明胶。PCR反应条件为先94℃5min；然后94℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；最后72℃7min，4℃保温。
以10μl总体积为例，Taq I酶切反应体系包括PCR扩增产物8.5μl，Taq I内切酶缓冲液1μl，Taq I内切酶(10U/μl)0.5μl。酶切反应条件可为在60-70℃(优选为65℃)下消化2-3小时。可用3.0-4.0％(优选为3.5％)琼脂糖凝胶电泳对酶切片段进行检测。
本发明的第三个目的是提供一种筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的试剂盒。
本发明所提供的试剂盒，包括上述用于筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的专用引物。
根据实际情况，所述试剂盒还可包括Taq DNA聚合酶、10×PCR扩增缓冲液(含Mg2+)、dNTPs、Taq I酶、Taq I内切酶缓冲液、重蒸水、50×TAE、溴化乙啶贮存液和6×凝胶加样缓冲液等中的一种或几种试剂；所述各种溶液的溶剂均为水。
本发明提供了一种筛查荷斯坦奶牛白细胞粘附缺陷病(BLAD)携带者的方法及其专用引物。该方法是根据BLAD患病牛CD18基因编码区序列第383位点的A/G突变，从而使Taq I限制性酶切位点消失的原理，建立的一种检测奶牛BLAD的PCR-RFLP方法。通过针对A383G突变位点设计的一对引物，可特异性扩增出长度为324bp的奶牛CD18基因的含有上述点突变的片段，再经限制性内切酶TaqI酶切后，正常个体可产生193bp和131bp的DNA条带，而BLAD携带者则产生193bp、131bp和324bp的DNA条带，纯合隐性个体仍为324bp。本发明的筛选方法操作简单，快捷，费用低廉，准确度高(可达100％)，并可实现自动化的直接检测。此外，可根据本方明的方法开发出相应的检测试剂盒，用于筛选健康个体，剔除BLAD携带者，该试剂盒具有使用方法简便、快速、灵敏的优点，不需要特殊的仪器，适合常规实验室检测的需要，且检测结果可靠、稳定、准确，为种牛的育种工作提供了便利。本发明将在BLAD有害基因的检测及优良种牛的分子选育中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为退火温度为60℃的PCR扩增产物的2％琼脂糖凝胶电泳检测结果图2为正常个体、BLAD携带者和BLAD患病个体的CD18基因的等位基因图谱及Taq I酶切位点示意3为116头中国荷斯坦奶牛的CD18基因324bp PCR扩增片段的PCR-RFLP分析结果图4为BLAD携带者和GenBank中的CD18基因的核苷酸序列比对结果图5为BLAD携带者的CD18基因324bp PCR扩增片段的测序结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物合成及测序工作均由上海生工生物技术服务有限公司完成。
实施例1、筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者及其专用试剂盒的制备一、用于筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的引物设计BLAD患病牛或携带者的CD18基因自5’端第1200位碱基A突变为G，Taq I限制性内切酶特异性识别T*CGA，当该位点发生突变时，序列由T*CGA变为TCGG，Taq I识别位点消失，根据此原理，参照Kriegesmann，B.发表的奶牛CD18基因的部分基因组序列(Kriegesmann B.，Jansen S.，Baumgartner B.G.and Brenig B.Partialgenomic structure of the bovine CD18 gene and the refinement of test of bovineleukocyte adhesion deficiency[J].J.Dairy.Sci.1997，802547-2549.)，采用Oligo6.0软件在其第1200位的A/G点突变位点的上下游设计了一对PCR扩增包含该引起BLAD的突变位点的核苷酸片段的引物，预期扩增片段长度为324bp，引物序列如下
F(上游引物)5’-CCTGCATCATATCCACAG-3’(序列表中序列1)R(下游引物)5’-GTTTCAGGGGAAGATGGAG-3’(序列表中序列2)新合成的引物呈固体粉末状，在溶解前先离心1分钟使其集中在离心管底，再用双蒸水稀释到25umol/L。
二、PCR反应条件的优化对PCR影响较大的因素包括退火温度、10×扩增缓冲液中的镁离子浓度和模板DNA的质量等。优化PCR反应的目的在于找到可使扩增效率最高的退火温度和镁离子浓度，并在保证扩增效率的前提下尽量降低PCR反应体系中其它成分的用量。在确定具体的退火温度和镁离子浓度时，分别对二者设定一系列梯度，最终得到最优化的组合。其中，退火温度的优化方法如下选择北京市种公牛站的荷斯坦公牛为实验材料，按照文献(陈慧勇.利用中国荷斯坦定位BTA6上影响产奶性状的QTLs[D].北京中国农业大学，2005)中第27页描述的DNA提取方法提取精液(新鲜或冷冻)的基因组DNA(基因组DNA可以从血液(新鲜或冷冻)、组织样品(如耳组织等)或含有毛囊的牛毛样品中提取)，然后以此为模板，在引物对F/R的引导下利用梯度PCR仪进行PCR扩增，25μl PCR反应体系为模板DNA(100ng/μl)1μl，上、下游引物(25pmol/L)各0.5μl，10×PCR扩增缓冲液(Tris·HCl(pH8.0)100mM，KCl 500mM，MgCl220mM，0.1％明胶)2.5μl，4种dNTP混合物(dNTPs，2.5mmol/L)0.5μl，Taq DNA聚合酶(2.5U/ul，天根生化科技(北京)有限公司)0.5μl，ddH2O 20μl；PCR反应条件初步设定为先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55±10℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃7min，4℃保温。反应结束后，对不同退火温度的PCR扩增产物各取3ul进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，其中退火温度为60℃的PCR扩增产物的2％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示(泳道1-6PCR扩增产物，泳道M100bp ladder Marker DNA分子量标准)，PCR扩增产物长度为324bp，与预期结果一致，且扩增条带单一，浓度较高，可用于PCR-RFLP检测，因此，将优化的PCR反应条件定为94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸7min。
三、用PCR-RFLP方法筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者1、PCR扩增及PCR产物的浓缩根据系谱，采集中国荷斯坦奶牛样品共116份，其中68份公牛冻精，分别来自北京奶牛中心(38头)、天津奶牛发展中心(18头)、河北省畜牧良种工作站(12头)，保存于-80℃备用；以及48份母牛血样，分别来自北郊三场、西郊一场、西郊二场、西郊四场、东郊辛卜、朝阳南场和南口二场，采集后保存于-80℃备用。提取上述公牛冻精及母牛血液的基因组DNA并以此为模板，在步骤一获得的特异性引物对F/R的引导下进行PCR扩增，PCR反应体系与实施例1相同，反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸7min。反应结束后，对PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果均得到324bp大小的条带，与预期结果相符，对PCR扩增产物进行浓缩，具体方法包括以下步骤1)将2管25μl PCR产物置于同一0.5mL离心管中；2)加入5μl NaAc(3M，pH 5.2)和2倍体积的无水乙醇；3)冰浴10分钟；4)12000rpm离心2分钟；5)弃去无水乙醇，真空抽干；6)将DNA沉淀溶于10μl灭菌水。
2、RFLP分析用TaqI对步骤1获得的PCR扩增产物进行单酶切，10μl酶切反应体系为PCR扩增产物8.5μl，Taq I内切酶缓冲液1μl，Taq I内切酶(10U/μl)0.5μl，在总反应体系中加入一滴矿物油，防止挥发。酶切反应条件为65℃消化2-3小时。酶切反应结束后，对酶切产物进行3.5％琼脂糖凝胶电泳检测，方法为取经酶切的PCR扩增产物6μl，加1μl 6×凝胶上样缓冲液(0.25溴酚蓝，0.25％二甲苯青，40％(W/V)蔗糖水溶液)，上样于3.5％琼脂糖凝胶(含EB染色液)上，同时在一点样孔中加5μl DNA 100ladder Marker作参照，恒压(8-10V/cm)电泳20-30min，在紫外透射仪上观察，用Alpha Innotech公司的凝胶成像系统照相。
根据CD18基因的PCR扩增产物长度和A/G点突变的位置，TaqI限制性内切酶消化后，结果应表现出三种基因型(带型)1)193bp，131bp(正常个体)；2)324bp，193bp，131bp(BLAD携带者)；3)324bp(BLAD患病个体)，分别命名为AA、AB和BB。正常个体、BLAD携带者和BLAD患病个体的CD18基因的等位基因图谱及Taq I酶切位点示意图如图2所示((1)为正常个体，(2)为BLAD携带者，(3)为BLAD患病个体)。对上述68头中国荷斯坦公牛和48头母牛共计116头中国荷斯坦奶牛的CD18基因PCR扩增产物的Taq I酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示(泳道M为DNA分子量标准(100bp ladder Marker)；泳道1为空白对照；泳道2为作为阳性对照的未经酶切的PCR扩增产物；泳道3-4为AB基因型(BLAD杂合子)；泳道5-7为AA基因型(正常基因纯合子)，结果只发现了AA和AB两种基因型，即显性纯合子(106头正常个体)和杂合子(10头BLAD携带者)，没有检测到隐性纯合子(BLAD患病牛)，即BB基因型。计算群体基因型频率与基因频率公式见式1，基因频率和基因型频率统计结果见表1。
基因频率p＝P+R/2q＝Q+R/2(其中，pBLADN基因频率；qBLADn基因频率；PBLADNN频率；RBLADNn频率；QBLADnn频率；N表示正常基因，n表示隐性突变基因，NN表示正常基因纯合子，Nn表示杂合子，nn表示隐性突变基因纯合子)表1 BLAD杂合子的基因型频率和BLAD基因频率
四、测序鉴定将步骤三测定的10头BLAD可疑荷斯坦奶公牛的324bp的PCR扩增产物进行测序，然后利用DNAMAN3.0软件将得到的CD18基因片段的DNA序列与NCBI公布的牛CD18基因的核苷酸序列(GenBank登录号为Y12672，该CD18基因序列为正常个体序列)进行同源性比对，结果如图4所示(上行为扩增序列，下行为NCBI公布序列，箭头所指为突变碱基)，同源性达98.33％，再用CHROMAS软件进行序列分析，结果如图4所示，发现扩增片段自5’端第193位碱基发生点突变(箭头所指碱基N)，出现双峰，从峰图颜色判断为A/G杂合子。该测序结果与步骤三的PCR-RFLP检测结果一致，说明结果准确。对所有公牛个体重复进行PCR-RFLP分析，两次实验结果完全一致，证明本发明的BLAD携带者的检测方法稳定，结果可靠，将本发明的分子检测方法与系谱分析结合，能够彻底排除BLAD可疑携带者。
五、制备筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的试剂盒本发明用于筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的试剂盒包括以下试剂(1)2.5U/ul Taq DNA聚合酶；(2)10×PCR扩增缓冲液；(3)2.5mmol/L dNTPs；(4)Taq I内切酶缓冲液；(5)10U/μl Taq I内切酶；
(6)6×凝胶上样缓冲液；(7)步骤一获得的用于筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的专用引物，25umol/L；(8)3M NaAc(pH 5.2)；(9)ddH2O。
试剂盒的规格为100次/盒，每盒中各组分的量为2.5U/ul Taq DNA聚合酶1瓶(100ul/瓶)，10×PCR扩增缓冲液1瓶(500ul/瓶)，2.5mmol/L dNTPs 1瓶(100ul/瓶)，Taq I内切酶缓冲液1瓶(200ul/瓶)，6×凝胶上样缓冲液1瓶(200ul/管)，上、下游引物各1瓶(100ul/瓶)，3M NaAc(pH 5.2)1瓶(1000ul/瓶)和ddH2O 1瓶(1000ul/瓶)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装，包装后得到用于筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的试剂盒。
序列表<160>2<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>1cctgcatcat atccacag 18<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>2gtttcagggg aagatggag 19
权利要求
1.用于筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对。
2.一种筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的方法，是以待测牛的基因组DNA为模板，在由权利要求1所述的引物对的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，回收PCR扩增片段，然后对其用限制性内切酶Taq I进行酶切，对酶切片段进行检测，经酶切获得大小为193bp和131bp DNA片段的待测牛为正常牛，经酶切获得大小为324bp、193bp和131bp DNA片段的待测牛为BLAD携带者，经酶切获得大小为324bp DNA片段的待测牛为BLAD病牛。
3.根据权利要求2所述的筛查方法，其特征在于所述25μl PCR扩增反应体系为模板DNA 1μl，上、下游引物各0.5μl，10×PCR扩增缓冲液2.5μl，4种dNTP混合物0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，用重蒸水补充反应体系至25μl。
4.根据权利要求2所述的筛查方法，其特征在于所述PCR反应条件为先94℃5min；然后94℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；最后72℃7min。
5.根据权利要求2所述的筛查方法，其特征在于所述10μl Taq I酶切反应体系为PCR扩增产物8.5μl，Taq I内切酶缓冲液1μl，Taq I内切酶0.5μl。
6.根据权利要求2所述的筛查方法，其特征在于所述酶切反应条件为在60-70℃下消化2-3小时。
7.根据权利要求2-6任一项所述的筛查方法，其特征在于所述对酶切片段进行检测的方法为3.0-4.0％琼脂糖凝胶电泳。
8.一种筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的试剂盒，包括权利要求1所述的用于筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的引物。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括Taq DNA聚合酶、10×PCR扩增缓冲液、dNTPs、Taq I酶、Taq I内切酶缓冲液、重蒸水、50×TAE、溴化乙啶贮存液和6×凝胶加样缓冲液中的一种或几种试剂；所述各种溶液的溶剂均为水。
全文摘要
本发明公开了一种筛查荷斯坦奶牛BLAD携带者的方法及其专用引物与试剂盒。该引物是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对。该筛查方法是以待测牛的基因组DNA为模板，在上述引物对的引导下进行PCR扩增，扩增结束后，回收PCR扩增片段，然后对其用限制性内切酶Taq I进行酶切，对酶切片段进行检测，经酶切获得大小为193bp和131bp DNA片段的待测牛为正常牛，经酶切获得大小为324bp、193bp和131bp DNA片段的待测牛为BLAD携带者，经酶切获得大小为324bp DNA片段的待测牛为BLAD病牛。本发明将在BLAD有害基因的检测及优良种牛的分子选育中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12Q1/68GK101041862SQ20071006526
公开日2007年9月26日 申请日期2007年4月9日 优先权日2007年4月9日
发明者张沅, 孙东晓, 孙艺 申请人:中国农业大学